一種與磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了1、一種DNA片段，為如下1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在嚴(yán)格條件下與1）限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3）與1）限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明從小麥中克隆了一個(gè)在小麥根莖葉和穗中均表達(dá)的ProTaPHT1.6啟動(dòng)子，并證明了能驅(qū)動(dòng)目的基因GUS在小麥的中表達(dá)，證明其為組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子?！緦＠f明】—種與磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及生物【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，尤其涉及一種與磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]啟動(dòng)子是基因的一個(gè)重要組成部分，在遺傳學(xué)中是指一段能使基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的脫氧核糖核酸(DNA)序列，也是基因表達(dá)調(diào)控因子中最重要的因子，它基本決定一個(gè)基因是否表達(dá)、何時(shí)表達(dá)和何處表達(dá)。按作用方式和功能，啟動(dòng)子大體可以分為組成型啟動(dòng)子、特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子三大類。組成型啟動(dòng)子的特點(diǎn)是，受其控制的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)具有持續(xù)性，但不具有時(shí)空特異性；RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量相對恒定，不受外界因素的誘導(dǎo)。例如:玉米Ubiqultin啟動(dòng)子和水稻的Actinl啟動(dòng)子。器官或組織特異性啟動(dòng)子的特征，是受其控制或調(diào)節(jié)的基因表達(dá)具有明顯的時(shí)空性，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。例如，種子特異性啟動(dòng)子、果實(shí)特異性啟動(dòng)子、葉肉細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的特征，為該類型啟動(dòng)子控制的基因在沒有誘導(dǎo)因子存在的條件下不表達(dá)或者只有非常低的表達(dá)，但一旦受到誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)，基因的表達(dá)量迅速并且大幅度增加。例如:激素誘導(dǎo)啟動(dòng)子、化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)啟動(dòng)子等。[0003]磷是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素之一，它不僅是植物細(xì)胞中ATP，核苷酸和磷脂的重要組成成份，而且在能量轉(zhuǎn)移、蛋白激活和碳氮代謝中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。土壤中絕對磷含量通常很高(>1000μM)，但磷在土壤中極易以有機(jī)和無機(jī)形式固定，因而有效磷的濃度非常低，大約在2-10μΜ，擴(kuò)散到根表面的磷更低，很難滿足植物生長發(fā)育的需要。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的許多作物為單子葉植物，因此，在單子葉植物中能夠與磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的啟動(dòng)子的克隆和利用對于農(nóng)作物的遺傳改良和分子育種具有重要的意義。【
發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的啟動(dòng)子。[0005]本發(fā)明提供了一種DNA片段，`為如下I)或2)或3)的DNA分子:[0006]I)序列表中序列I所示的DNA分子；[0007]2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；[0008]3)與I)限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。[0009]含有上述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。[0010]擴(kuò)增上述DNA片段的全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。[0011]上述引物對由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分子組成。[0012]上述DNA片段在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。[0013]上述應(yīng)用中，所述目的基因表達(dá)為組織特異表達(dá)。[0014]上述應(yīng)用中，所述組織為植物維管束、葉枕和/或穗軸。[0015]上述應(yīng)用中，所述植物維管束為植物根和/或莖維管束；[0016]所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為大麥。[0017]上述應(yīng)用中，所述目的基因?yàn)棰荢基因。[0018]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明從小麥中克隆了一個(gè)在小麥根莖葉和穗中均表達(dá)的ProTaPHTl.6啟動(dòng)子，并證明了能驅(qū)動(dòng)目的基因⑶S在小麥的中表達(dá)，證明其為組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，可在維管束、葉枕和/或穗軸中表達(dá)。【專利附圖】【附圖說明】[0019]圖1為PACH25-ProTaPHTl.6-GUS載體示意圖[0020]圖2為轉(zhuǎn)基因株系根的⑶S染色結(jié)果[0021]圖3為轉(zhuǎn)基因株系莖等部分的⑶S染色結(jié)果【具體實(shí)施方式】[0022]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。[0023]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。[0024]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。[0025]PACH25載體:公眾可以從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載在如下文獻(xiàn)中:ChristensenAH,Quail`PH,1996,Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicRes5:213-218,該載體有GUS基因，但其前面沒有啟動(dòng)子。[0026]實(shí)施例1、小麥磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ProTaPHTl.6啟動(dòng)子序列的獲得[0027]根據(jù)大麥中HvPHTl(AAN37900，AY187020，AY187025，AA072435，AAN37901，AA072436,AA072440,AM904733)和水稻中的OsPHTl(AAN39042,AAN39043,AAN39044,AAN39045,AAN39046,AAN39047,AAN39048,AAN39049,AAN39050,AAN39051,AAN39052)設(shè)計(jì)保守引物，以小麥(小麥品種小偃54)的BAC庫為模板，篩選具有擴(kuò)增目的片段的單克隆，對該BAC克隆測序后，獲得TaPHTl.6編碼區(qū)及上游序列，選取該上游序列的2047bp作為啟動(dòng)子序列進(jìn)行研究，命名為ProTaPHTl.6，其核苷酸序列為序列中的序列I。[0028]也可以人工合成序列表中的序列I。[0029]實(shí)施例2、小麥磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ProTaPHTl.6啟動(dòng)子功能分析[0030]一、重組載體的構(gòu)建[0031]1、以人工合成的序列表中的序列I作為模板，根據(jù)啟動(dòng)子ProTaPHTl.6的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，[0032]PCR引物(正向引物和反向引物中都引入PstI酶切位點(diǎn))序列如下:[0033]正向引物:5'-TGACTGCAGCTGCAGGATTTATCGTCTGG一3'；[0034]反向引物:5'-TGACTGCAGGGATCCGCCGGCGATGACGA—3'。[0035]PCR反應(yīng)體系:超純水39.5μ1、10XPCRbuffer5μI，模板2μI，濃度為10μM的正、反向引物各Iμl，Pfu酶(5u/yI)0.5μUdNTPs(IOmM)IyI。[0036]PCR反應(yīng)條件:94°C4分鐘；94°CI分鐘、56°CI分鐘、72°C3分鐘，42個(gè)循環(huán)；720C8分鐘。[0037]得到2kb左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即為ProTaPHTl.6。[0038]用QIAquick膠回收試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與pMD18_T載體(TAKARA，產(chǎn)品號(hào)D101A)在16°C下連接8小時(shí)，得到重組質(zhì)粒pMD18-ProTaPHTl.6。[0039]使用2mm電極杯，2500V將重組質(zhì)粒pMD18_ProTaPHTl.6轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(全式金，產(chǎn)品號(hào)CD201)，轉(zhuǎn)化物在含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長，挑選陽性克隆。[0040]從陽性克隆中提取質(zhì)粒，使用AbIPRISM3700DNA分析儀(Perkin-Elmer/AppliedBiosystem)進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明,pMD18_ProTaPHTl.6為將序列表的序列I自5’末端第I至2047位核苷酸所示的ProTaPHTl.6啟動(dòng)子插入pMD18_T載體中得到的載體。[0041]2、用限制性內(nèi)切酶PstI酶切pMD18_ProTaPHTl.6，回收2kb左右的小片段。[0042]3、用限制性內(nèi)切酶PstI酶切pACH25載體，回收大片段載體骨架。[0043]4、將步驟2回收的小片段與步驟3回收的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pACH25-ProTaPHTl.6(圖1)。[0044]經(jīng)過測序，重組質(zhì)粒pACH25-ProTaPHTl.6為將序列表的序列I自5’末端第I至2047位核苷酸所示的ProTaPHTl.6啟動(dòng)子插入pACH25載體中得到的載體，且插入⑶S基因的上游。`[0045]二、重組載體轉(zhuǎn)化[0046]將構(gòu)建好的小麥表達(dá)載體pACH25-ProTaPHTl.6用基因槍的方法轉(zhuǎn)入小麥隴春23(袁俊秀，楊文雄，豐產(chǎn)廣適優(yōu)質(zhì)春小麥新品種-隴春23號(hào)，麥類作物學(xué)報(bào)，2009,29(4):740。公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。)中，得到TO代轉(zhuǎn)ProTaPHTl.6小麥。[0047]提取TO代轉(zhuǎn)ProTaPHT1.6小麥葉片的基因組DNA作為模板，用正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2kb左右的片段，即為陽性TO代轉(zhuǎn)ProTaPHTl.6小麥。[0048]將上述鑒定為陽性的TO代轉(zhuǎn)ProTaPHTl.6小麥培養(yǎng)至Tl代，收獲種子。[0049]將空載體pACH25采用同樣的方法轉(zhuǎn)入小麥隴春23中，培養(yǎng)，得到Tl代轉(zhuǎn)空載體小麥。[0050]三、⑶S表達(dá)的檢測[0051]將Tl代轉(zhuǎn)ProTaPHTl.6小麥種子萌發(fā)后，得到Tl代轉(zhuǎn)ProTaPHTl.6小麥，轉(zhuǎn)入正常水培培養(yǎng)基，并且分析在不同時(shí)期對不同組織進(jìn)行⑶S染色，觀察⑶S表達(dá)情況。以Tl代轉(zhuǎn)空載體小麥為對照。[0052]根及其橫切圖如圖2所示，A為根的⑶S染色結(jié)果，B為根的橫切⑶S染色結(jié)果，可以看出，Tl代轉(zhuǎn)ProTaPHTl.6小麥根部有⑶S信號(hào)，進(jìn)一步在橫切圖中證明，主要在主根維管束中有⑶S表達(dá)。[0053]莖、秸桿和穗軸的結(jié)果如圖3所示，A為莖的橫切圖⑶S染色結(jié)果，B為葉枕⑶S染色結(jié)果，C為穗軸GUS染色結(jié)果，可以看出，在莖的維管束、葉枕和穗軸均有明顯GUS信號(hào)。[0054]總之，ProTaPHTl.6主要在根、莖維管束組織、葉枕和穗軸中表達(dá)。[0055]而Tl代轉(zhuǎn)空載體小麥，沒有檢測到任何⑶S信號(hào)。[0056]上述結(jié)果表明，ProTaPHTl.6為啟動(dòng)子，且可驅(qū)動(dòng)目的基因⑶S在根、莖等部位的維管束組織中表達(dá)?！緳?quán)利要求】1.一種DNA片段，為如下I)或2)或3)的DNA分子:1)序列表中序列I所不的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。2.含有權(quán)利要求1所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。3.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述DNA片段的全長或其任意片段的引物對。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物對，其特征在于:所述引物對由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所不的單鏈DNA分子組成。5.權(quán)利要求1所述DNA片段在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述目的基因表達(dá)為組織特異表達(dá)。7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述組織為植物維管束、葉枕和/或穗軸。8.如權(quán)利要求5-7中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物維管束為植物根和/或莖維管束；所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為大麥。9.如權(quán)利要求5-8中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述目的基因?yàn)镚US基因?！疚臋n編號(hào)】C12N15/82GK103865929SQ201410080522【公開日】2014年6月18日申請日期:2014年3月6日優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日【發(fā)明者】童依平,趙艷艷,趙學(xué)強(qiáng),何雪,馬文英申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所