一種鹿蹄草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，特別是一種鹿蹄草細(xì)胞懸浮方法，屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明鹿蹄草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法包括外植體的選擇與滅菌，愈傷組織誘導(dǎo)，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)大繁殖四個(gè)步驟。本發(fā)明可在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量鹿蹄草懸浮細(xì)胞，解決鹿蹄草資源需求問(wèn)題，具有生產(chǎn)周期短，增殖速度快的優(yōu)點(diǎn)，可用于藥用植物成分的提取和制藥工業(yè)。
【專利說(shuō)明】一種鹿蹄草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，特別是一種鹿蹄草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]鹿蹄草(Pyrolarotundifolia L)為鹿蹄草科(Pyrolaceae)鹿蹄草屬(Pyrola)植物，具有較高的藥用價(jià)值。有文獻(xiàn)報(bào)道其具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善心腦血管系統(tǒng)功能等藥效，并應(yīng)用于腸道感染、肺炎、高血壓等疾病的治療，療效顯著。目前該植物資源基本來(lái)源于野生采挖，難以大規(guī)模應(yīng)用，且對(duì)采集地生態(tài)環(huán)境及野生鹿蹄草資源造成極大損害。雖然已有研究人員對(duì)鹿蹄草的引種馴化進(jìn)行了研究與探討，但依然存在引種馴化率低，栽培條件難于控制等問(wèn)題。本發(fā)明提供一種鹿蹄草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量鹿蹄草懸浮細(xì)胞，通過(guò)生物技術(shù)手段解決鹿蹄草資源需求的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種鹿蹄草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，該方法能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量鹿蹄草懸浮細(xì)胞，可為提取鹿蹄草有效成分提供充足原料。
[0004]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0005](I)外植體的選擇與滅菌:以鹿蹄草葉片作為外植體。采集健康無(wú)病害的鹿蹄草葉片，無(wú)菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡I~3min，隨后放入0.1%~0.15%的HgC12溶液中浸泡20~40s，隨后用無(wú)菌水清洗5遍。所有操作在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
[0006](2)愈傷組織誘導(dǎo):在超凈工作臺(tái)中，將滅菌后的鹿蹄草葉片用無(wú)菌手術(shù)刀切成邊長(zhǎng)3~8mm的小葉片，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.3 ~0.7mg / L+2, 4-D0.3 ~0.7mg / L+ 蔗糖 20 ~40g / L+ 瓊脂 5 ~8g / L，PH值為5.6~6.0 ;培養(yǎng)溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強(qiáng)度1000~30001x。
[0007](3)細(xì)胞懸浮培養(yǎng):在超凈工作臺(tái)中，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織用無(wú)菌研缽碾碎分散，接種到懸浮細(xì)胞液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。懸浮細(xì)胞液體培養(yǎng)基配方為:MS+6_BA0.5~
1.0mg/L+2, 4-D0.2 ~0.5mg / L+蔗糖 20 ~40g / L，PH 值為 5.6 ~6.0 ;接種量為每IOOmL培養(yǎng)基中加入10~50g愈傷組織，培養(yǎng)溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強(qiáng)度1000~30001x，振蕩速度30~lOOrpm。培養(yǎng)10~15d，得到鹿蹄草懸浮細(xì)胞。
[0008](4)培養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)大繁殖:在無(wú)菌條件下，將步驟(3)中所得鹿蹄草懸浮細(xì)胞按照體積比1: 10~1: 15的比例接種至增殖培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.2 ~0.6mg/L+2, 4-D0.3 ~0.5mg / L+蔗糖 20 ~40g / L，PH 值為 5.6 ~6.0 ;培養(yǎng)溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強(qiáng)度1000~30001x，振蕩速度30~lOOrpm，得到大量鹿蹄草懸浮細(xì)胞。
[0009]采用本發(fā)明制備鹿蹄草懸浮細(xì)胞，生產(chǎn)周期短、增殖速度快、產(chǎn)量大、能耗少，操作便捷，利于大規(guī)模生產(chǎn)操作。【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例一:
[0011](I)外植體的選擇與滅菌:以鹿蹄草葉片作為外植體。采集健康無(wú)病害的鹿蹄草葉片，無(wú)菌水清洗2遍，在75 %乙醇中浸泡2min，隨后放入0.1 %的HgC12溶液中浸泡25s，隨后用無(wú)菌水清洗5遍。所有操作在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
[0012](2)愈傷組織誘導(dǎo):在超凈工作臺(tái)中，將滅菌后的鹿蹄草葉片用無(wú)菌手術(shù)刀切成邊長(zhǎng)5mm的小葉片，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.4mg /L+2，4-D0.4mg/L+蔗糖30g / L+瓊脂6g / L，PH值為5.8 ;培養(yǎng)溫度為25°C，每天光照0h，即黑暗培養(yǎng)。
[0013](3)細(xì)胞懸浮培養(yǎng):在超凈工作臺(tái)中，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織用無(wú)菌研缽碾碎分散，接種到懸浮細(xì)胞液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.7mg /L+2, 4-D0.3mg / L+蔗糖30g / L，PH值為5.8 ;接種量為每IOOmL培養(yǎng)基中加入20g愈傷組織，培養(yǎng)溫度為25°C，每天光照0h，即黑暗培養(yǎng)，振蕩速度80rpm。培養(yǎng)10d，得到鹿蹄草懸浮細(xì)胞。
[0014](4)培養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)大繁殖:在無(wú)菌條件下，將步驟(3)中所得鹿蹄草懸浮細(xì)胞按照體積比1: 10的比例接種至增殖培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.3mg /L+2, 4-D0.4mg / L+蔗糖30g / L，PH值為5.8 ;培養(yǎng)溫度為25°C，每天光照0h，即黑暗培養(yǎng)，振蕩速度80rpm。培養(yǎng)15d ，3000rpm離心得鹿蹄草細(xì)胞，稱鮮重，與步驟(2)中所得愈傷組織相比，增重12倍。
[0015]實(shí)施例二:
[0016](I)外植體的選擇與滅菌:以鹿蹄草葉片作為外植體。采集健康無(wú)病害的鹿蹄草葉片，無(wú)菌水清洗2遍，在75 %乙醇中浸泡Imin，隨后放入0.15 %的HgCl2溶液中浸泡40s，隨后用無(wú)菌水清洗5遍。所有操作在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
[0017](2)愈傷組織誘導(dǎo):在超凈工作臺(tái)中，將滅菌后的鹿蹄草葉片用無(wú)菌手術(shù)刀切成邊長(zhǎng)3mm的小葉片，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.3mg /L+2，4-D0.3mg/L+蔗糖20g / L+瓊脂5g / L，PH值為5.6 ;培養(yǎng)溫度為20°C，每天光照16h，光照強(qiáng)度lOOOlx。(3)細(xì)胞懸浮培養(yǎng):在超凈工作臺(tái)中，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織用無(wú)菌研缽碾碎分散，接種到懸浮細(xì)胞液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.5mg /L+2, 4-D0.2mg / L+蔗糖20妙L，PH值為5.6 ;接種量為每IOOmL培養(yǎng)基中加入IOg愈傷組織，培養(yǎng)溫度為20°C，每天光照16h，光照強(qiáng)度10001X，振蕩速度30rpm。培養(yǎng)15d，得到鹿蹄草懸浮細(xì)胞。
[0018](4)培養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)大繁殖:在無(wú)菌條件下，將步驟⑶中所得鹿蹄草懸浮細(xì)胞按照體積比1: 15的比例接種至增殖培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.2mg /L+2, 4-D0.3mg / L+蔗糖20g / L，PH值為5.6 ;培養(yǎng)溫度為20°C，每天光照16h，光照強(qiáng)度ΙΟΟΟΙχ，振蕩速度30rpm。培養(yǎng)15d，3000rpm離心得鹿蹄草細(xì)胞，稱鮮重，與步驟(2)中所得愈傷組織相比，增重8倍。
[0019]實(shí)施例三:
[0020](I)外植體的選擇與滅菌:以鹿蹄草葉片作為外植體。采集健康無(wú)病害的鹿蹄草葉片，無(wú)菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡3min，隨后放入0.1%的HgC12溶液中浸泡20s，隨后用無(wú)菌水清洗5遍。所有操作在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
[0021](2)愈傷組織誘導(dǎo):在超凈工作臺(tái)中，將滅菌后的鹿蹄草葉片用無(wú)菌手術(shù)刀切成邊長(zhǎng)8mm的小葉片，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.7mg /L+2, 4-D0.7mg / L+蔗糖40g / L+瓊脂8g / L，PH值為6.0 ;培養(yǎng)溫度為30°C，每天光照16h，光照強(qiáng)度10001χ。
[0022](3)細(xì)胞懸浮培養(yǎng):在超凈工作臺(tái)中，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織用無(wú)菌研缽碾碎分散，接種到懸浮細(xì)胞液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA1.0mg /L+2, 4-D0.5mg / L+蔗糖40g / L，PH值為6.0 ;接種量為每1OOmL培養(yǎng)基中加入50g愈傷組織，培養(yǎng)溫度為30°C，每天光照16h，光照強(qiáng)度10001χ，振蕩速度lOOrpm。培養(yǎng)10d，得到鹿蹄草懸浮細(xì)胞。
[0023](4)培養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)大繁殖:在無(wú)菌條件下，將步驟(3)中所得鹿蹄草懸浮細(xì)胞按照體積比1: 12的比例接種至增殖培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.6mg /L+2, 4-D0.5mg / L+蔗糖40g/L，PH值為6.0 ;培養(yǎng)溫度為30°C，每天光照16h，光照強(qiáng)度10001χ，振蕩速度lOOrpm。培養(yǎng)15d，3000rpm離心得鹿蹄草細(xì)胞，稱鮮重，與步驟(2)中所得愈傷組織相比，增重10倍。
【權(quán)利要求】
1.一種鹿蹄草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于按照如下步驟進(jìn)行: (1)外植體的選擇與滅菌:以鹿蹄草葉片作為外植體。采集健康無(wú)病害的鹿蹄草葉片，無(wú)菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡I~3min，隨后放入0.1%~0.15%的HgC12溶液中浸泡20~40s，隨后用無(wú)菌水清洗5遍。所有操作在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。 (2)愈傷組織誘導(dǎo):在超凈工作臺(tái)中，將滅菌后的鹿蹄草葉片用無(wú)菌手術(shù)刀切成邊長(zhǎng)3~8mm的小葉片，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強(qiáng)度1000~30001x。 (3)細(xì)胞懸浮培養(yǎng):在超凈工作臺(tái)中，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織用無(wú)菌研缽碾碎分散，接種到懸浮細(xì)胞液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),接種量為每IOOmL培養(yǎng)基中加入10~50g愈傷組織，培養(yǎng)溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強(qiáng)度1000~30001x，振蕩速度30~IOOrpm0培養(yǎng)10~15d。(4)培養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)大繁殖:在無(wú)菌條件下，將步驟(3)中所得鹿蹄草懸浮細(xì)胞按照體積比1: 10~1: 15的比例接種至增殖培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強(qiáng)度1000~30001x，振蕩速度30~lOOrpm。
2.如權(quán)力要求I所述的一種鹿蹄草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)中外植體為健康無(wú)病害的鹿蹄草葉片，外植體清洗過(guò)程為無(wú)菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡I~3min，隨后放入0.1 %~0.15%的HgC12溶液中浸泡20~40s，隨后用無(wú)菌水清洗5遍。
3.如權(quán)利要求1所述的一種鹿蹄草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)中愈傷組織培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.3 ~0.7mg / L+2, 4-D0.3 ~0.7mg / L+ 蔗糖 20 ~40g / L+瓊脂5~8g / L，PH值為5.6~6.0。
4.如權(quán)利要求1所述 的一種鹿蹄草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(3)中懸浮細(xì)胞液體培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA(X 5~L Omg/L+2, 4-D0.2~(λ 5mg / L+蔗糖20~40g /L, PH 值為 5.6 ~6.0。
5.如權(quán)利要求1所述的一種鹿蹄草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(4)中增殖培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA0.2 ~0.6mg / L+2, 4-D0.3 ~0.5mg / L+ 蔗糖 20 ~40g / L，PH 值為 5.6 ~6.0。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK103789253SQ201410080698
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】高寧, 劉博 , 程玉鵬 申請(qǐng)人:高寧