維羅納氣單胞菌菌蛻、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種維羅納氣單胞菌菌蛻、其制備方法及其在疫苗制備中的用途。所述菌蛻由裂解基因E表達(dá)盒裂解維羅納氣單胞菌而形成，具有完整的外膜結(jié)構(gòu)，制備維羅納氣單胞菌菌蛻時(shí)裂解效率較高，達(dá)到99.9996%。免疫魚體時(shí)，所述菌蛻無需佐劑即能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，可保護(hù)魚體免受致病性維羅納氣單胞菌活菌株的攻擊，與滅活疫苗相比具有更高的保護(hù)性。
CGMCC No.7231
2013.01.30
【專利說明】維羅納氣單胞菌菌蛻、其制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種維羅納氣單胞菌菌蛻、其 制備方法以及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌菌蛻（bacterial ghost，BG)是革蘭氏陰性細(xì)菌被噬菌體PhiX174裂解基因 E 的產(chǎn)物裂解后形成的完整細(xì)菌空殼。噬菌體PhiX174的裂解基因 E編碼具有91個(gè)氨基酸 的疏水蛋白，它能夠在革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞膜上形成一個(gè)直徑約為40-200nm的特異性 的跨膜孔道，在滲透壓的作用下使革蘭氏陰性細(xì)菌的胞質(zhì)內(nèi)容物由孔道排出，從而形成不 含核酸、核糖體及其他組分的細(xì)菌空殼。經(jīng)電子顯微鏡觀察，該特異性的跨膜孔道并不是在 細(xì)胞膜上隨機(jī)分布，而是僅限于細(xì)胞的中央和兩端。而這種滅活過程不會引起細(xì)菌表面結(jié) 構(gòu)的任何物理化學(xué)變化，其內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)也保存良好。
[0003] 菌蛻的生產(chǎn)是通過對裂解基因 E的嚴(yán)格表達(dá)調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。PhiX174的裂解基因 E 受控于多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，如溫敏的啟動子及其調(diào)控基因 λ pL/pR-CI857系統(tǒng)，或某些化學(xué)誘 導(dǎo)性啟動子LacpO-LacI%或tol等表達(dá)系統(tǒng)，其中應(yīng)用最多的是在λ pL/pR-CI857轉(zhuǎn)錄控 制下實(shí)現(xiàn)E基因的可控表達(dá)。
[0004] 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，除大腸桿菌外，很多革蘭氏陰性細(xì)菌均能在裂解基因 E的作用 下產(chǎn)生菌脫，如：鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)，胸膜肺炎放線桿菌 (Antinobacillus pleuropneumoniae)，霍亂弧菌（Vibrio cholerae)，溶血性巴氏桿 菌（Pasteuralla haemolytica)，多殺性巴氏桿菌（Pasteuellamultocida)，幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori)，肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumonia)等。
[0005] 由于制備菌蛻的過程中無需像制備滅活疫苗那樣添加甲醛等化學(xué)物質(zhì)，也無需 高溫物理滅活，因此細(xì)胞壁在很大程度上被完整地保存下來。細(xì)菌菌蛻可以作為一種很 好的疫苗，因?yàn)槠浔Ａ袅嘶罹鸂顟B(tài)下的包膜結(jié)構(gòu)和相關(guān)的抗原蛋白，如脂多糖、肽聚糖和 菌毛等，從而能有效地被抗原呈遞細(xì)胞（APCs)吞噬、加工和呈遞。目前已知菌蛻可通過 腹腔注射、肌肉注射、鼻飼、皮下、口服等途徑免疫小鼠、兔子和豬等動物，并取得了良好的 免疫效果。KatingerA等人用胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae， APP)菌蛻制成氣霧劑來免疫豬，可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性黏膜免疫應(yīng)答，完全抵抗由該 種病原菌引起的胸膜炎，并且安全性很好（Katinger A，et al.Pigs aerogenously immunized with genetically inactivated(ghosts)or irradiated Actinobacillus pleuropneumoniae are protected against a homologousaerosol challenge despite differing in pulmonary recombicellular and antibody responses. [J]. Journal of Biotechnology, 1999, 73 (2-3) :251-260)。Hensel 等人還將福爾馬林滅活的 APP 和 APP BG 經(jīng)肌肉注射免疫豬，兩組均能對相關(guān)的臨床疾病起到完全防護(hù)作用，然而，只有菌蛻組對攜 帶者有防護(hù)作用，可以防止疾病在豬群中的傳播。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori)菌 蛻疫苗口服免疫小鼠后，在沒有使用佐劑的情況下，其中一組的10只小鼠均得到了保護(hù)， 另外一組10只小鼠中的5只得到了保護(hù)；當(dāng)菌蛻和霍亂毒素共同使用免疫時(shí)，保護(hù)率達(dá)到 了 100%。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)菌脫經(jīng)口服免疫銀鯽，菌脫組和甲醒滅活 組均產(chǎn)生了保護(hù)作用，保護(hù)率分別為78. 95%和57. 9%，顯示菌蛻疫苗比普通滅活疫苗能更 有效地激活魚體的免疫保護(hù)反應(yīng)（Hensel A，Huter V，Katinger A，et al. Intramuscular imnunization with genetically inactivated (ghosts)Actinobaci1lus pleuropneumoniae serotype9protects pigs against homologousaerosol challenge and prevents carrier state. [J]. Vaccine, 2000, 18(26):2945-2955)〇
[0006] 維羅納氣單胞菌（Aeromonas veronii)隸屬于弧菌科（Vibrionaceae veron)氣單 胞菌屬（Aeromonas)，是一類革蘭氏陰性桿菌，普遍存在于淡水、污水、淤泥及土壤中。維羅 納氣單胞菌可致水產(chǎn)動物的病害，如引起丁魚歲潰瘍病、中華鱉穿孔病、腐皮病、口咽腔潰 爛綜合癥、斑點(diǎn)叉尾鮰急性死亡、中華絨螯蟹細(xì)菌感染等疾病。
[0007] 目前，魚類病害的防治方法主要是內(nèi)服傳統(tǒng)獸用抗生素和外用化學(xué)消毒劑。抗生 素和消毒劑的長期使用和濫用，不僅會導(dǎo)致魚類病原菌產(chǎn)生越來越多的耐藥菌株，而且還 會造成魚體藥物殘留、水環(huán)境污染、影響生態(tài)環(huán)境的平衡等一系列問題。因此，作為有效解 決農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題的一個(gè)重要途徑，研制安全有效、無公害的漁用疫苗來有針對性地 預(yù)防魚類體表潰瘍病和暴發(fā)性細(xì)菌病已是迫在眉睫。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種維羅納氣單胞菌菌蛻，所述菌蛻是由裂解基因 E在維羅納氣單 胞菌中的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物使宿主細(xì)胞裂解，而形成的完整細(xì)菌空殼。
[0009] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述維羅納氣單胞菌為魚類致病性維羅納氣單胞菌 CL0901 (中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCCNo. 7231)。
[0010] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述裂解基因 E有效地連接到質(zhì)粒PBBR1MCS2中，得到 質(zhì)粒 PBBR1MCS2-E。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種制備維羅納氣單胞菌菌蛻的方法，所述方法包括以下步驟：
[0012] 1)基于質(zhì)粒PBBR1MCS2構(gòu)建含有裂解基因 E表達(dá)盒的重組質(zhì)粒PBBR1MCS2-E ;
[0013] 2)將重組質(zhì)粒PBBR1MCS2-E電轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1菌株的感受態(tài)細(xì)胞；
[0014] 2)以含重組質(zhì)粒PBBR1MCS2-E的大腸桿菌S17-1菌株轉(zhuǎn)化維羅納氣單胞菌；
[0015] 3)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒PBBR1MCS2-E的重組維羅納氣單胞菌，在42°C誘導(dǎo)裂解基 因 E的表達(dá)；和
[0016] 4)誘導(dǎo)表達(dá)后12-16小時(shí)，收集菌蛻。
[0017] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述維羅納氣單胞菌為魚類致病性維羅納氣單胞菌 CL0901。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，所述轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中， 步驟2)所使用的轉(zhuǎn)化方法為接合轉(zhuǎn)化。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種注射制劑，含有維羅納氣單胞菌菌蛻和磷酸鹽緩沖液。
[0020] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述制劑的給藥方式為腹腔注射。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，所述制劑可應(yīng)用于魚類，在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中所述魚類包括錦 鯉和鱘魚。
[0022] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述制劑的給藥劑量為4. 8-5. IX 107CFU/條魚。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種用于魚類的疫苗，含有維羅納氣單胞菌菌蛻。
[0024] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述魚類包括錦鯉和鱘魚。
[0025] 本發(fā)明所公開的裂解質(zhì)粒PBBR1MCS2-E是基于質(zhì)粒載體PBBR1MCS2構(gòu)建而成的， 本發(fā)明的方法在制備維羅納氣單胞菌菌蛻時(shí)裂解率較高，可高達(dá)99. 9996%。
[0026] 本發(fā)明所公開的維羅納氣單胞菌菌蛻，通過形態(tài)學(xué)觀察，具有典型的菌蛻特征，有 效地保留了其外膜結(jié)構(gòu)，大部分的胞內(nèi)核酸等物質(zhì)被釋放，降低了回復(fù)突變的可能性。
[0027] 本發(fā)明所公開的菌蛻制備工藝簡單易行、成本低、時(shí)間短，與傳統(tǒng)的活菌疫苗和滅 活疫苗制備相比，都具有一定的經(jīng)濟(jì)性。
[0028] 經(jīng)魚體免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)，維羅納氣單胞菌菌蛻副作用小、安全性高，可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù) 性抗體，保護(hù)魚體免受強(qiáng)劑量維羅納氣單胞菌致病株的攻擊。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1示出裂解基因 E盒的序列；
[0030] 圖2示出表達(dá)E基于的重組維羅納氣單胞菌PCR鑒定結(jié)果；
[0031] 圖3A示出維羅納氣單胞菌菌蛻的透射電鏡結(jié)果；
[0032] 圖3B示出維羅納氣單胞菌菌蛻的掃描電鏡結(jié)果；和
[0033] 圖4示出血清凝集效價(jià)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，使得本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)更為顯而易 見。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明技術(shù)方案的形式和細(xì) 節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0035] 試驗(yàn)材料
[0036] 1、菌株及質(zhì)粒
[0037] 維羅納氣單胞菌（Aeromonas veronii) CL0901株（中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，北京，保藏編號CGMCC No. 7231，2013年1月30日），為魚類致病性維羅 納氣單胞菌病原株。
[0038] 大腸桿菌E.coli S17-1株（中國普通微生物菌種保藏管理中心，北京，保藏編號 CGMCC No. 8863,2013年2月26日），為接合轉(zhuǎn)化供體菌株。
[0039] 質(zhì)粒PBBR1MCS2-E，帶有裂解基因 E表達(dá)盒。所述質(zhì)粒PBBR1MCS2-E的溫敏表達(dá)系 統(tǒng)為λ pL/pR_CI857控制系統(tǒng)。
[0040] 裂解質(zhì)粒pAcYclysis (張瑞平，et al.利用展示尿素酶B表位的大腸桿菌菌脫遞 送幽門螺桿菌核酸疫苗.生物化學(xué)生物物理進(jìn)展.2011，38(6) :536-542)。
[0041] 2、儀器和試劑
[0042] 核酸電泳儀（BI〇-RAD，PowerPac Basic)，PCR擴(kuò)增儀（BI〇-RAD，Mycycler Thermal Cycler)，分光光度計(jì)（BI0-RAD，SmartSpec PlusSpectrophotometer)，臺式高速冷凍離心 機(jī)（SIGMA, 1-15K)，臺式高速離心機(jī)（SIGMA, Microcentrifuge)，電子天平(余姚市金諾天 平儀器有限公司，TD)，電穿孔基因?qū)雰x(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，ECM630)，透射電子 顯微鏡（HITACHI，H-7650)。
[0043] 主要試劑：胰蛋白胨、酵母提取物(碧迪醫(yī)療器械有限公司），T4DNA連接酶(大 連寶生物工程有限公司），限制性內(nèi)切酶（NEB公司，北京)，小提質(zhì)粒提取試劑盒、Taq PCR MasterMix (天根生化科技(北京）有限公司），PCR產(chǎn)物純化試劑盒、PCR產(chǎn)物膠純化回收試 劑盒（Promega公司）。
[0044] 引物合成及DNA測序服務(wù)由北京六合華大基因科技股份有限公司提供。
[0045] 實(shí)施例1 :維羅納氣單胞菌菌蛻的制備、鑒定
[0046] 1. 1 質(zhì)粒 pBBRlMCS2-E 的構(gòu)建
[0047] 以大腸桿菌裂解質(zhì)粒載體pAcYclysis為模板，以Lysis+(5'_CGGGATCCTCAGCCAAA CGTCTCTTCAG)和 Lysis- (5 ' -CGGGATCCTCACTCCTTCCGCACGTAAT)為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到 裂解基因 E的表達(dá)盒(序列見圖1)。將裂解基因 E表達(dá)盒純化后，用T4DNA連接酶與經(jīng)BamH I 單酶切消化的 PBBR1MCS2 載體（參見 MichaelE. Kovach et, al. Gene, 166 (1995) 175-176) 相連接，轉(zhuǎn)化E. Coli DH5a的CaCl2感受態(tài)細(xì)胞，涂布含50yg/mL卡那霉素的LB平板，30°C 倒置培養(yǎng)一天，挑取陽性克隆測序，將測序正確的載體命名為PBBR1MCS2-E。
[0048] E. coli S17-1電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備：將大腸桿菌E. coli S17-1接種于3mL LB培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至0D6(?為0. 35-0. 4 ;將培養(yǎng)物在冰中靜置15min，然后4°C、 13000g離心lmin，小心棄去上清；加無菌純凈水洗1遍；加10%甘油（去離子水配制）清洗 2遍；用10%甘油重懸菌體，每管分裝成48 μ L。
[0049] 電轉(zhuǎn)化操作方法：將2 μ L鑒定正確的質(zhì)粒pBBRlMCS2-E與48 μ L感受態(tài)細(xì)胞混合 后，冰上放置3-5min，注入預(yù)冷的0. lcm電極杯（BI0-RAD)中，將電穿孔基因?qū)雰x調(diào)至電 壓1. 8kV、電容2. 5 μ F、電阻200 Ω進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電擊完成后，迅速加入lmL預(yù)冷的LB培養(yǎng) 基，將電擊液轉(zhuǎn)移到1. 5mL無菌Ep管中，28°C、150rpm復(fù)蘇培養(yǎng)a ;涂布于含50 μ g/mL卡 那霉素的LB平板上，28°C倒置培養(yǎng)。
[0050] 1. 2質(zhì)粒pBBRlMCS2-E接合轉(zhuǎn)化維羅納氣單胞菌CL0901株
[0051] 以含pBBRlMCS2-E的E.coli S17-1作為供體菌，以維羅納氣單胞菌CL0901作為 受體菌，將兩種菌混合，在28°C下溫育1小時(shí)，將細(xì)胞懸液稀釋后涂布于含100 μ g/mL氨芐 青霉素和50 μ g/mL卡那霉素的雙抗LB平板上，28°C倒置培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR鑒定， 結(jié)果見圖2。
[0052] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化后的重組維羅納氣單胞菌CL0901(pBBRlMCS2-E)株，1%瓊 脂糖電泳檢測，條帶大小正確，說明質(zhì)粒PBBR1MCS2-E已成功轉(zhuǎn)入維羅納氣單胞菌CL0901 株中。在圖2中，第一泳道為分子量標(biāo)記Marker III，第二、三、四泳道為重組克隆，第五泳 道為陽性對照。
[0053] 1. 3維羅納氣單胞菌菌蛻的制備及裂解效率測定
[0054] 將鑒定正確的重組維羅納氣單胞菌CL0901 (PBBR1MCS2-E)株于28°C培養(yǎng)至0D6QQ 為0. 4-0. 6左右，將培養(yǎng)物分為兩組，一組將培養(yǎng)溫度迅速升高到42°C誘導(dǎo)裂解基因E的表 達(dá)，另一組將培養(yǎng)溫度維持在28°C，繼續(xù)培養(yǎng)約12-16小時(shí)，稀釋涂平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算裂 解率。
[0055] 另一方面，將鑒定正確的重組維羅納氣單胞菌CL0901 (PBBR1MCS2-E)株在28°C擴(kuò) 大培養(yǎng)至〇D_為0. 4-0. 6左右，42°C誘導(dǎo)裂解基因 E的表達(dá)，誘導(dǎo)約12-16小時(shí)后，收集裂 解液。離心收集菌體。PBS洗滌后4°C保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)
[0056] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，重組維羅納氣單胞菌CL0901 (PBBR1MCS2-E)株的 裂解效率高達(dá)99. 9996%。
[0057] 1. 4維羅納氣單胞菌菌蛻的電鏡觀察
[0058] 取維羅納氣單胞菌CL0901株菌蛻細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次；用2. 5%戊二醛+2%多聚 甲醛（0· lmol/L二甲砷酸鈉緩沖液配制)于4°C固定2h，離心后清洗；用0· lmol/L二甲砷酸 鈉緩沖液漂洗3次；用1%鋨酸固定液室溫固定2h，蒸餾水漂洗3次；乙醇逐級脫水；環(huán)氧丙 烷置換2次，包埋劑浸透，包埋聚合；用醋酸雙氧鈾染色20min，蒸餾水沖洗干凈后晾干，檸 檬酸鉛染色5min，晾干后透射電鏡下觀察、照相（圖3A)。
[0059] 取維羅納氣單胞菌CL0901株菌蛻細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次；用2. 5%戊二醛+2%的多 聚甲醛（0· lmol/L二甲砷酸鈉緩沖液配制)于4°C固定2h ;離心有清洗；用0· lmol/L二甲砷 酸鈉緩沖液清洗3次；用吸管滴一滴于蓋玻片上，待樣品自然晾干后用1%的餓酸4°C固定 2h ;蒸餾水清洗2次；乙醇逐級脫水；醋酸異戊酯置換；六甲基二硅胺烷干燥lOmin ;離子濺 射鍍膜，噴金儀噴金200s ;掃描電鏡下觀察、照相（圖3B)。
[0060] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：絕大多數(shù)維羅納氣單胞菌被裂解為菌蛻，內(nèi)部形成可見的空腔，并能看 到溶菌孔道，直徑為200-400nm之間。菌蛻保留了完整的細(xì)菌外膜，但因?yàn)榘麅?nèi)物質(zhì)被釋 放，細(xì)菌發(fā)生明顯皺縮。
[0061] 實(shí)施例2 :維羅納氣單胞菌菌蛻的免疫效果
[0062] 將維羅納氣單胞菌菌蛻通過腹腔注射免疫錦鯉，并對菌蛻誘導(dǎo)的免疫保護(hù)進(jìn)行分 析。
[0063] 2. 1實(shí)驗(yàn)動物及方法
[0064] 健康錦鯉，體重35g，購自北京市黑莊戶漁場。在水溫為（24±1) °C的水族箱內(nèi)充 氧飼養(yǎng)。觀察7天，證實(shí)無病后，用于試驗(yàn)。
[0065] 設(shè)對照組、甲醛滅活疫苗組和菌蛻組，每組三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放27尾魚。挑 CL0901株(對照）和CL0901 (pBBRlMCS2-E)株單菌落分別接種于3mL無抗和Amp、Kan雙抗 的LB液體培養(yǎng)基中，28°C 200/min搖床過夜培養(yǎng)；次日，分別轉(zhuǎn)接于100mL無抗和Amp、Kan 雙抗的LB液體培養(yǎng)基中，28°C 200/min搖床培養(yǎng)至0D600為0. 4-0. 6時(shí)，CL0901株加入甲 醛滅活，CL0901 (PBBR1MCS2-E)株迅速升溫至42°C，誘導(dǎo)裂解基因 E的表達(dá)，誘導(dǎo)12-16h。 用無菌磷酸緩沖液PBS稀釋成7. 5X 107CFU/mL菌懸液，以制備滅活疫苗。分別在第0、2、4 周時(shí)，以0. 2mL/尾腹腔注射錦鯉進(jìn)行免疫，共免疫三次。
[0066] 2. 2全菌凝集試驗(yàn)
[0067] 分別在第1、2、3、4、5、6周進(jìn)行尾靜脈采血，分離血清，-70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0068] 在96孔U型微量血凝板上，將被測血清用無菌PBS做倍比稀釋至第8管，每孔含 稀釋血清50 μ L，然后向每孔加入50 μ L抗原（甲醛滅活的CL0901菌體濃度為107cfu/mL)， 將血清板振蕩混勻，于37°C靜置過夜。分別在2h及第二天上午進(jìn)行觀察：若微量血凝板U 型底部出現(xiàn)菌體沉積、邊緣模糊化則判定為陽性反應(yīng)；若U型底部出現(xiàn)輪廓清晰的圓形沉 積物則判定為陰性反應(yīng)。呈明顯陽性反應(yīng)的最高稀釋度為該血清的效價(jià)。
[0069] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0070] 隨著加強(qiáng)免疫次數(shù)的增加，菌蛻組的凝集效價(jià)逐漸增高；在注射免疫后第5周時(shí)， 菌蛻組全菌凝集效價(jià)出現(xiàn)峰值，最高的個(gè)體血清凝集效價(jià)高達(dá)1:2 8 ;并且，血清效價(jià)的升高 可持續(xù)一段時(shí)間，例如第三次免疫兩周后，即第6周時(shí)，血清凝集效價(jià)仍保持在1:25以上 (圖4)。與菌蛻組相比，甲醛滅活組的凝集效價(jià)明顯低，最高值出現(xiàn)在免疫后第4周，約1:2 3， 從第3周到第6周，血清凝集效價(jià)變化不大。對照組的效價(jià)基本為0。
[0071] 2. 3攻擊試驗(yàn)
[0072] 在錦鯉注射菌蛻疫苗第5周，用1. 28X 107CFU/mL維羅納氣單胞菌CL0901株菌 懸液對三個(gè)大組的錦鯉進(jìn)行背鰭基部注射攻毒，每尾注射劑量為〇. 2-0. 3mL，每組設(shè)三個(gè)重 復(fù)，每個(gè)重復(fù)15尾魚。連續(xù)觀察14天并記錄其發(fā)病及死亡情況，根據(jù)公式計(jì)算免疫保護(hù)率 (RPS)，RPS= (1-免疫組死亡數(shù)/對照組死亡數(shù)）X 100%。
[0073] 試驗(yàn)結(jié)果：菌蛻組的存活率為97. 8%，免疫保護(hù)率為75%，高于甲醛滅活組（-25%)。
[0074] 結(jié)論：菌蛻組的魚血清凝集效價(jià)可達(dá)1:25以上，甲醛滅活組的最高值僅為1:2 3,說 明菌蛻刺激魚體產(chǎn)生致病菌特異性抗體的能力顯著優(yōu)于甲醛滅活菌。不同疫苗免疫的魚在 受到致病性維羅納氣單胞菌攻擊后，免疫保護(hù)率有顯著差異，其中菌蛻組RPS最高，說明免 疫菌蛻的魚對于致病菌的攻擊具有很好的保護(hù)作用。
[0075] 本發(fā)明的維羅納氣單胞菌菌蛻也可應(yīng)用于鱘魚的維氏氣單胞菌病的預(yù)防。
【權(quán)利要求】
1. 一種維羅納氣單胞菌菌蛻，所述菌蛻是由裂解基因 E在維羅納氣單胞菌中的誘導(dǎo)表 達(dá)而形成的完整細(xì)菌空殼。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的維羅納氣單胞菌菌蛻，其特征在于，所述維羅納氣單胞菌為 保藏編號CGMCC No. 7231的維羅納氣單胞菌CL0901。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的維羅納氣單胞菌菌蛻，其特征在于，所述裂解基因 E有效地連 接到質(zhì)粒PBBR1MCS2上得到質(zhì)粒pBBRlMCS2-E。
4. 一種制備維羅納氣單胞菌菌蛻的方法，所述方法包括以下步驟： 1) 構(gòu)建有效地連接有裂解基因 E表達(dá)盒的重組質(zhì)粒PBBR1MCS2-E ; 2) 將重組質(zhì)粒PBBR1MCS2-E電轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1菌株的感受態(tài)細(xì)胞； 3) 以含重組質(zhì)粒PBBR1MCS2-E的大腸桿菌S17-1菌株轉(zhuǎn)化維羅納氣單胞菌； 4) 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒PBBR1MCS2-E的重組維羅納氣單胞菌，在42°C誘導(dǎo)裂解基因 E 的表達(dá)；和 5) 誘導(dǎo)表達(dá)后12-16小時(shí)，收集菌蛻。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述維羅納氣單胞菌為保藏編號CGMCC No. 7231的維羅納氣單胞菌CL0901。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所使用的轉(zhuǎn)化方法為接合轉(zhuǎn)化。
7. -種注射制劑，含有： 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的維羅納氣單胞菌菌蛻，或根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的 方法所獲得的維羅納氣單胞菌菌蛻，和 磷酸鹽緩沖液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制劑，其特征在于，所述制劑的給藥方式為腹腔注射。
9. 一種用于魚類的疫苗，含有權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的維羅納氣單胞菌菌蛻，或 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的方法所獲得的維羅納氣單胞菌菌蛻。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述魚類包括錦鯉和鱘魚。
【文檔編號】C12R1/01GK104232502SQ201410080745
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】姜娜, 馬志宏, 邢薇, 李鐵梁, 羅琳 申請人:北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所