一種基于J亞群禽白血病病毒gag基因保守序列的siRNA重組干擾載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種基于J亞群禽白血病病毒gag基因保守序列的siRNA重組干擾載體，該載體利用gag基因非常保守這一情況，利用該基因設(shè)計(jì)合成siRNA，構(gòu)建形成siRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步獲得退火雙鏈DNA后，將其與載體連接構(gòu)建重組干擾載體，將該干擾載體與病毒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，最終發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的這種干擾載體可有效地干擾體外細(xì)胞及活雞體內(nèi)J亞群禽白血病病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，為J亞群禽白血病的防治提供科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，降低養(yǎng)禽業(yè)因ALV-J感染造成的經(jīng)濟(jì)損失。
【專利說(shuō)明】—種基于J亞群禽白血病病毒gag基因保守序列的s i RNA重組干擾載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種基于J亞群禽白血病病毒gag基因保守序列的siRNA重組干擾載體及其制備方法和其在干擾J亞群禽白血病病毒在體外細(xì)胞及活雞體內(nèi)轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(ALV-J)引起的一種腫瘤性疾病。ALV-J是具有囊膜的反轉(zhuǎn)錄病毒，禽臨床感染主要表現(xiàn)為髓細(xì)胞瘤、免疫耐受、高死亡率和生長(zhǎng)遲緩。1997~1998年間，ALV — J呈全球性爆發(fā)，對(duì)世界肉種雞業(yè)造成了毀滅性打擊。ALV-J感染除引起髓細(xì)胞瘤外，成紅細(xì)胞瘤、血管瘤、腎瘤和肉瘤常在感染后期伴隨發(fā)生，通常死亡率為1%~5%，高峰期可達(dá)50%。研究證實(shí)，ALV-J對(duì)免疫應(yīng)答具有持久損害作用，使生產(chǎn)力低下，繼發(fā)感染和混合感染頻發(fā)，J亞群禽白血病嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。國(guó)外通過(guò)凈化控制本病的發(fā)生，由于凈化周期長(zhǎng)、成本高，在我國(guó)目前還未能有效實(shí)施，只能通過(guò)淘汰感染雞只進(jìn)行大群凈化，這種方法由于不及時(shí)不徹底而無(wú)法控制ALV-J的感染；
[0003]ALV為RNA病毒，其基因組全長(zhǎng)約7.6-7.8kb。ALV-J的前病毒基因組主要含有3個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白、RNA依賴的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)和囊膜糖蛋白。從5’端至3’端其排列順序依次為L(zhǎng)TR-leader-gag-pol-env-leader-LTR。gag基因非常保守，與A、C、D亞群比較有96%-97%的同源性，主要編碼病毒基質(zhì)蛋白MA(P19)、衣殼蛋白CA(P27)、核衣殼蛋白NA(P15)以及參與env基因轉(zhuǎn)錄后加工的蛋白酶PR(P12)，它們都是病毒群特異性抗原，所有 的ALVs都有，與亞群無(wú)關(guān)；
[0004]同時(shí)ALV - J為囊膜病毒，病毒囊膜決定了病毒的抗原性，而抗原性又不斷變動(dòng)，這成為禽白血病常規(guī)疫苗研制無(wú)法逾越的瓶頸?；诖?，研制抗J亞群禽白血病生物制劑成為目前J亞群禽白血病防控的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，特別是gag基因非常保守這一情況，利用該基因設(shè)計(jì)合成siRNA干擾載體，進(jìn)一步獲得退火雙鏈DNA后，將其與病毒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，最終發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的這種干擾載體可有效地干擾體外細(xì)胞及活雞體內(nèi)J亞群禽白血病病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，為J亞群禽白血病的防治提供科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，降低養(yǎng)禽業(yè)因ALV-J感染造成的經(jīng)濟(jì)損失。
[0006]發(fā)明人首先基于gag基因保守序列設(shè)計(jì)合成了 siRNA，堿基序列為CTGGAGCGCATCACTATTA，其基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；
[0007]該段序列與靶基因的一段序列相同，是利用siRNA在線設(shè)計(jì)軟件篩選得到；
[0008]設(shè)計(jì)可以形成siRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，并反轉(zhuǎn)錄得到ds oligo DNA,連接進(jìn)干擾載體，載體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后，可以轉(zhuǎn)錄出其中的編碼鏈，并在細(xì)胞內(nèi)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)(鏈內(nèi)斜體部分堿基互補(bǔ)，可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu))，在細(xì)胞內(nèi)酶切得到siRNA，siRNA解旋，其反義鏈與靶基因互補(bǔ)，從而與靶基因結(jié)合，使靶基因降解。其作用過(guò)程如圖1所示；
[0009] 進(jìn)而發(fā)明人利用上述方法將ds oligo DNA連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干擾載體中，最終獲得本發(fā)明所述的這種干擾載體，
[0010]其中所述的干擾載體購(gòu)自invitrogen公司；
[0011]同時(shí)發(fā)明人還公開了上述干擾載體的具體制備方法，如下:
[0012]基于gag基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成siRNA ；
[0013]其具體操作為:對(duì)ALV不同亞群及J亞群不同的毒株進(jìn)行同源性分析，其同源性最高的gag基因中較保守區(qū)域片段作為篩選siRNA的序列片段，利用siRNA在線設(shè)計(jì)軟件，得到siRNA，堿基序列為CTGGAGCGCATCACTATTA，其基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；
[0014]其中發(fā)明人所選取的毒株包括:NX0101 (ALV-J，DQl 15805)、MQNCSU(ALV-A, DQ365814)、SDAU09E3(ALV-B JF826241)、RSV-Prague(ALV-C,J02342)、RSV-Schmidt-Ruppin D (ALV-D，D I O 652)、SD O 5 O I (ALV-E，EM467236 )、HPRS103(ALV-J, Z46390)and AD0L-7501 (ALV-J, AY027920)。
[0015]設(shè)計(jì)合成含上述目的片段的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，如圖3中top strand DNA,其基因序列如序列表SEQ ID NO:2所示,和與之對(duì)應(yīng)的bottom strand DNA,其基因序列如序列表SEQ IDNO:3所示。將其退火形成雙鏈后連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干擾載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，涂LB平板(含50 μ g/ml壯觀霉素)后，37 °C孵育；
[0016]轉(zhuǎn)化平板分別挑取3個(gè)克隆，搖菌并抽提質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證重組克隆中插入片段序列是否與設(shè)計(jì)的寡聚單鏈DNA (也就是top strand DNA和與之對(duì)應(yīng)的bottomstrand DNA)序列一致；
[0017]通過(guò)常規(guī)方法的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)本發(fā)明做獲得重組載體，重組克隆中插入片段序列與設(shè)計(jì)的寡聚單鏈DNA序列一致，
[0018]進(jìn)一步發(fā)明人通過(guò)體內(nèi)和體外檢測(cè)的方式，證實(shí)該重組干擾載體可以有效地干擾體外細(xì)胞及活雞體內(nèi)J亞群禽白血病病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，一般干擾效率達(dá)到80%以上，較之現(xiàn)有的防治手法有著極大的進(jìn)步，其中所采用的體外檢測(cè)方法如下:
[0019]培養(yǎng)DF-1細(xì)胞，12h后接毒(ALV-J NX0101毒株)，待細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞豐度達(dá)到70%-80%時(shí)，將DF-1細(xì)胞傳到24孔板上；
[0020]待細(xì)胞豐度達(dá)到70%時(shí)(大約8h_12h)，進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，72h后通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)病毒基因的表達(dá)水平、間接免疫熒光檢測(cè)ALV-J活病毒囊膜蛋白的表達(dá)水平、Westernblot檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后病毒囊膜蛋白的表達(dá)水平以驗(yàn)證干擾效果，蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，經(jīng)干擾后，ALV-J蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，干擾效率達(dá)到83.8% ；
[0021 ] 同樣的，體內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè):
[0022]重組干擾質(zhì)粒與病毒同時(shí)接種6日齡雞胚，同時(shí)設(shè)ALV-J感染陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組。
[0023]雛雞出殼后，飼養(yǎng)至7周齡，全部剖殺，期間每周進(jìn)行血液學(xué)、組織病理學(xué)觀察以及病毒學(xué)檢測(cè)抗病毒效果；
[0024]結(jié)果顯示重組質(zhì)粒干擾組雞生長(zhǎng)正常，血液各類白細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化，ALV-J抗原/抗體陰性，無(wú)排毒現(xiàn)象，病理組織學(xué)檢測(cè)未見(jiàn)組織損傷及炎癥反應(yīng)。而ALV-J陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)嚴(yán)重的病毒血癥，排毒，肝臟及心臟等重要器官出現(xiàn)明顯的損傷和炎癥。實(shí)驗(yàn)證明RNA干擾重組載體可達(dá)到顯著的抗病毒效果。
[0025]綜上所述，本發(fā)明利用gag基因非常保守這一情況，利用該基因設(shè)計(jì)合成siRNA干擾載體，并將該干擾載體與病毒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，最終發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的這種干擾載體可有效地干擾體外細(xì)胞及活雞體內(nèi)J亞群禽白血病病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，為J亞群禽白血病的防治提供科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，降低養(yǎng)禽業(yè)因ALV-J感染造成的經(jīng)濟(jì)損失。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為本發(fā)明所涉及的干擾原理圖；[0027]圖2為本發(fā)明所涉及的干擾載體圖譜；
[0028]圖3為本發(fā)明所設(shè)計(jì)的top strand DNA和bottom strand DNA的不意圖；圖中可見(jiàn)top strand中的斜體字體所示序列與靶基因上的一段序列相同，另一端斜體字體序列與其互補(bǔ)，bottom strand中與其設(shè)計(jì)思路相同；
[0029]圖4為本發(fā)明構(gòu)建載體質(zhì)粒電泳結(jié)果示意圖，
[0030]其中電泳圖左側(cè)為DNA marker，右側(cè)為質(zhì)粒條帶；由于質(zhì)粒存在的螺旋結(jié)構(gòu)不同，電泳時(shí)會(huì)形成多條條帶，從上到下依次為松弛開環(huán)的OC構(gòu)型、松弛線性的L構(gòu)型(5700bp)和超螺旋的SC構(gòu)型；
[0031]圖5為本發(fā)明所得干擾載體病毒熒光的干擾效果圖，
[0032]圖中p-s1-gag 為干擾組、Nul 1-vector control 為空載體對(duì)照組、ALV-J infectedcontrol為病毒感染未干擾對(duì)照組、normal cells control為正常細(xì)胞未接毒未干擾對(duì)照組圖中干擾組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，熒光細(xì)胞數(shù)大大減少，證明本實(shí)驗(yàn)所用的干擾質(zhì)粒有較好的干擾效果；
[0033]圖6為本發(fā)明RT-PCR檢測(cè)病毒表達(dá)的相對(duì)定量比較結(jié)果，
[0034]圖可知干擾組與的陽(yáng)性對(duì)照相對(duì)比，其病毒基因的表達(dá)水平顯著降低。
【具體實(shí)施方式】
[0035]以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)，所采用的試劑也均為現(xiàn)有試劑；
[0036]實(shí)施例1雙鏈DNA的制備
[0037]靶向gag基因保守區(qū)域，起始位點(diǎn)為2447，設(shè)計(jì)合成siRNA，其堿基序列為CTGGAGCGCATCACTATTA，其基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；設(shè)計(jì)合成含上述目的片段的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，其中top strand DNA，其基因序列如序列表SEQ ID NO:2所示；和與之對(duì)應(yīng)的bottom strand DNA其基因序列如序列表SEQ ID NO:3所不；用ddH20溶解成100 μ M,互補(bǔ)單鏈各取5-10 μ I兩兩混合，按表一給出體系進(jìn)行退火。將混合物在95°C加熱5~10分鐘，然后放置室溫20分鐘，形成雙鏈DNA。
[0038]表一、oligoDNA 退火體系[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種基于J亞群禽白血病病毒gag基因保守序列的SiRNA重組干擾載體，其特征在于:該載體是利用所設(shè)計(jì)的siRNA，構(gòu)建其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，退火后將形成的雙鏈DNA連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干擾載體中獲得的，其中siRNA其基因序列如序列表SEQ ID NO:I所示。
2.權(quán)利要求1所述的重組干擾載體的制備方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)基于gag基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成siRNA;其具體操作為:對(duì)ALV不同亞群及J亞群不同的毒株進(jìn)行同源性分析，其同源性最高的gag基因中較保守區(qū)域片段作為篩選siRNA的序列片段，利用siRNA在線設(shè)計(jì)軟件，得到siRNA，堿基序列為CTGGAGCGCATCACTATTA，其基因序列如序列表SEQ I D NO: I所不； (2)設(shè)計(jì)合成含上述目的片段的發(fā)卡結(jié)構(gòu),其中topstrand DNA,其基因序列如序列表SEQ ID NO:2所示，bottom strand DNA，其基因序列如序列表SEQ ID NO:3所示，將其退火形成雙鏈后連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干擾載體中即得。
3.如權(quán)利要求1所述載體在干擾J亞群禽白血病病毒在體外細(xì)胞及活雞體內(nèi)轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103966259SQ201410082855
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】成子強(qiáng), 魏戎蓉 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)