一種同時(shí)檢測(cè)甲型、乙型及丙型流感病毒的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)檢測(cè)甲型、乙型及丙型流感病毒的含內(nèi)質(zhì)控的多重?zé)晒釸T-PCR方法及試劑盒。本發(fā)明針對(duì)甲型、乙型及丙型流感病毒代表株的M基因、NS基因及NP基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了含內(nèi)質(zhì)控的一步法多重?zé)晒釸T-PCR快速檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便快捷，克服了常規(guī)單重?zé)晒釸T-PCR單孔單檢的繁瑣，簡(jiǎn)化了操作程序，節(jié)省了試驗(yàn)成本，利用其較高的特異性、靈敏度、高效性和穩(wěn)定性為病毒的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、水和食品的衛(wèi)生評(píng)價(jià)、臨床診斷等方面提供了有力的技術(shù)支撐。
【專利說(shuō)明】—種同時(shí)檢測(cè)甲型、乙型及丙型流感病毒的方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是用于甲型、乙型及丙型流感病毒的同時(shí)檢測(cè)與鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002]甲、乙、丙型流感病毒是引起人類流感的主要病原體成員，屬于正粘病毒科，為單股負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒，其基因組由8個(gè)片段組成(丙型流感病毒由7個(gè)片段組成)，甲型流感病毒對(duì)多種禽類和哺乳動(dòng)物也具有高度傳染性，也可引起每年季節(jié)性流行和反復(fù)的大流行，對(duì)全世界經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生都造成了嚴(yán)重的危害。
[0003]甲型流感病毒的8個(gè)基因組至少編碼10種蛋白，包括兩種表面糖蛋白(HA和NA)，六種內(nèi)部蛋白(NP，PB1，PB2，PA，M1和M2)和兩種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl和NS2)。根據(jù)HA和NA抗原性不同，甲型流感病毒可分為16個(gè)HA亞型(Hl~H16)和9個(gè)NA亞型(NI~N9)。目前16個(gè)HA亞型均可感染禽類，而感染人的流感目前只發(fā)現(xiàn)H1、H2、H3、H5、H7及H9亞型。Hl和H3兩種亞型在人群中一直存在，與乙型流感病毒一起構(gòu)成了季節(jié)性流感的主要病原。乙型流感病毒根據(jù)其抗原性和基因特性的不同分為兩大譜系，即Yamagata系和Victoria系。丙型流感病毒在 遺傳學(xué)上比甲型和乙型流感病毒較為穩(wěn)定，但人群中血清抗體仍一直存在。所以，加強(qiáng)甲、乙、丙型流感病毒的檢測(cè)尤為重要。
[0004]目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)流感病毒的經(jīng)典方法是病毒的分離培養(yǎng)，但是其操作煩瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；電鏡、免疫組化、ELISA、常規(guī)PCR等具有各自突出的優(yōu)點(diǎn)，但都很難檢測(cè)微量核酸和準(zhǔn)確定量，20世紀(jì)末發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time fluorescentquantitative PCR)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定性和定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)驗(yàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性、具有實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。因而，在呼吸道病原體檢測(cè)中具有巨大應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。相對(duì)普通PCR及單熒光PCR，多重?zé)晒釶CR具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)檢測(cè)效率高，即多重?zé)晒釶CR可以實(shí)現(xiàn)一管多檢，通過(guò)收集的不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)來(lái)區(qū)分不同的檢測(cè)對(duì)象，從而簡(jiǎn)化操作流程；(2)節(jié)省試劑成本和人員操作時(shí)間，尤其在開展大量樣品檢測(cè)時(shí)，可以顯著地降低檢測(cè)成本和操作時(shí)間。(3)本方法中含內(nèi)質(zhì)控基因的監(jiān)控，在各類標(biāo)本中，存在各種影響或抑制PCR反應(yīng)的因素，且在標(biāo)本的采集處理、核酸提取、擴(kuò)增和分析過(guò)程中，也可能因人為操作失誤而導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性檢測(cè)結(jié)果。因此本申請(qǐng)采用內(nèi)質(zhì)控的方法，在標(biāo)本中含有的內(nèi)質(zhì)控基因(LDHA)經(jīng)歷檢測(cè)標(biāo)本核酸提取、加樣、PCR擴(kuò)增及信號(hào)檢測(cè)的全過(guò)程，從而可對(duì)每一份標(biāo)本實(shí)施監(jiān)控。
[0005]本發(fā)明成功建立的可同時(shí)檢測(cè)甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重?zé)晒釸T-PCR方法，采用LDHA作為內(nèi)質(zhì)控，可以有效監(jiān)控樣本中的PCR抑制因素以及由操作誤差所造成的假陰性結(jié)果。并且該方法除了具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)效率高及穩(wěn)定性的特點(diǎn)之外，其檢測(cè)所需要RNA量較少，且操作簡(jiǎn)便快速，在病毒的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、衛(wèi)生評(píng)價(jià)、臨床診斷等方面顯示出良好的應(yīng)用前景。并有利于進(jìn)一步深入研究相關(guān)病原體感染的分子機(jī)理和免疫調(diào)節(jié)機(jī)理、開展有效的臨床治療等方面顯示出良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明是由國(guó)家“十二五”科技重大專項(xiàng)2012ZX10004215-003-001支持的。我們成功設(shè)計(jì)和合成了針對(duì)甲型、乙型及丙型流感病毒相應(yīng)M基因、NS基因及NP基因特異性引物和探針?；诖艘锖吞结?，我們建立了一步法含內(nèi)質(zhì)控的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法。該方法通過(guò)對(duì)多種相關(guān)病毒的檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建、與商品化單重?zé)晒釸T-PCR診斷試劑盒比較、穩(wěn)定性試驗(yàn)等，說(shuō)明該方法具有較高的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性和高效性。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種針對(duì)甲型、乙型及丙型流感病毒M基因、NS基因及NP基因的特異性引物和探針序列，如SEQ NO:1至12所示。
[0008]在本發(fā)明的第二方面，提供一種同時(shí)檢測(cè)甲型、乙型及丙型流感病毒的試劑盒，該試劑盒中含有第一方面所述引物和探針。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括以下成份:
[0010]a)反應(yīng)緩沖液,所述緩沖液為常規(guī)PCR反應(yīng)緩沖液；
[0011]b)反應(yīng)酶，所述反應(yīng)酶為常規(guī)PCR反應(yīng)酶；
[0012]c) SEQ NO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物；
[0013]d)SEQN0:3、6、9、12 所示的探針 [0014]e)無(wú)RNA酶的水。
[0015]其特征在于甲型流感病毒的M基因探針5’端由FAM標(biāo)記，3’端由BHQl標(biāo)記；乙型流感病毒的NS基因探針5’端由JOE標(biāo)記，3’端由BHQl標(biāo)記；丙型流感病毒的NP基因探針5’端由ROX標(biāo)記，3’端由BHQ2標(biāo)記；質(zhì)控基因LDHA基因探針5’端由CY5標(biāo)記，3’端由BHQ2標(biāo)記。
[0016]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法為多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)試劑盒的具體應(yīng)用，并使用所述引物和探針作為檢測(cè)序列。
[0017]在本發(fā)明的第三方面，提供一種同時(shí)檢測(cè)甲型、乙型及丙型流感病毒的PCR擴(kuò)增方法，該方法使用第二方面所述的試劑盒。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟:
[0019]a)四個(gè)熒光通道的設(shè)置；
[0020]b)反轉(zhuǎn)錄的溫度與時(shí)間；
[0021]c)預(yù)熱的溫度與時(shí)間；
[0022]d)熱循環(huán)(預(yù)熱溫度與時(shí)間、退火溫度與時(shí)間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù))；
[0023]e)以界定的Ct值來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果。
[0024]在本發(fā)明的第四方面，提供第一方面所述引物和探針在制備甲型、乙型及丙型流感病毒的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1.甲、乙、丙型流感病毒一步法含內(nèi)質(zhì)控的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法的特異性鑒定，其中:
[0026]圖1A為同時(shí)加入甲、乙、丙型流感病毒陽(yáng)性模板的熒光擴(kuò)增圖。[0027]圖1B為加入其他5種呼吸道多病原的陽(yáng)性模板的熒光擴(kuò)增圖(以副流感病毒I型為例)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]本發(fā)明所述甲型、乙型及丙型流感病毒多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，是基于相應(yīng)型別M基因、NS基因及NP基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的特異性引物和探針。
[0029]本發(fā)明的技術(shù)途徑是首先利用Applied B1systems(ABI)公司開發(fā)的PrimerExpreSS3.0軟件、針對(duì)甲型、乙型及丙型流感病毒相應(yīng)M基因、NS基因及NP基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針序列，確定了最佳配制體系及上機(jī)擴(kuò)增程序，并且進(jìn)行特異性、靈敏度及穩(wěn)定性等驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，成功建立了甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重?zé)晒釸T-PCR快速檢測(cè)方法。
[0030]下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件和方法，如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Sambrook, et al.New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)及實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(李金明，2007)中所述方法或試劑制造商提供的方法。
[0031]同時(shí)，需要指出的是，本發(fā)明所述的檢測(cè)方法和試劑盒不僅應(yīng)用于對(duì)患者(人、動(dòng)物)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，也包括對(duì)環(huán)境中的水樣品、食物樣品、空氣樣品、微生物樣品、動(dòng)物細(xì)胞樣品等多種樣品的非診斷目的的檢測(cè)。其應(yīng)用也都是本領(lǐng)域技術(shù)的常用技術(shù)手段，并不需要進(jìn)行特別的、富有創(chuàng)造性的改變。
[0032]實(shí)施例
[0033]實(shí)施例1.甲型、乙型及丙型流感病毒各型別M基因、NS基因及NP基因特異性引物和探針設(shè)計(jì)與合成
[0034]1.1甲型、乙型及丙型流感病毒代表株的相應(yīng)靶基因M、NS及NP的選擇及保守區(qū)的確定
[0035]本研究所用的序列選自NCBI GenBank (http: / / www.ncb1.nlm.nih.gov)和美國(guó)洛斯阿莫斯國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的流感病毒數(shù)據(jù)庫(kù)(http: / / www.flu.lanl.gov)中，主要選擇依據(jù)為:(a)年代較近毒株；(b)具有全長(zhǎng)序列及主體序列毒株；(C)WHO推薦的疫苗株；(d)同亞型序列比對(duì)后選取具有代表性的毒株。選取的甲型、乙型及丙型流感病毒代表株的相應(yīng)M基因、NS基因及NP基因的信息見表1-1、1-2及1-3。
[0036]本研究分別將所選擇的甲型、乙型及丙型流感病毒代表株的相應(yīng)M基因、NS基因及NP基因輸入到DNAssist軟件中進(jìn)行同源比對(duì)，確定了相應(yīng)亞型M基因、NS基因及NP基因的序列保守區(qū)，為引物和探針設(shè)計(jì)提供了靶區(qū)。
[0037]表1-1.選取甲型流感病毒(FluA)代表毒株的M基因信息
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種同時(shí)檢測(cè)甲型、乙型及丙型流感病毒的方法，其特征在于是含內(nèi)質(zhì)控的一步法多重?zé)晒釸T-PCR，其特異性引物和探針序列分別為: 1)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物； 2)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于如SEQNO:3所示的甲型流感病毒的M基因探針5’端由FAM標(biāo)記，3’端由BHQl標(biāo)記；如SEQ NO:6所示的乙型流感病毒的NS基因探針5’端由JOE標(biāo)記，3’端由BHQl標(biāo)記；如SEQ NO:9所示的丙型流感病毒的NP基因探針5’端由ROX標(biāo)記，3’端由BHQ2標(biāo)記；如SEQ NO:12所示的內(nèi)質(zhì)控基因LDHA基因探針5’端由CY5標(biāo)記，3’端由BHQ2標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述多重?zé)晒釸T-PCR的反應(yīng)體系: a)反應(yīng)緩沖液； b)反應(yīng)酶； c)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物； d)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針 e)無(wú)RNA酶的水補(bǔ)足體系要求的體積。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述多重?zé)晒釸T-PCR的反應(yīng)條件如下: a)四個(gè)熒光通道的設(shè)置； b)反轉(zhuǎn)錄的溫度與時(shí)間； c)預(yù)熱的溫度與時(shí)間； d)熱循環(huán)(預(yù)熱溫度與時(shí)間、退火溫度與時(shí)間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù))； e)以界定的Ct值來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果。
5.如權(quán)利要求1所述方法在檢測(cè)食品及原料、環(huán)境樣本中甲型、乙型及丙型流感病毒中的用途。
6.權(quán)利要求1所述的引物和探針序列在制備甲型、乙型及丙型流感病毒的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
7.一種同時(shí)檢測(cè)甲型、乙型及丙型流感病毒的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有特異性引物和探針，其序列分別為:
1)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物； 2)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針。
8.權(quán)利要求7所述的試劑盒在制備甲型、乙型及丙型流感病毒的診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104032034SQ201410083254
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】王全意, 楊鵬, 崔淑娟, 張莉, 彭曉旻, 張代濤, 吳雙勝 申請(qǐng)人:王全意