基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括退火低溫區(qū)、延伸適溫區(qū)、熱變高溫區(qū)、旋轉(zhuǎn)模塊、PCR試劑容納腔、注入微通道、儀器固定底座、熒光檢測(cè)系統(tǒng)；其中，溫度循環(huán)控制模塊包括退火低溫區(qū)、延伸適溫區(qū)、熱變高溫區(qū)；微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增模塊包括旋轉(zhuǎn)模塊、PCR試劑容納腔、注入微通道、儀器固定底座；熒光光譜檢測(cè)模塊包括熒光檢測(cè)系統(tǒng)；本發(fā)明將微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增模塊、溫度循環(huán)控制模塊、熒光光譜檢測(cè)模塊三個(gè)模塊集成，實(shí)現(xiàn)適用于空間作業(yè)要求的便攜式微型化PCR熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)，達(dá)到功能集成、結(jié)構(gòu)縮微、重量輕體積小全自動(dòng)檢測(cè)的目標(biāo)。
【專利說(shuō)明】基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)，屬于生物學(xué)和分析化學(xué)及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，在長(zhǎng)期航天飛行中的空間飛行器內(nèi)，微生物菌群的增長(zhǎng)及菌株變異會(huì)影響儀器設(shè)備的性能及工作環(huán)境條件，對(duì)航天器及其儀器設(shè)備的正常運(yùn)行產(chǎn)生危害。為了預(yù)防空間飛行中感染性疾病的發(fā)生、傳播和進(jìn)行有效治療，急需空間在軌生物危害實(shí)時(shí)自動(dòng)報(bào)警系統(tǒng)，其核心是微生物核酸熒光檢測(cè)微系統(tǒng)。由于空間在軌要求設(shè)備具有全自動(dòng)和微體積、小重量的技術(shù)特點(diǎn)。因此簡(jiǎn)化微流控?zé)晒釶CR工作系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)空間在軌生物危害實(shí)時(shí)自動(dòng)報(bào)警系統(tǒng)要求的關(guān)鍵。
[0003]關(guān)鍵技術(shù)是滿足“功能集成結(jié)構(gòu)縮微”的微型熒光檢測(cè)裝置，以實(shí)現(xiàn)重量輕、體積小、全自動(dòng)檢測(cè)為目標(biāo)，此外都需要對(duì)微量的樣品首先進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，使目標(biāo)DNA實(shí)現(xiàn)體外復(fù)制達(dá)到一定檢測(cè)量后進(jìn)行檢測(cè)分析。因此，微型熒光檢測(cè)裝置的研究可以移植在PCR微流控生物芯片上進(jìn)行，然后對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)在失重條件下的計(jì)算進(jìn)行修正研究，以達(dá)到空間應(yīng)用要求。
[0004]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種在體外模擬自然DNA復(fù)制過(guò)程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，由高溫?zé)嶙冃詼貐^(qū)、低溫退火復(fù)性溫區(qū)和適溫延伸溫區(qū)組成一個(gè)周期，一個(gè)循環(huán)可以使DNA總量增加一倍，可以把痕量的遺傳物質(zhì)迅速而簡(jiǎn)便的擴(kuò)增百萬(wàn)倍，再使用基于FRET (熒光共振能量傳遞技術(shù))進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)，根據(jù)熒光強(qiáng)度以及強(qiáng)度相對(duì)變化的信息，可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析。
`[0005]當(dāng)前市場(chǎng)上，常見的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀器，都不能滿足空間領(lǐng)域的需求，主要存在以下缺點(diǎn):
[0006]1、儀器內(nèi)PCR擴(kuò)增系統(tǒng)中的溫度控制模塊采用金屬塊進(jìn)行加熱和風(fēng)扇冷卻相配合，整個(gè)系統(tǒng)耗電量大，體積龐大難以微型化，無(wú)法實(shí)現(xiàn)便攜性，并且實(shí)施效率低，無(wú)法滿足快速處理問(wèn)題與迅速檢測(cè)樣本的要求；
[0007]2、儀器內(nèi)熒光檢測(cè)系統(tǒng)中的光電倍增管或電荷耦合元件自身的體積就很大，而且又是分體使用，需要有配套的光路系統(tǒng)，致使整個(gè)熒光微光譜檢測(cè)系統(tǒng)的體積龐大，加大了微型化的難度。無(wú)法應(yīng)用于快速發(fā)展的空間領(lǐng)域當(dāng)中；
[0008]3、儀器內(nèi)傳輸系統(tǒng)中的激發(fā)光傳導(dǎo)和反射光采集時(shí)需要各類光學(xué)器件和光纖組成的光路進(jìn)行光路傳輸，不僅結(jié)構(gòu)復(fù)雜難以微縮集成化，并且影響實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)中的各個(gè)模塊的靈敏性與穩(wěn)定性；
[0009]4、目前的儀器不僅體積龐大且無(wú)法對(duì)微通道內(nèi)溫度的變化、微流體的流速和熒光信號(hào)之間進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和反饋；
[0010]5、對(duì)于小型儀器的中溫度控制系統(tǒng)缺少完整的隔離性，三個(gè)溫區(qū)易相互干擾，嚴(yán)重影響生物反應(yīng)結(jié)果；[0011]因此，研制體積小、重量輕且高度集成自動(dòng)化的微型微流控PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)是主要目標(biāo)，其中對(duì)于三個(gè)溫區(qū)間的相互干擾問(wèn)題，旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)中的完全分離三個(gè)溫區(qū)，可以很好的解決；并且能夠最大化的減少PCR反應(yīng)中試劑在溫區(qū)移動(dòng)時(shí)消耗的時(shí)間，提高PCR系統(tǒng)的檢測(cè)效率；此外旋轉(zhuǎn)式的芯片結(jié)構(gòu)能很好的節(jié)省空間，最大化的減少體積空間，可以滿足空間領(lǐng)域苛刻要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于提供了一種基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)突光PCR檢測(cè)系統(tǒng)，其主要適用于對(duì)目標(biāo)樣本的PCR擴(kuò)增和基于微型結(jié)構(gòu)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)工作，并可應(yīng)用于失重條件下的空間領(lǐng)域工作；同時(shí)本發(fā)明將微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增模塊、溫度循環(huán)控制模塊、熒光光譜檢測(cè)模塊三個(gè)模塊集成，實(shí)現(xiàn)適用于空間作業(yè)要求的便攜式微型化PCR熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)，達(dá)到功能集成、結(jié)構(gòu)縮微、重量輕體積小全自動(dòng)檢測(cè)的目標(biāo)；此外在溫度控制方面，完成把三個(gè)溫區(qū)完全隔離的目標(biāo)。
[0013]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括退火低溫區(qū)、延伸適溫區(qū)、熱變高溫區(qū)、旋轉(zhuǎn)模塊、PCR試劑容納腔、注入微通道、儀器固定底座、熒光檢測(cè)系統(tǒng)；其中，溫度循環(huán)控制模塊包括退火低溫區(qū)、延伸適溫區(qū)、熱變高溫區(qū)；微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增模塊包括旋轉(zhuǎn)模塊、PCR試劑容納腔、注入微通道、儀器固定底座；熒光光譜檢測(cè)模塊包括熒光檢測(cè)系統(tǒng)。
[0014]所述退火低溫區(qū)、延伸適溫區(qū)、熱變高溫區(qū)這三個(gè)溫區(qū)作為系統(tǒng)的溫度循環(huán)控制模塊與儀器固定底座相連；儀器固定底座與旋轉(zhuǎn)模塊的中心軸連接；具體而言，退火低溫區(qū)與延伸適溫區(qū)和熱變高溫區(qū)內(nèi)分別裝有薄膜電加熱片作為加熱源，通過(guò)位于儀器固定底座內(nèi)的微型單片機(jī)控制加熱溫度，同時(shí)三個(gè)溫區(qū)底部分別裝有鉬電阻溫度傳感器，采集實(shí)時(shí)溫度值后反饋到單片機(jī)控制系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，單片機(jī)實(shí)時(shí)對(duì)加熱模塊進(jìn)行相關(guān)調(diào)整，每個(gè)溫區(qū)內(nèi)的加熱模塊分別處于恒溫狀態(tài)，使樣本不失去生物活性，并實(shí)時(shí)單向?qū)CR試劑容納腔進(jìn)行加熱；所述三個(gè)溫區(qū)分別位于三個(gè)不同的方向放置，相鄰之間呈120°夾角，完全隔離分開，避免了溫度干擾并進(jìn)行安全加熱，同時(shí)各控制溫區(qū)具有獨(dú)立性，當(dāng)出現(xiàn)故障的時(shí)候，方便及時(shí)維修。
[0015]PCR試劑容納腔通過(guò)注入微通道與旋轉(zhuǎn)模塊相連；熒光檢測(cè)系統(tǒng)與旋轉(zhuǎn)模塊相連，且PCR試劑容納腔、熒光檢測(cè)系統(tǒng)固定在一起，所述熒光檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)有LED顯示；退火低溫區(qū)、延伸適溫區(qū)、熱變高溫區(qū)的外形尺寸小于PCR試劑容納腔的外形尺寸，由于在三個(gè)加熱區(qū)中采用中心加熱的方式，PCR試劑容納腔的尺寸大于三個(gè)加熱區(qū)有助于充分加熱，使得反應(yīng)更加充分。
[0016]微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增模塊的工作過(guò)程如下，通過(guò)位于儀器固定底座內(nèi)的微型單片機(jī)的控制，使得在旋轉(zhuǎn)模塊內(nèi)的步進(jìn)電機(jī)按照PCR擴(kuò)增循環(huán)周期的要求進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)；PCR試劑容納腔依次經(jīng)過(guò)退火低溫區(qū)與延伸適溫區(qū)和熱變`高溫區(qū)的三個(gè)恒溫加熱區(qū)，使DNA經(jīng)高溫變性、低溫退火以及適溫延伸完成一次循環(huán)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，之后經(jīng)過(guò)四十次循環(huán)實(shí)現(xiàn)整個(gè)樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)，其中可通過(guò)設(shè)定不同溫區(qū)的寬度確定PCR試劑在不同溫區(qū)所需的反應(yīng)時(shí)間。
[0017]在PCR試劑容納腔中，上表面采用耐熱性、透光性較好的有機(jī)玻璃制成，將其作為PCR試劑容納腔的上表面，以便對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)并減少相應(yīng)誤差；下表面采用傳熱較好的耐熱材料，使得PCR試劑能夠良好的接收位于底層的三個(gè)溫區(qū)的加熱溫度；當(dāng)PCR試劑容納腔經(jīng)過(guò)微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增后，通過(guò)在PCR試劑容納腔正上方的熒光檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)的半導(dǎo)體發(fā)光二極管(LED)作為激發(fā)光源的激發(fā)光，使得樣本由于激發(fā)光激發(fā)出相應(yīng)熒光，之后被熒光檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)的光學(xué)微透鏡采集，并由系統(tǒng)中的光電二極管(PIN)換器接收，由單片機(jī)進(jìn)行算法處理，最終將生物結(jié)果輸出在熒光檢測(cè)系統(tǒng)的LED顯示屏上；熒光檢測(cè)模塊與單片機(jī)工作流程如下，激發(fā)光源發(fā)射指定峰值波長(zhǎng)的光，之后通過(guò)相同峰值波長(zhǎng)的濾光片，最后經(jīng)模塊內(nèi)部的光學(xué)微透鏡聚焦到樣本上；樣本受到光的激發(fā)，樣本發(fā)出熒光，并利用光學(xué)傳感器(例如光硅電池等半導(dǎo)體光電轉(zhuǎn)換器件)把收集到的熒光光強(qiáng)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電流強(qiáng)度，之后通過(guò)一個(gè)放大電路把測(cè)到的電流放大并通過(guò)一個(gè)指定電阻，變成相應(yīng)的電壓值，之后通過(guò)AD芯片把測(cè)試到的電壓值進(jìn)行AD轉(zhuǎn)換，之后把轉(zhuǎn)換的二進(jìn)制數(shù)輸入到單片機(jī)中做處理，最終利用單片機(jī)算法把處理后的數(shù)據(jù)代入相應(yīng)轉(zhuǎn)換公式，把電壓值轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的熒光強(qiáng)度值，并在LED/LCD屏中顯示；之后在每次循環(huán)后記下熒光強(qiáng)度值，取50次循環(huán)作為計(jì)數(shù)點(diǎn)處理并作圖；最后輸出平滑上升曲線。結(jié)果符合理論P(yáng)CR反應(yīng)情況，設(shè)備具有相應(yīng)實(shí)際應(yīng)用性。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果。
[0019]1、本發(fā)明相較于傳統(tǒng)的大型PCR檢測(cè)系統(tǒng)，采用單片機(jī)微處理器集成控制系統(tǒng)，既減少了多余的外圍設(shè)備，使系統(tǒng)更加微型化；并且功能集成化，使得PCR擴(kuò)增系統(tǒng)與PCR實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)能夠集成在一起共同來(lái)完成，方便每次循環(huán)后的樣本檢測(cè)，提高了實(shí)驗(yàn)
處理效率。
[0020]2、本發(fā)明旋轉(zhuǎn)式微流控芯片結(jié)構(gòu)為載體，相對(duì)于傳統(tǒng)的PCR循環(huán)通道中加熱層一體化段加熱的方法，本系統(tǒng)采用三個(gè)溫區(qū)完全分離的方法，節(jié)省了隔熱材料，減少了微通道內(nèi)PCR試劑在路程中滯留時(shí)間，減少了反應(yīng)區(qū)變溫時(shí)間，從而加快了整體的工作效率。
`[0021]3、本發(fā)明采用中軸旋轉(zhuǎn)式工作方式，避免了傳統(tǒng)PCR試劑在微通道中反復(fù)移動(dòng)時(shí)PCR試劑掛壁現(xiàn)象，而是通過(guò)中軸電機(jī)來(lái)完成整體運(yùn)動(dòng)，減低了反應(yīng)誤差、提高了檢測(cè)系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。
[0022]4、本發(fā)明中的熒光檢測(cè)裝置有較高的集成性，如激發(fā)光源、光的聚集與傳輸、光勻束、光采集、光檢測(cè)等；由于取代了大型的光電倍增管PMT或電荷耦合元件CCD等，使得整個(gè)裝置的特征尺寸縮小到只有毫米數(shù)量級(jí)。具有較高的便攜性。
[0023]5、本發(fā)明采用單片機(jī)控制步進(jìn)電機(jī)旋轉(zhuǎn)速度與溫區(qū)溫度，整體采用密封封裝，不受重力條件的影響，可以移植到空間領(lǐng)域應(yīng)用，并且避免試劑污染環(huán)境與資源的循環(huán)利用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)俯視圖。
[0025]圖2為基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)總結(jié)構(gòu)立體圖。
[0026]圖3為系統(tǒng)中PCR試劑容納模塊的剖面圖。
[0027]圖4為熒光檢測(cè)模塊與單片機(jī)工作流程圖。
[0028]圖5為熒光檢測(cè)單片機(jī)仿真圖
[0029]圖中:1、退火低溫區(qū)；2、延伸適溫區(qū)；3、熱變高溫區(qū)；4、旋轉(zhuǎn)模塊；5、PCR試劑容納腔；6、注入微通道；7、儀器固定底座；8、熒光檢測(cè)系統(tǒng)。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0031]一種基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括退火低溫區(qū)1、延伸適溫區(qū)2、熱變高溫區(qū)3、旋轉(zhuǎn)模塊4、PCR試劑容納腔5、注入微通道6、儀器固定底座7、熒光檢測(cè)系統(tǒng)8 ;其中，溫度循環(huán)控制模塊包括退火低溫區(qū)1、延伸適溫區(qū)2、熱變高溫區(qū)3 ；微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增模塊包括旋轉(zhuǎn)模塊4、PCR試劑容納腔5、注入微通道6、儀器固定底座7 ;熒光光譜檢測(cè)模塊包括熒光檢測(cè)系統(tǒng)8。
[0032]所述退火低溫區(qū)1、延伸適溫區(qū)2、熱變高溫區(qū)3這三個(gè)溫區(qū)作為系統(tǒng)的溫度循環(huán)控制模塊與儀器固定底座7相連；儀器固定底座7與旋轉(zhuǎn)模塊4的中心軸連接；具體而言，退火低溫區(qū)I與延伸適溫區(qū)2和熱變高溫區(qū)3內(nèi)分別裝有薄膜電加熱片作為加熱源，通過(guò)位于儀器固定底座7內(nèi)的微型單片機(jī)控制加熱溫度，同時(shí)三個(gè)溫區(qū)底部分別裝有鉬電阻溫度傳感器，采集實(shí)時(shí)溫度值后反饋到單片機(jī)控制系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，單片機(jī)實(shí)時(shí)對(duì)加熱模塊進(jìn)行相關(guān)調(diào)整，每個(gè)溫區(qū)內(nèi)的加熱模塊分別處于恒溫狀態(tài)，使樣本不失去生物活性，并實(shí)時(shí)單向?qū)CR試劑容納腔5進(jìn)行加熱；所述三個(gè)溫區(qū)分別位于三個(gè)不同的方向放置，相鄰之間呈120°夾角，完全隔離分開，避免了溫度干擾并進(jìn)行安全加熱，同時(shí)各控制溫區(qū)具有獨(dú)立性，當(dāng)出現(xiàn)故障的時(shí)候，方便及時(shí)維修。
[0033]PCR試劑容納腔5通過(guò)注入微通道6與旋轉(zhuǎn)模塊4相連；熒光檢測(cè)系統(tǒng)8與旋轉(zhuǎn)模塊4相連，且PCR試劑容納腔5、熒光檢測(cè)系統(tǒng)8固定在一起，所述熒光檢測(cè)系統(tǒng)8設(shè)有LED顯示；退火低溫區(qū)1、延伸適溫區(qū)2、熱變高溫區(qū)3的外形尺寸小于PCR試劑容納腔5的外形尺寸，由于在三個(gè)加熱區(qū)中采用中心加熱的方式，PCR試劑容納腔5的尺寸大于三個(gè)加熱區(qū)有助于充分加熱，使得反應(yīng)更加充分。
[0034]微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增模塊的工作過(guò)程如下，通過(guò)位于儀器固定底座7內(nèi)的微型單片機(jī)的控制，使得在旋轉(zhuǎn)模塊4內(nèi)的步`進(jìn)電機(jī)按照PCR擴(kuò)增循環(huán)周期的要求進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)；PCR試劑容納腔5依次經(jīng)過(guò)退火低溫區(qū)I與延伸適溫區(qū)2和熱變高溫區(qū)3的三個(gè)恒溫加熱區(qū)，使DNA經(jīng)高溫變性、低溫退火以及適溫延伸完成一次循環(huán)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，之后經(jīng)過(guò)四十次循環(huán)實(shí)現(xiàn)整個(gè)樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)，其中可通過(guò)設(shè)定不同溫區(qū)的寬度確定PCR試劑在不同溫區(qū)所需的反應(yīng)時(shí)間。
[0035]在PCR試劑容納腔5中，上表面采用耐熱性、透光性較好的有機(jī)玻璃制成，將其作為PCR試劑容納腔的上表面，以便對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)并減少相應(yīng)誤差；下表面采用傳熱較好的耐熱材料，使得PCR試劑能夠良好的接收位于底層的三個(gè)溫區(qū)的加熱溫度；熒光光譜檢測(cè)模塊如圖2所示的系統(tǒng)總結(jié)構(gòu)圖，當(dāng)PCR試劑容納腔5經(jīng)過(guò)微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增后，通過(guò)在PCR試劑容納腔5正上方的熒光檢測(cè)系統(tǒng)8內(nèi)的半導(dǎo)體發(fā)光二極管(LED)作為激發(fā)光源的激發(fā)光，使得樣本由于激發(fā)光激發(fā)出相應(yīng)熒光，之后被熒光檢測(cè)系統(tǒng)8內(nèi)的光學(xué)微透鏡采集，并由系統(tǒng)中的光電二極管(PIN)換器接收，由單片機(jī)進(jìn)行算法處理，最終將生物結(jié)果輸出在熒光檢測(cè)系統(tǒng)8的LED顯示屏上；流程如圖4所示，熒光檢測(cè)模塊與單片機(jī)工作流程如下，激發(fā)光源發(fā)射指定峰值波長(zhǎng)的光，之后通過(guò)相同峰值波長(zhǎng)的濾光片，最后經(jīng)模塊內(nèi)部的光學(xué)微透鏡聚焦到樣本上；樣本受到光的激發(fā)，樣本發(fā)出熒光，并利用光學(xué)傳感器(例如光硅電池等半導(dǎo)體光電轉(zhuǎn)換器件)把收集到的熒光光強(qiáng)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電流強(qiáng)度，之后通過(guò)一個(gè)由LM358運(yùn)放芯片構(gòu)成的放大電路把測(cè)到的微安級(jí)電流放大到可以用于實(shí)驗(yàn)的毫安級(jí)電流，并通過(guò)一個(gè)大小為I千歐的電阻，變成相應(yīng)的電壓值，之后通過(guò)AD芯片ADC0804把測(cè)試到的電壓值進(jìn)行AD轉(zhuǎn)換，之后把轉(zhuǎn)換的二進(jìn)制數(shù)輸入到單片機(jī)中做處理，最終利用單片機(jī)算法把處理后的數(shù)據(jù)代入相應(yīng)轉(zhuǎn)換公式，把電壓值轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的熒光強(qiáng)度值，并在LED/IXD屏中顯示；之后在每次循環(huán)后記下熒光強(qiáng)度值，取50次循環(huán)作為計(jì)數(shù)點(diǎn)處理并作圖；最后輸出平滑上升曲線。如圖5熒光檢測(cè)單片機(jī)仿真圖，由于仿真軟件庫(kù)所限，LM358運(yùn)放用0P07運(yùn)放來(lái)代替，LED顯示屏用數(shù)碼管來(lái)代替，單片機(jī)用傳統(tǒng)51單片機(jī)。在實(shí)際中，由于51單片機(jī)與其外設(shè)模塊體積相對(duì)較大，不易在微結(jié)構(gòu)儀器中使用，所以我們?cè)趯?shí)際設(shè)計(jì)中，會(huì)選擇AVR等微型單片機(jī)來(lái)完成。
[0036]如圖3-5，系統(tǒng)中PCR試劑容納模塊的剖面圖所示，在PCR試劑容納腔5中，上表面采用透光較好的耐熱材料，以便之后對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)中，減少相應(yīng)誤差；下表面采用傳熱較好的耐熱材料，使得PCR試劑能夠良好的接收位于底層的三個(gè)溫區(qū)的加熱溫度。熒光光譜檢測(cè)模塊由圖2系統(tǒng)總結(jié)構(gòu)圖所示，當(dāng)PCR試劑容納腔5經(jīng)過(guò)微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增后，通過(guò)在PCR試劑容納腔5正上方的熒光檢測(cè)系統(tǒng)8內(nèi)的半導(dǎo)體發(fā)光二極管(LED)作為激發(fā)光源發(fā)出峰值波長(zhǎng)為475nm的激發(fā)光，使得樣本由于激發(fā)光激發(fā)出相應(yīng)熒光，之后被熒光檢測(cè)系統(tǒng)8內(nèi)的光學(xué)微透鏡采集，并由系統(tǒng)中的光電二極管(PIN)換器接收，由單片機(jī)進(jìn)行算法處理，最終將生物結(jié)果輸出在熒光檢測(cè)系統(tǒng)8上方的LED顯示屏上；其中曲線在1-20循環(huán)區(qū)間內(nèi) 上升不明顯；在20-45循環(huán)區(qū)間內(nèi)有明顯指數(shù)上升；在45循環(huán)之后聚合酶失去活性，曲線又逐漸停止上升趨于平穩(wěn)。結(jié)果符合理論P(yáng)CR反應(yīng)情況，設(shè)備具有相應(yīng)實(shí)際應(yīng)用性。
【權(quán)利要求】
1.一種基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)突光PCR檢測(cè)系統(tǒng),其特征在于:該系統(tǒng)包括退火低溫區(qū)(I)、延伸適溫區(qū)(2)、熱變高溫區(qū)(3)、旋轉(zhuǎn)模塊(4)、PCR試劑容納腔(5)、注入微通道(6)、儀器固定底座(7)、熒光檢測(cè)系統(tǒng)(8);其中，溫度循環(huán)控制模塊包括退火低溫區(qū)(I)、延伸適溫區(qū)(2)、熱變高溫區(qū)(3);微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增模塊包括旋轉(zhuǎn)模塊(4)、PCR試劑容納腔(5)、注入微通道(6)、儀器固定底座(7);熒光光譜檢測(cè)模塊包括熒光檢測(cè)系統(tǒng)(8)； 所述退火低溫區(qū)(I)、延伸適溫區(qū)(2)、熱變高溫區(qū)(3)這三個(gè)溫區(qū)作為系統(tǒng)的溫度循環(huán)控制模塊與儀器固定底座(7)相連；儀器固定底座(7)與旋轉(zhuǎn)模塊(4)的中心軸連接；具體而言，退火低溫區(qū)(I)與延伸適溫區(qū)(2)和熱變高溫區(qū)(3)內(nèi)分別裝有薄膜電加熱片作為加熱源，通過(guò)位于儀器固定底座(7)內(nèi)的微型單片機(jī)控制加熱溫度，同時(shí)三個(gè)溫區(qū)底部分別裝有鉬電阻溫度傳感器，采集實(shí)時(shí)溫度值后反饋到單片機(jī)控制系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，單片機(jī)實(shí)時(shí)對(duì)加熱模塊進(jìn)行相關(guān)調(diào)整，每個(gè)溫區(qū)內(nèi)的加熱模塊分別處于恒溫狀態(tài)，使樣本不失去生物活性，并實(shí)時(shí)單向?qū)CR試劑容納腔(5)進(jìn)行加熱；所述三個(gè)溫區(qū)分別位于三個(gè)不同的方向放置，相鄰之間呈120°夾角，完全隔離分開； PCR試劑容納腔(5 )通過(guò)注入微通道(6 )與旋轉(zhuǎn)模塊(4)相連；熒光檢測(cè)系統(tǒng)(8 )與旋轉(zhuǎn)模塊(4)相連，且PCR試劑容納腔(5)、熒光檢測(cè)系統(tǒng)(8)固定在一起，所述熒光檢測(cè)系統(tǒng)(8)設(shè)有LED顯示；退火低溫區(qū)(I)、延伸適溫區(qū)(2)、熱變高溫區(qū)(3)的外形尺寸小于PCR試劑容納腔(5)的外形尺寸，由于在三個(gè)加熱區(qū)中采用中心加熱的方式，PCR試劑容納腔(5)的尺寸大于三個(gè)加熱區(qū)有助于充分加熱，使得反應(yīng)更加充分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于:微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增模塊的工作過(guò)程如下，通過(guò)位于儀器固定底座(7)內(nèi)的微型單片機(jī)的控制，使得在旋轉(zhuǎn)模塊(4)內(nèi)的步進(jìn)電機(jī)按照PCR擴(kuò)增循環(huán)周期的要求進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)；PCR試劑容納腔(5)依次`經(jīng)過(guò)退火低溫區(qū)(I)與延伸適溫區(qū)(2)和熱變高溫區(qū)(3)的三個(gè)恒溫加熱區(qū)，使DNA經(jīng)高溫變性、低溫退火以及適溫延伸完成一次循環(huán)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，之后經(jīng)過(guò)四十次循環(huán)實(shí)現(xiàn)整個(gè)樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)，其中可通過(guò)設(shè)定不同溫區(qū)的寬度確定PCR試劑在不同溫區(qū)所需的反應(yīng)時(shí)間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于:在PCR試劑容納腔(5)中，上表面采用耐熱性、透光性較好的有機(jī)玻璃制成，將其作為PCR試劑容納腔的上表面，以便對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)并減少相應(yīng)誤差；下表面采用傳熱較好的耐熱材料，使得PCR試劑能夠良好的接收位于底層的三個(gè)溫區(qū)的加熱溫度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于:當(dāng)PCR試劑容納腔(5)經(jīng)過(guò)微通道循環(huán)PCR擴(kuò)增后，通過(guò)在PCR試劑容納腔(5)正上方的熒光檢測(cè)系統(tǒng)(8)內(nèi)的半導(dǎo)體發(fā)光二極管作為激發(fā)光源的激發(fā)光，使得樣本由于激發(fā)光激發(fā)出相應(yīng)熒光，之后被熒光檢測(cè)系統(tǒng)(8)內(nèi)的光學(xué)微透鏡采集，并由系統(tǒng)中的光電二極管換器接收，由單片機(jī)進(jìn)行算法處理，最終將生物結(jié)果輸出在熒光檢測(cè)系統(tǒng)(8)的LED顯示屏上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于旋轉(zhuǎn)式微流控芯片的實(shí)時(shí)突光PCR檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于:熒光檢測(cè)模塊與單片機(jī)工作流程如下，激發(fā)光源發(fā)射指定峰值波長(zhǎng)的光，之后通過(guò)相同峰值波長(zhǎng)的濾光片，最后經(jīng)模塊內(nèi)部的光學(xué)微透鏡聚焦到樣本上；樣本受到光的激發(fā)，樣本發(fā)出熒光，并利用光學(xué)傳感器把收集到的熒光光強(qiáng)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電流強(qiáng)度，之后通過(guò)一個(gè)放大電路把測(cè)到的電流放大并通過(guò)一個(gè)指定電阻，變成相應(yīng)的電壓值，之后通過(guò)AD芯片把測(cè)試到的電壓值進(jìn)行AD轉(zhuǎn)換，之后把轉(zhuǎn)換的二進(jìn)制數(shù)輸入到單片機(jī)中做處理，最終利用單片機(jī)算法把處理后的數(shù)據(jù)代入相應(yīng)轉(zhuǎn)換公式，把電壓值轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的熒光強(qiáng)度值，并在LED/IXD屏中顯示；之后在每次循環(huán)后記下熒光強(qiáng)度值，取50次循環(huán)作為計(jì)數(shù)點(diǎn)處理并作圖；最后輸出 平滑上升曲線。
【文檔編號(hào)】C12M1/36GK103820316SQ201410084321
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月9日
【發(fā)明者】吳堅(jiān), 于倫, 王富吉, 陳濤, 鄭楊 申請(qǐng)人:北京工業(yè)大學(xué)