一種提高桑黃發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程【技術領域】，具體涉及一種提高桑黃發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法。其發(fā)酵周期短，發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量高。本發(fā)明采用的技術方案包括為：將桑黃菌種接種到液體培養(yǎng)基中，進行活化培養(yǎng)，然后按體積百分數(shù)的13%的接種量接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行種子培養(yǎng)，得種子液；將種子液按體積百分比為10～15%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度27～30℃的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)24～36h，然后加入脫落酸溶液，繼續(xù)培養(yǎng)56～72h，得到桑黃菌絲體和發(fā)酵液；將得到菌絲體和發(fā)酵液通過板框壓濾機壓濾，然后將濾餅在70～80℃的溫度下烘干，將濾液通過真空濃縮后在噴霧干燥機進行噴霧干燥成干粉，把兩者混合既得桑黃發(fā)酵菌絲體。
【專利說明】一種提高桑黃發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法
[0001]一、【技術領域】:
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程【技術領域】，具體涉及一種提高桑黃發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法。
[0002]二、【背景技術】:
桑黃是一種多年生的藥用真菌，是我國最有發(fā)展前景的珍稀、瀕危中藥之一。主要分布于秦嶺、陜西與甘肅交界的“子午嶺”地區(qū)。生長于楊、桑、柳、白樺、櫸樹、桃等闊葉樹的枯立木及樹干上?！吨兴幋筠o典》記載，其可治血崩、血淋、帶下、閉經(jīng)等婦科疾病?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)桑黃具有明顯的抗肝纖維化作用，并且又是目前國際公認的生物治癌領域有效率排在第
一的聞等真菌。
[0003]隨著生物技術的發(fā)展，桑黃藥理作用不斷被揭示，對桑黃多糖類等活性物質(zhì)研究工作的深入，人們將中藥材桑黃作為一種重要生物資源，應用于抗腫瘤產(chǎn)品開發(fā)，在科技界和實業(yè)界都傾注了很高的熱情。
[0004]現(xiàn)在社會腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢，腫瘤的轉移是導致治療失敗最主要的原因。桑黃多糖對腫瘤轉移有著顯著抑制作用，1999年Han等研究表明桑黃多糖與阿霉素(ADM)的活性比較，不僅可以抑制腫瘤生長還可以抑制腫瘤轉移，單獨使用桑黃多糖顯著提高了植入黑素瘤B16F10的小鼠的存活率，抑制了裸鼠體內(nèi)植入的NC1-H23的生長并減少黑素瘤B16F10的肺轉移率。阿霉素 (ADM)對腫瘤轉移的抑制作用較輕，與桑黃多糖合用可使阿霉素(ADM)對腫瘤生長的抑制作用增強，但不論與大劑量或小劑量的阿霉素(ADM)合用都使桑黃多糖對腫瘤細胞轉移的抑制率低于單獨使用桑黃多糖。
[0005]1968年，Ikekawa等報道了云芝和桑黃等11種真菌對小鼠接種肉瘤180ICR的抗腫瘤作用，桑黃水提取物對腫瘤的抑制率最強，抑瘤率可達到96.7%，而且這種提取物對肉瘤180細胞不表現(xiàn)細胞毒性。1993年韓國政府已正式許可桑黃成為菌類抗腫瘤藥品。
[0006]目前桑黃作為新的生物藥品和抗腫瘤制品開發(fā)利用，在國內(nèi)才開始起步，在日本和韓國已有了產(chǎn)品上市。1993年韓國政府正式許可桑黃成為菌類抗腫瘤藥品。桑黃子實體國際市場價每公斤2300美元。由于市場需求量增大，價格高，對桑黃進行掠奪性開采現(xiàn)狀還是無法杜絕，野生子實體孢子無法大量形成，桑黃本身生理生態(tài)的特殊性和復雜性，造成野生桑黃資源難以恢復，甚至即將枯竭。所以對桑黃資源的保護和開發(fā)迫在眉睫。因此，采用生物技術進行深層發(fā)酵，獲取含有效成分的桑黃菌絲體，形成穩(wěn)定的醫(yī)藥工業(yè)產(chǎn)品來源是非常重要的。既促進了桑黃產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，又保護了瀕危和緊缺的桑黃資源，保證了中藥資源的永續(xù)利用。
[0007]目前已有一些科研院所及生物公司在用發(fā)酵法生產(chǎn)桑黃菌絲體，尚未有從桑黃生物代謝的角度分析研究，對發(fā)酵法生產(chǎn)桑黃菌絲體發(fā)酵水平的提高有限，發(fā)酵周期長，成本高，整體的生產(chǎn)效率較低，遠不能滿足進一步實現(xiàn)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的需要。
[0008]脫落酸又被稱為S-誘抗素，是一種生物抗逆誘導物，最初被認為是一種生長抑制物質(zhì)，對種子(果實)的發(fā)育、成熟，植物和種子休眠，器官脫落等起重要作用。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)脫落酸在植物干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫反應中起重要作用，它是植物的抗逆誘導因子，因而被稱為植物的“脅迫激素”。
[0009]液體發(fā)酵法生產(chǎn)桑黃菌絲體的發(fā)酵條件與自然界的桑黃生長有很大不同，對于長期在自然界生長發(fā)育的桑黃菌絲生長來說發(fā)酵過程不是一種最適的生長發(fā)育環(huán)境，而利用脫落酸誘導生物產(chǎn)生各種應對的抵抗能力提高桑黃菌絲體在發(fā)酵條件下抗逆作用，使菌絲體生長速度加快，產(chǎn)量提高。
[0010]三、
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明為了解決上述【背景技術】中的不足之處，提供一種提高桑黃發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，其發(fā)酵周期短，發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量高。
[0011]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:一種提高桑黃發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，其特征在于:所述的發(fā)酵方法包括以下步驟:
步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養(yǎng)基中，進行活化培養(yǎng)，然后按體積百分數(shù)的13%的接種量接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行種子培養(yǎng)，得種子液；
步驟二:將步驟一制得種子液按體積百分比為10~15%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)24~36h，然后加入脫落酸溶液，然后繼續(xù)培養(yǎng)56~72h，得到桑黃菌絲體和發(fā)酵液的混合液；
步驟三:將步驟二得到的桑黃菌絲體和發(fā)酵液的混合液通過板框壓濾機壓濾，然后將濾餅在70~80°C的溫度下烘干，將濾液通過真空濃縮后在噴霧干燥機進行噴霧干燥成干粉，把兩者混合既得桑黃發(fā)酵菌絲體。
[0012]所述的種子培養(yǎng)條件為:溫度28°C，搖床培養(yǎng)108h。
[0013]所述的脫落酸溶 液的濃度為0.5~1.5ppm/L ;脫落酸的濃度為步驟二中整個溶液濃度。
[0014]所述的液體培養(yǎng)基為常規(guī)綜合pda液體培養(yǎng)基。
[0015]所述的真空濃縮的真空度0.09~0.1MPa,噴霧干燥工藝的入口溫度136~141°C，出口溫度81~82°C，蠕泵轉速8r/min，風機轉速906r/min，工作壓力0.23~0.24MPa0
[0016]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下:本發(fā)酵方法生產(chǎn)桑黃菌絲體產(chǎn)量與已報道的桑黃發(fā)酵工藝技術相比，具有發(fā)酵周期短且發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量高的優(yōu)點，發(fā)酵周期92h，菌絲體產(chǎn)量達29.13g/L。
[0017]四、【具體實施方式】:
桑黃，俗稱鮑氏層孔、火木層孔、針層孔等，屬于擔子菌綱、多孔菌目，多孔菌科，層孔菌屬，是近幾年開發(fā)的一種多年生藥用真菌。通過對桑黃發(fā)酵菌絲體生產(chǎn)過程中添加脫落酸的初步研究，發(fā)現(xiàn)脫落酸對桑黃發(fā)酵工藝的發(fā)酵周期及菌絲體產(chǎn)量具有較大的影響，在優(yōu)化后的發(fā)酵工藝下發(fā)酵，發(fā)酵周期可由沒添加脫落酸的120h縮短為92h，菌絲體產(chǎn)量由22.5g/L提高到29.13g/L，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。
[0018]本發(fā)明采用液體深層培養(yǎng)方法通過在發(fā)酵過程中添加不同脫落酸濃度對桑黃菌絲體產(chǎn)量的影響，研究桑黃發(fā)酵菌絲體發(fā)酵過程中最適的脫落酸濃度，篩選出了桑黃發(fā)酵過程中添加脫落酸濃度為0.5~1.5ppm/L，發(fā)酵周期92h，菌絲體產(chǎn)量達29.13g/L。
[0019]實施例1:
步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養(yǎng)基中，進行活化培養(yǎng)，然后按體積百分數(shù)的13%的接種量接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)條件為:溫度28°C，搖床培養(yǎng)108h，得種子液；
步驟二:將步驟一制得種子液按10~15%的體積比接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)24h，然后加入脫落酸溶液，脫落酸的濃度為
0.5ppm/L，脫落酸的濃度為步驟二中整個溶液濃度，然后繼續(xù)培養(yǎng)72h，得到桑黃菌絲體和發(fā)酵液的混合液；
步驟三:將步驟二得到的菌絲體和發(fā)酵液的混合液通過板框壓濾機壓濾，濾餅70~80°C烘干，將濾液通過真空濃縮后在噴霧干燥機進行噴霧干燥成干粉，把兩者混合既得桑黃發(fā)酵菌絲體，稱重。
[0020]實施例2:
步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養(yǎng)基中，進行活化培養(yǎng)，然后按體積百分數(shù)的13%的接種量接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)條件為--溫度28°C，搖床培養(yǎng)108h，得種子液；
步驟二:將步驟一制得種子液按10~15%的體積比接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)30h，然后加入脫落酸溶液，脫落酸的濃度為
1.0ppm/L，脫落酸的濃度為步驟二中整個溶液濃度，然后繼續(xù)培養(yǎng)62h，得到桑黃菌絲體和發(fā)酵液的混合液；
步驟三:同實施例1。
[0021]實施例3:` 步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養(yǎng)基中，進行活化培養(yǎng)，然后按體積百分數(shù)的13%的接種量接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)條件為--溫度28°C，搖床培養(yǎng)108h，得種子液；
步驟二:將步驟一制得種子液按10~15%的體積比接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)36h，然后加入脫落酸溶液，脫落酸的濃度為
1.5ppm/L，脫落酸的濃度為步驟二中整個溶液濃度，然后繼續(xù)培養(yǎng)72h，得到桑黃菌絲體和發(fā)酵液的混合液；
步驟三:同實施例1。
[0022]對照實驗:
步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養(yǎng)基中，進行活化培養(yǎng)，然后按體積百分數(shù)的13%的接種量接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)條件為--溫度28°C，搖床培養(yǎng)108h，得種子液；
步驟二:將步驟一制得種子液按10~15%的體積比接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)120h，得到桑黃菌絲體和發(fā)酵液；
步驟三:同實施例1。
[0023]不同脫落酸濃度對發(fā)酵菌絲體漆酶產(chǎn)量及發(fā)酵周期的影響作用的對比如下表
麗每酸濃度I培養(yǎng)時間(h) I桑黃菌絲體產(chǎn)量(g/L)
對照為 O 120_22.50_
實施例1 一 9628.39
實施例2 ~9229.13
實施例 3 1108\29.13—所述的實施例一、實施例二、實施例三和對照試驗中所采用的種子發(fā)酵培養(yǎng)基為常規(guī)的培養(yǎng)基，其原料組成可以為:2%葡萄糖，0.4%蛋白胨，0.1% KH2P04,0.05% MgS04, VBllOmg/100mL, pH6.5。
[0024]所述的實施例一、實施例二、實施例三和對照試驗中所采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為常規(guī)的培養(yǎng)基，其原料組成可以為:玉米粉1.5%、麩皮1.2%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏
0.5%、KH2P040 .l%、MgS040.05%、維生素 BI 10 mg/L。
【權利要求】
1.一種提高桑黃發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，其特征在于:所述的發(fā)酵方法包括以下步驟: 步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養(yǎng)基中，進行活化培養(yǎng)，然后按體積百分數(shù)的13%的接種量接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行種子培養(yǎng)，得種子液； 步驟二:將步驟一制得種子液按體積百分比為10~15%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)24~36h，然后加入脫落酸溶液，然后繼續(xù)培養(yǎng)56~72h，得到桑黃菌絲體和發(fā)酵液的混合液； 步驟三:將步驟二得到的桑黃菌絲體和發(fā)酵液的混合液通過板框壓濾機壓濾，然后將濾餅在70~80°C的溫度下烘干，將濾液通過真空濃縮后在噴霧干燥機進行噴霧干燥成干粉，把兩者混合既得桑黃發(fā)酵菌絲體。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種提高桑黃發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，其特征在于:所述的種子培養(yǎng)條件為--溫度28°C，搖床培養(yǎng)108h。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種提高桑黃發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，其特征在于:所述的脫落酸溶液的濃度為0.5~1.5ppm/L ;脫落酸的濃度為步驟二中整個溶液濃度。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種提高桑黃發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，其特征在于:所述的液體培養(yǎng)基為常規(guī)綜合Pda液體培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種提高桑黃發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，其特征在于:所述的真空濃縮的真空度0.09~0.1MPa,噴霧干燥工藝的入口溫度136~141°C，出口溫度81~82°C，蠕泵轉速8r/min，風機轉速906r/min，工作壓力0.23~0.24 MPa。
【文檔編號】C12R1/645GK103820333SQ201410084714
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權日:2014年3月10日
【發(fā)明者】雷萍, 吳亞召, 張文雋, 安軍民, 陳旭, 呂德平 申請人:陜西省微生物研究所