一種聯(lián)產(chǎn)香葉醇和橙花醇的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種聯(lián)產(chǎn)香葉醇和橙花醇的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明在基因工程菌中表達(dá)了乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶，以及香葉醇合成酶或磷酸酶。本發(fā)明利用基因工程手段在大腸桿菌體內(nèi)成功建立了合成香葉醇和橙花醇的代謝途徑，可直接將葡萄糖生物轉(zhuǎn)化為香葉醇和橙花醇。
【專利說明】一種聯(lián)產(chǎn)香葉醇和橙花醇的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種聯(lián)產(chǎn)香葉醇和橙花醇的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]香葉醇(反_3，7-甲基-2，6-辛二烯-1-醇，Geraniol，又稱櫳牛兒醇)及其同分異構(gòu)體橙花醇(順_3，7- 二甲基-2，6-辛二烯醇，nerol)是一種非環(huán)單萜醇類化合物，是玫瑰油、馬丁香油和香茅油等香精油的主要成分之一。香葉醇和橙花醇及其酯可用于香精和食用香精，是玫瑰系香精的主劑，還可廣泛應(yīng)用于藥物、煙草、食品配料。此外，還可用作天然低毒防蟲劑，一類新型的化學(xué)防癌制劑。目前橙花醇的全球年需求量在5000噸左右，其中我國的需求量也不低于500噸，而全世界的生產(chǎn)能力只有3000噸左右。
[0003]香葉醇和橙花醇天然存在于天竺葵、蕓香草、香茅、玫瑰花等50多種植物中。從天然植物中提取出揮發(fā)油，仍是市場上的主要來源。但是，由于人工培植受氣候影響較大，且隨著人力成本的上升，天然香葉醇的數(shù)量和成本難以穩(wěn)定，供應(yīng)不能得到保證。
[0004]工業(yè)上生產(chǎn)香葉醇和橙花醇是以月桂烯為原料，月桂烯的一級氯化物與乙酸鈉共熱，得香葉醇和橙花醇的乙酸酯混合物。然后將此粗酯皂化，再蒸餾得約含60%櫳牛兒醇和40%橙花醇的混合物，仔細(xì)分餾可得高品級的香葉醇。黃宇平等以芳樟醇為原料，合成出香葉醇和橙花醇。以檸檬醛為原料制備橙花醇香葉醇的合成方法已有許多報道，例如催化氫化法，醇鋁法，硼氫化鈉法。尹顯洪對硼氫化鈉法進(jìn)行改進(jìn)研究，以水和苯作混合溶劑，替代純有機(jī)溶劑。采用相轉(zhuǎn)移催化方法，提高反應(yīng)速率。但是，化學(xué)法存在環(huán)境污染、條件苛刻等問題，且合成的產(chǎn)品雜質(zhì)多，影響了香葉醇的品質(zhì)及下游應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的問題是提供一種以葡萄糖為底物合成香葉醇和橙花醇的基因工程菌。
[0006]所述基因工程菌是在能夠表達(dá)香葉基焦磷酸的微生物中導(dǎo)入了香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因得到的基因工程菌。
[0007]所述微生物為常用于分子生物學(xué)改造的微生物，優(yōu)選大腸桿菌。
[0008]所述基因工程菌共表達(dá)了乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶，以及香葉醇合成酶或磷酸酶。
[0009]所述乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),或細(xì)菌，或其它生物體，優(yōu)選糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)ο
[0010]所述3-輕-3-甲基戍二酰輔酶A合酶來源于:釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),或細(xì)菌,或其它生物體，優(yōu)選糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。
[0011]所述甲輕戍酸激酶來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),或細(xì)菌,或其它生物體，優(yōu)選釀酒酵母。
[0012]所述甲輕戍酸-5-磷酸激酶來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),或細(xì)菌，或其它生物體，優(yōu)選釀酒酵母。
[0013]所述甲輕戍酸-5-二磷酸脫羧酶來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),或細(xì)菌，或其它生物體，優(yōu)選釀酒酵母。
[0014]所述異戍烯焦磷酸異構(gòu)酶來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),或細(xì)菌，或其它生物體，優(yōu)選釀酒酵母。
[0015]所述香葉酯二磷酸合成酶來源于大腸桿菌(Escherichia coli),或北美冷杉(Abiesgrandis)其它生物體,優(yōu)選北美冷杉。
[0016]所述香葉醇合成酶來源于甜羅勒(Sweet Basil),或細(xì)毛樟(Cinnamomumtenuipilum),或其它生物體。優(yōu)選來源于甜羅勒的香葉醇合成酶，其核苷酸序列如GenBank: AY362553.1 所不。
[0017]所述磷酸酶來源于酵母，或細(xì)菌，或其它生物體，優(yōu)選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。優(yōu)選釀酒酵母的憐脂酸憐酸酶 DPPl (NCBI ReferenceSequence:ΝΜ_001180592.1)，或來源于釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPPl (NCBI ReferenceSequence:NM_001180811.3)，或來源于大腸桿菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF(GenBank:U22009.1 )，或 來源于大腸桿菌的堿性磷酸酶(phoA)，或來源于枯草芽胞桿菌的憐酸酶 phoE (GenBank: CP003783.1 )，或來源于克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的喊性憐酸酶 phoA (GenBank:AF453253.1)。
[0018]本發(fā)明還提供一種構(gòu)建所述基因工程菌的方法，是在能夠表達(dá)香葉基焦磷酸的微生物中導(dǎo)入了香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因。
[0019]所述構(gòu)建方法主要包括下述步驟:
[0020](I)將乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因以及香葉酯二磷酸合成酶基因克隆到質(zhì)粒pACYCDuet-Ι，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pACY-mvaE-mvaS_GPPS2。
[0021]所述乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戍二酰輔酶A合酶基因優(yōu)選來源于糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。所述香葉酯二磷酸合成酶基因來源于北美冷杉(Abiesgrandis )。
[0022](2)將甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶基因以及異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因克隆到pTrcHiS2B得到重組質(zhì)粒pTrc-low。
[0023]所述甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶基因、異戍烯焦磷酸異構(gòu)酶基因優(yōu)選來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0024](3)將編碼香葉醇合成酶或磷酸酶或焦磷酸酶的基因克隆到質(zhì)粒pACY-mvaE-mvaS-GPPS2 上。
[0025]本發(fā)明首次證明磷酸酶可以催化GPP合成香葉醇和橙花醇。
[0026]本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)香葉醇和橙花醇的的方法，是在能夠表達(dá)香葉基焦磷酸的微生物中導(dǎo)入香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因，利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)香葉醇和橙花醇。
[0027]在微生物中共表達(dá)乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶，以及香葉醇合成酶或磷酸酶；利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)香葉醇和橙花醇。
[0028]優(yōu)選在微生物中共表達(dá)乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶和磷酸酶；利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)香葉醇和橙花醇。
[0029]所述磷酸酶是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶DPP1，編碼該酶的核苷酸序列如NCBIReference Sequence:ΝΜ_001180592.1所示；或是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPP1，編碼該酶的核苷酸序列如NCBI Reference Sequence:NM_001180811.3所示；或是來源于大腸桿菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF，其核苷酸序列如GenBank:U22009.1所示；或是來源于大腸桿菌的堿性磷酸酶基因phoA，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；或是來源于枯草芽胞桿菌的磷酸酶phoE，其核苷酸序列如GenBank:CP003783.1所示；或是來源于克雷伯氏肺炎菌的堿性磷酸酶phoA,其核苷酸序列如GenBank:AF453253.1所示。
[0030]本發(fā)明提出利用廉價的、可再生資源葡萄糖為原料，通過生物催化劑直接制備香葉醇和橙花醇。該路線原料廉價、可持續(xù)供應(yīng)，具有規(guī)?；l(fā)展的潛力。與傳統(tǒng)的制備工藝相比，利用微生物催化合成菔烯的路線具有如下的優(yōu)勢:(1)使用的原料為木質(zhì)纖維素降解獲得的葡萄糖，是可再生資源。(2)整個過程是在常溫常壓下進(jìn)行，能耗低。(3)與從植物中提取法相同，生物法合成的香葉醇和橙花醇是天然產(chǎn)品，市場需求度高。(4)以葡萄糖為原料，通過工程菌一步發(fā)酵獲得香葉醇和橙花醇，具備產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)潛力。因此，利用生物催化手段制備香葉醇和橙花醇將成為今后工業(yè)發(fā)展的必然趨勢。此外，大腸桿菌具有生長速度快、發(fā)酵周期短、遺傳背景清楚、易于工程化操作、可利用廉價的可再生資源等特點(diǎn)，因此大腸桿菌作為生物催化劑已成為近年來生產(chǎn)生物基化學(xué)品的有效手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是質(zhì)粒pLWG2構(gòu)建示意圖。
[0032]圖2是質(zhì)粒pLWG3構(gòu)建示意圖。
[0033]圖3是質(zhì)粒pLWG4構(gòu)建示意圖。
[0034]圖4是質(zhì)粒pLWG5構(gòu)建示意圖。
[0035]圖5香葉醇和橙花醇混合標(biāo)準(zhǔn)品GC-MS流出曲線。
[0036]圖6橙花醇分子碎片質(zhì)譜圖。
[0037]圖7香葉醇分子碎片質(zhì)譜圖。
[0038]圖8工程大腸桿菌LWG2合成出的香葉醇GC-MS圖。
[0039]圖9工程大腸桿菌LWG3的GC-MS圖。
[0040]圖10工程大腸桿菌LWG4的GC-MS圖。
[0041 ]圖11香葉醇和橙花醇混合標(biāo)準(zhǔn)品的GC檢測圖。
[0042]圖12工程大腸桿菌LWG5合成出的橙花醇和香葉醇的GC檢測圖。[0043]圖13工程大腸桿菌LWG6合成出的橙花醇和香葉醇的GC檢測圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044]本發(fā)明利用基因工程手段以大腸桿菌為模式菌株，在其體內(nèi)成功建立了合成香葉醇和橙花醇的代謝途徑，可直接將葡萄糖生物轉(zhuǎn)化為香葉醇和橙花醇。
[0045]橙花醇和香葉醇的檢測方法:取發(fā)酵液Iml然后12000X Imin離心，取上清500 μ I并加入等體積乙酸乙酯于渦旋振蕩器上混勻5min，然后靜置lOmin，取上層有機(jī)相進(jìn)行過濾后放置在液相小瓶中待測。檢測條件=GC-MS儀器型號:Angilent7890 ;分離柱型號:DB-5 ;離子源:EI ;進(jìn)樣量:0.01ml ;檢測器:四級桿；柱溫:50°C起步以10°C /min的速度升溫至280°C，保溫5min ;樣品檢測:取液相小瓶中液體進(jìn)行檢測。GC儀器型號:SP_6890分離柱形號:HP-1NNOWAX進(jìn)樣量:Iul檢測器:氫火焰檢測器(FID)柱溫:50°C起步以10°C /min的速度升溫至250°C，保溫5min樣品檢測:取上層有機(jī)相進(jìn)行檢測。
[0046]質(zhì)粒:
[0047]pYJM26,即 pACY-mvaE-mvaS_GPPS2,是攜帶有來源于幾腸球菌(Enterococcusfaecalis)的乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(mvaE)(GenBank N0.AAG02438)，3-羥 _3_ 甲基戊二酰輔酶 A 合酶基因(mvaS) (GenBankN0.AAG02439)；以及來源于北美冷杉(Abiesgrandis)的香葉酯二磷酸合成酶基因(GPPS2) (GenBank N0.AF513112.1)的 pACYCDuet-Ι。pYJM26 的構(gòu)建方法參見 JianmingYang, et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis ofalpha-pinene.Biotechnology for Biofuels，2013，6:60。
[0048]pYJM14，即 pTrc-low，是攜帶有來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羥戊酸激酶基因(ERG12)NCBI Reference Sequence:NM—001182715.1，甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)NCBI Reference Sequence:NM—001182727.1，甲羥戊酸 _5_ 二磷酸脫羧酶基因(ERG19)GenBank:X97557.1，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因(IDIl)NCBIReference Sequence:NM—001183931.1 的 pTrcHis2B。該質(zhì)粒的構(gòu)建方法參見 JianmingYang, et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis ofalpha-pinene.Biotechnology for Biofuels，2013，6:60。
[0049]表1引物序列
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種聯(lián)產(chǎn)香葉醇和橙花醇的基因工程菌，其特征在于，是在能夠表達(dá)香葉基焦磷酸的微生物中導(dǎo)入了香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因得到的基因工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌共表達(dá)了乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶，以及香葉醇合成酶或磷酸酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述香葉醇合成酶來源于甜羅勒，編碼該酶的核苷酸序列如GenBank:AY362553.1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述磷酸酶是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶DPP1，編碼該酶的核苷酸序列如NCBI Reference Sequence:ΝΜ_001180592.1所示；或是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPPl，編碼該酶的核苷酸序列如NCBI ReferenceSequence:NM_001180811.3所示；或是來源于大腸桿菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF，其核苷酸序列如GenBank:U22009.1所示；或是來源于大腸桿菌的堿性磷酸酶基因phoA,其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；或是來源于枯草芽胞桿菌的磷酸酶phoE，其核苷酸序列如GenBank:CP003783.1所示；或是來源于克雷伯氏肺炎菌的堿性磷酸酶phoA，其核苷酸序列如 GenBank:AF453253.1 所不。
5.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述基因工程菌的方法，是在能夠表達(dá)香葉基焦磷酸的微生物中導(dǎo)入了香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)將乙酰輔酶A酰基 轉(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因以及香葉酯二磷酸合成酶基因克隆到質(zhì)粒pACY⑶uet-Ι，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pACY-mvaE-mvaS_GPPS2 ； 所述乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因來源于糞腸球菌(Enterococcus faecalis),所述香葉酯二磷酸合成酶基因來源于北美冷杉(Abiesgrandis)； (2)將甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因以及異戍烯焦磷酸異構(gòu)酶基因克隆到pTrcHis2B得到重組質(zhì)粒pTrc_low ； 所述甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶基因、異戍烯焦磷酸異構(gòu)酶基因優(yōu)選來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)； (3)將編碼香葉醇合成酶或磷酸酶或焦磷酸酶的基因克隆到質(zhì)粒pACY-mvaE-mvaS-GPPS2 上。
7.—種生產(chǎn)香葉醇和橙花醇的的方法，其特征在于，在能夠表達(dá)香葉基焦磷酸的微生物中導(dǎo)入香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因，利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)香葉醇和橙花醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，在微生物中共表達(dá)乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶，以及香葉醇合成酶或磷酸酶；利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)香葉醇和橙花醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，在微生物中共表達(dá)乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶和磷酸酶；利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)香葉醇和橙花醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，所述磷酸酶是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶DPP1，編碼該酶的核苷 酸序列如NCBI Reference Sequence:ΝΜ_001180592.1所示；或是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPP1,編碼該酶的核苷酸序列如NCBI ReferenceSequence:NM_001180811.3所示；或是來源于大腸桿菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF，其核苷酸序列如GenBank:U22009.1所示；或是來源于大腸桿菌的堿性磷酸酶基因phoA,其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；或是來源于枯草芽胞桿菌的磷酸酶phoE，其核苷酸序列如GenBank:CP003783.1所示；或是來源于克雷伯氏肺炎菌的堿性磷酸酶phoA，其核苷酸序列如 GenBank: AF453253.1 所不。
【文檔編號】C12N15/74GK103898037SQ201410086945
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】咸漠, 劉煒, 田寧, 蔣昱東 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所