一種能夠去除熱原及病毒的尿激酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能夠去除熱原及病毒的尿激酶的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方法是將尿激酶粗品經(jīng)DEAE-纖維素層析、CMC層析、親和層析、去熱原后得到尿激酶精品。該技術(shù)的優(yōu)點在于在生產(chǎn)過程中采用60℃水浴滅菌處理使病毒失活以及用磷酸三鈉和醋酸鈣吸附去除產(chǎn)品中的熱原，保證產(chǎn)品的質(zhì)量。該方法得到的尿激酶無病毒無熱原，且精品的比活能夠達(dá)到13萬單位/mg以上。
【專利說明】一種能夠去除熱原及病毒的尿激酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說涉及一種制備尿激酶精品的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]尿激酶是人血液中的尿激酶原在部分降解后從尿液中排出的一種絲氨酸蛋白酶，為血纖蛋白溶酶原激活劑，可將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，臨床上主要用于治療急性心肌梗塞、急性腦血栓形成、腦血管栓塞、血栓性閉塞性疾病、肺栓塞以及視網(wǎng)膜中央靜脈血栓形成等疾病。[0003]《中國藥典》2005版和2010版，明確規(guī)定“本品在生產(chǎn)過程中需經(jīng)60°C加熱10小時，以使病毒滅活”；且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求尿激酶的細(xì)菌內(nèi)毒素小于1.0EU/萬單位。
[0004]目前，國內(nèi)不少專家針對尿激酶的制備工藝進(jìn)行了深入的試驗研究，如一種特異性純化高分子尿激酶層析介質(zhì)及制備方法和應(yīng)用(楊華英等專利號CN 101693748 A)、一種尿激酶制備方法(張志武等專利號CN101701215 A)等，都結(jié)合使用離子交換層析法、凝膠分子篩法、免疫親和層析、對氨基苯甲脒-Sepharose親和層析技術(shù)，純化精制得到尿激酶。使產(chǎn)品的比活、高分子尿激酶相對含量以及尿激酶生物活性的回收率不斷提高。
[0005]但是針對尿激酶產(chǎn)品中病毒及熱原的去除研究，發(fā)表的文獻(xiàn)較少。
[0006]細(xì)菌內(nèi)毒素屬于熱原的一種，而熱原系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。它包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。這里所指的“熱原”，主要是指細(xì)菌性熱原，是某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌尸體及內(nèi)毒素。致熱能力最強的是革蘭氏陰性桿菌的產(chǎn)物，其次是革蘭陽性桿菌類，革蘭陽性球菌則較弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能產(chǎn)生熱原。當(dāng)含有熱原的物質(zhì)進(jìn)入人體以后，人體會產(chǎn)生發(fā)冷、寒顫、發(fā)熱、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時體溫可升至40°C以上，嚴(yán)重者甚至昏迷、虛脫，如不及時搶救，可危及生命。因此去熱原是本品生產(chǎn)工序中不可缺少的一步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供了一種能夠去除病毒及熱原的尿激酶制備方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是:將尿激酶粗品經(jīng)DEAE-纖維素層析、CMC層析、親和層析、去熱原后得到尿激酶精品，包括如下步驟:
(1)粗品提取:取尿激酶粗品，加磷酸鹽緩沖液進(jìn)行溶解，尿激酶粗品與磷酸緩沖液的比例為:lg: l(Tl4ml ;攪拌；過濾，將濾餅再加磷酸緩沖液進(jìn)行溶解，濾餅與磷酸緩沖液按的比例為:Ig: 2飛ml ;攪拌，過濾；合并兩次的濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至7.0-8.0 ；
(2)超濾:將粗提液用超濾膜超濾至原體積的1/5至1/20;加水至原體積后，繼續(xù)超濾至原體積的1/5至1/15 ;加0.02511101 / L PBS平衡液至原體積后，繼續(xù)超濾至原體積的1/2至 1/5 ；
(3)DEAE-纖維素層析:取經(jīng)0.025mol/L PBS平衡液平衡的DEAE-纖維素，加入超濾液中，攪拌，過濾；在濾液中加入上一次量1/2的0.025 mo I/L PBS平衡液平衡的DEAE-纖維素，攪拌，過濾；合并二次濾液；
(4)CMC層析：調(diào)節(jié)濾液pH至3. (T5. 0，調(diào)整電導(dǎo)率至15?20 u S/cm。CMC柱先用 0. 05、. 2 mol/L醋酸緩沖液平衡，再將濾液上CMC柱，用0. 05% ^0. 2%氨水溶液洗脫，得洗 脫液。將洗脫液在60°C水浴滅菌10小時；
(5)親和層析:將Trypsin-inhibitor-Sepharose裝柱，用含 lmol/L NaCl 的 O.Olmol/ L PBS平衡液洗滌平衡；將已滅菌的洗脫液進(jìn)行上柱；用含lmol /L NaCl的0. Olmol/LPBS 平衡液洗滌f 3個床體積，再用含0. 5mol/L NaCl的0. Olmol/LPBS平衡液洗滌0. f 1個床 體積；最后用0. Olmol /LPBS洗脫液洗脫，收集洗脫液。
[0009](6)沉淀、干燥：調(diào)節(jié)洗脫液pH至6. (T7. 0，用乙醇進(jìn)行沉淀，洗脫液與乙醇的體積 比為1: 3^8 ;再用乙醇洗滌沉淀，重復(fù)2?4次；干燥，得干燥品。
[0010](7)去熱原I :將干燥品加水，按lg: 6(T75ml的比例進(jìn)行溶解，在攪拌下加 入等體積-2(T0°C的乙醇，再按溶液總體積lml:5?10g的比例加入醋酸銨，然后緩慢加 A 0. To. 3 mol /L磷酸鈉溶液，其用量與干燥品的比例為：lml:l(Tl4g，攪拌，最后加入 0. ro. 5 mol /L醋酸鈣溶液，其用量與干燥品重量的比例為：lml:l(Tl4g;調(diào)節(jié)pH至8. 5， 攪拌，離心，取上清液。
[0011](8)去熱原II :上清液調(diào)pH至6. (T7. 0，在攪拌時，加入乙醇進(jìn)行沉淀，上清液與加 入乙醇的體積比為：1 :4飛，離心。再用乙醇洗滌沉淀物，離心，反復(fù)2?4次；然后沉淀物干 燥，得尿激酶精品。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例
[0013]所述的利用尿激酶粗品經(jīng)DEAE-纖維素層析、CMC層析、親和層析、去熱原后得到 尿激酶精品，包括如下步驟：
1 .DEAE-纖維素層析 1. 1粗品提?。?br> 取粗品420g，溶解于12倍量lmol/L磷酸緩沖液中，攪拌提取2小時后，過濾得濾液。 濾餅再次溶解于4倍量lmol/L磷酸緩沖液中，攪拌，過濾得濾液。合并二次濾液，用5mol/ LHC1 調(diào) pH 至 7. 5。
[0014]1.2 超濾:
將已調(diào)pH至7. 5的粗提液用Cut-off 10000MW的超濾膜超濾至原體積的1/12時，加 水至原體積，繼續(xù)超濾至原體積的1/10，然后加0. 025mol/LPBS平衡液至原體積，繼續(xù)超濾 至原體積的1/3。
[0015]1. 3DEAE-纖維素層析
1. 3. 1取經(jīng)0. 025mol/LPBS平衡液平衡的DEAE-纖維素，按超濾液30個0D (280nm)加 一克的比例加入超濾液中，攪拌，過濾得濾液。
[0016]1. 3. 2 用 0. 025mol/LPBS 平衡液洗滌 DEAE-纖維素。
[0017]1. 3. 3在濾液中加入1. 3. 1中一半量的DEAE-纖維素，攪拌，過濾得濾液。[0018]1.3.4合并二次濾液。
[0019]2.CMC 層析
2.1將濾液調(diào)節(jié)pH至4.2，并加氯化鈉調(diào)整濾液使電導(dǎo)在17處。
[0020]2.2濾液上經(jīng)0.1moI/L醋酸緩沖液平衡過夜的CMC柱，流速控制在125ml/min ;用0.1%氨水溶液洗脫,得洗脫液。
[0021]2.3將洗脫液在60°C水浴滅菌10小時。
[0022]3.親和層析
3.1 將 Trypsin-1nhibitor-Sepharose 裝柱，用 25 倍床體積的含 lmol/LNaCl 的
0.0ImoI/LPBS平衡液洗滌平衡12小時。
[0023]3.2將已滅菌的洗脫液上柱，流速控制在42ml/min。
[0024]3.3上柱結(jié)束后，用含lmol /LNaCl的0.0ImoI/LPBS平衡液洗滌2個床體積，再用含0.5mol/L NaCl的0.0ImoI/LPBS平衡液洗滌I個床體積。
[0025]3.4 洗脫:
用0.0ImoI/LPBS洗脫液洗脫，流速控制在40ml/min，收集流出液。
[0026]3.5 沉淀
用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.51，再用乙醇進(jìn)行沉淀，加入的乙醇與洗脫液的體積比為5:1，攪拌，靜置沉淀12小時。
[0027]3.6 干燥
沉淀結(jié)束后，離心，用乙醇洗滌沉淀，重復(fù)二次；將沉淀物干燥，干燥后得干燥品11.5g。
[0028]4.去熱原
4.1將上述干燥品加入788ml水?dāng)嚢枞芙?；在攪拌下加入等體積乙醇，然后再加入醋酸銨，醋酸銨的用量與溶液總體積的比例為:8g:lml，溶液澄清；
4.2再緩慢加入0.2mol/L磷酸鈉溶液189ml，攪拌15分鐘后，加入0.3mol/L醋酸鈣溶液 189ml ；
4.3然后，用5 mo I/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5，攪拌I小時，離心，棄去沉淀物；
4.4最后用5 mo I/L HCl調(diào)節(jié)上清液pH至6.68，在攪拌下，加入9860 ml乙醇，沉淀析出，置冰箱靜置12小時；
4.5沉淀結(jié)束后，離心，用乙醇洗滌沉淀，反復(fù)2次；
4.6最后,將沉淀物干燥,得干燥品29.6g,即為成品。
[0029]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種能夠去除熱原及病毒的尿激酶的制備方法，其特征在于:將尿激酶粗品經(jīng)DEAE-纖維素層析、CMC層析、親和層析、去熱原后得到尿激酶精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取尿激酶精品的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)粗品提取:取尿激酶粗品溶解于磷酸緩沖液中，攪拌，過濾，調(diào)節(jié)PH； (2)超濾:將粗提液超濾；加水，超濾；加PBS平衡液，超濾； (3)DEAE-纖維素層析:用PBS平衡液平衡DEAE-纖維素，加入超濾液中，攪拌，過濾；在濾液中加入PBS平衡液平衡的DEAE-纖維素，攪拌，過濾； (4)CMC層析:調(diào)節(jié)濾液pH和電導(dǎo)率，再將濾液上CMC柱，用氨水溶液洗脫，得洗脫液，滅菌； (5)親和層析:將樹脂裝柱，用含NaCl的PBS平衡液洗滌平衡，將已滅菌的洗脫液上柱，洗滌；用PBS洗脫液洗脫，收集流出液； (6)沉淀、干燥:調(diào)節(jié)流出液pH，加入乙醇沉淀，離心，沉淀物用乙醇洗滌，干燥，得干燥品; (7)去熱原 1:將干燥品用水溶解，依次加入乙醇、醋酸銨、磷酸鈉溶液、醋酸鈣溶液，攪拌，調(diào)節(jié)pH，攪拌，離心，取上清液； I1:調(diào)節(jié)上清液PH，攪拌，加入乙醇進(jìn)行沉淀，離心，并用乙醇洗滌沉淀，干燥，得去除熱原及病毒的尿激 酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，將尿激酶粗品用磷酸緩沖液溶解；尿激酶粗品與磷酸緩沖液的比例為:lg:l(Tl4ml ；調(diào)節(jié)pH至7.0-8.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，將粗提液用超濾膜超濾至原體積的1/5至1/20 ;加水至原體積后，再超濾至原體積的1/5至1/15 ;加0.025 mo I / LPBS平衡液至原體積后，繼續(xù)超濾至原體積的1/2至1/5。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，DEAE-纖維素用0.025mo I / L PBS平衡液平衡。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，調(diào)節(jié)濾液pH至3.0-5.0，調(diào)整電導(dǎo)率至15~20 μ S/cm ;CMC柱用0.05、.2 mo I / L醋酸緩沖液平衡；氨水溶液體積濃度為0.05%~0.2% ;將洗脫液在60°C水浴滅菌10小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(5)中，樹脂柱用含lmol/ L NaCl的0.01mol / L PBS平衡液平衡；將洗脫液上柱，上柱結(jié)束后，先用含lmol /L NaCl的0.01mol / LPBS平衡液洗滌柱子，再用含0.5mol/L NaCl的0.01mol/LPBS平衡液洗滌；最后用0.01mol/LPBS洗脫液洗脫，收集洗脫液。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(6)中，調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0,加入乙醇的體積是洗脫液體積的31倍。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(7)的I中，用水量與干燥品的比例為:6(T70ml:lg ;乙醇的溫度:-2(HrC ;醋酸銨的用量與溶液總體積的比例為:5~IOg:1ml ;磷酸鈉溶液的濃度:0.1~0.3 mo I /L，磷酸鈉溶液的用量與干燥品的比例為l(Tl4ml:1g ;醋酸鈣溶液的濃度:0.1、.5 mo I /L，醋酸鈣溶液的用量與干燥品的比例為 I g;調(diào)節(jié)pH為8.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(7)的II中，上清液調(diào)pH至6.0~7.0 0
【文檔編號】C12N9/72GK103865909SQ201410087719
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】呂金花, 劉翠珍, 葛翠鳳, 朱琳 申請人:青島九龍生物醫(yī)藥有限公司