一種低溫木聚糖酶XynAGN16及其基因、重組載體、重組菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種低溫木聚糖酶XynAGN16及其基因、重組載體、重組菌株。本發(fā)明提供了一種來源于節(jié)桿菌（Arthrobacter?sp.）的木聚糖酶XynAGN16，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，且本發(fā)明提供了上述木聚糖酶的編碼基因xynAGN16，木聚糖酶基因xynAGN16的重組載體和木聚糖酶基因xynAGN16的重組菌株。本發(fā)明的木聚糖酶具有以下性質(zhì)：最適pH6.5；最適溫度為45℃，在0℃、10℃及20℃下分別具有17.2%、27.6%和41.8%的酶活；在60℃下處理1h，剩余酶活分別為23.3%，比其它低溫木聚糖酶穩(wěn)定。本發(fā)明的木聚糖酶可應(yīng)用于飼料及食品行業(yè)。
【專利說明】—種低溫木聚糖酶XynAGN16及其基因、重組載體、重組菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是一種具有低溫活性的木聚糖酶XynAGN16及其基因、重組載體、重組菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]半纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組分，是自然界中繼纖維素之后的第二豐富碳水化合物。木聚糖是半纖維素的重要組分，廣泛存在于蕨類、裸子植物和被子植物中，如農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物中的玉米芯、麥麩、米糠、秸桿和甘蔗渣等。木聚糖酶是可將木聚糖主鏈和側(cè)鏈降解的一類酶，包括內(nèi)切-1, 4-β -D-木聚糖酶(endo-1, 4-β -D-xylanase, EC3.2.1.8)、α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶(a -L-arabinofuranosidase, EC3.2.1.55)、a -D-葡糖醒酸糖苷酶(a -D-glucuronidase, EC3.2.1.139)和 β -D-木糖苷酶(β -D-xylosidase,EC3.2.1.37)等(Collins et al.FEMS Microbiol Rev, 2005, 29:3 - 23.)D 根據(jù)氨基酸序列同源性，木聚糖酶主要?dú)w類于糖苷水解酶第10、11、30、39、43、52、62和67家族(Finn etal.Nucleic Acids Res, 2008，36:D281 - D288.)。內(nèi)切-1，4-β-D-木聚糖酶，也就是我們通常所說的木聚糖酶，主要?dú)w類于糖苷水解酶第10和11家族。在木聚糖的降解過程中，內(nèi)切-1，4- β -D-木聚糖酶可隨機(jī)地切割木聚糖的主鏈骨架，生成木糖或低聚木糖，是木聚糖降解相關(guān)酶中研究最多和最有應(yīng)用價值的一類酶。
[0003]內(nèi)切-1，4-β -D-木聚糖酶在飼料、食品、釀酒、紡織及造紙等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用性，如內(nèi)切-1，4_i3-D-木聚糖酶在飼料行業(yè)中可改善飼料性能并消除或降低抗?fàn)I養(yǎng)作用、在造紙和紙漿工業(yè)中可取代有毒的漂白用化學(xué)物質(zhì)但仍能使紙張達(dá)到漂白效果、在釀酒行業(yè)中可改善酒的色澤并增加酒精的產(chǎn)率、在食品行業(yè)中可改善食品性能、在紡織業(yè)中可輔助原料脫膠等。低溫木聚糖酶在低溫環(huán)境中具有較高的酶活，可用于低溫到中溫的生境或加工過程，相對于中溫或高溫木聚糖酶有其特有的應(yīng)用優(yōu)勢(Gerday et al.TrendsBiotechnol, 2000, 18:103 - 107)，如水產(chǎn)生境常常為10 - 25°C、食品行業(yè)中的醒面和桿面過程需要在35°C以下進(jìn)行等。將中溫或者高溫加工的過程轉(zhuǎn)為低溫加工過程還可起到降低能耗的作用(Beg et al.Appl Microbiol Biotechnol, 2001，56:326 - 338.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種具有低溫活性的木聚糖酶。
[0005]本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述木聚糖酶的基因。
[0006]本發(fā)明的另一目 的是提供包含上述基因的重組載體。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0008]本發(fā)明所述木聚糖酶XynAGN16可得自節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)。XynAGNl6的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]本發(fā)明的木聚糖酶XynAGN16總共含1212個氨基酸，理論分子量為131.6kDa。該酶的最適pH值為6.5，在pH6.0-8.0的范圍內(nèi)維持50%以上的酶活性，在pH9.0 - 11.0的范圍內(nèi)維持20%以上的酶活性；經(jīng)pH7.0-12.0的緩沖液處理lh，該酶酶活剩余達(dá)45%以上；該酶最適溫度為45°C，在0°C、10°C及20°C下分別具有17.2%,27.6%和41.8%的酶活；在37°C、50°C和60°C下處理lh，剩余酶活分別為52.4%、21.2%和23.3% ;該酶可水解燕麥木聚糖、樺木木聚糖和山毛櫸木聚糖，不能水解羧甲基纖維素納、普魯蘭多糖和β -葡聚糖。
[0010]本發(fā)明提供了編碼上述木聚糖酶的基因xynAGN16，該基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]本發(fā)明通過基因組測序的方法克隆了木聚糖酶XynAGN16的編碼基因xynAGN16，其全長3639bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TGA。經(jīng)氨基酸序列同源比對，該木聚糖酶XynAGN16為多結(jié)構(gòu)域蛋白，從N端到C端依次為糖苷水解酶第10家族結(jié)構(gòu)域、多聚糖脫乙酰酶結(jié)構(gòu)域(polysaccharide deacetylase)、碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM_4_9)和糖苷水解酶第10家族結(jié)構(gòu)域。GenBank中還未檢索到與XynAGN16有相似結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的木聚糖酶。木聚糖酶XynAGN16與Cellulomonas fimi JCFX5來源的潛在木聚糖酶(CAA90745)具有最高的一致性，為30.7%。以上分析說明木聚糖酶XynAGN16是一種新的木聚糖酶。
[0012]本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶基因xynAGN16的重組載體，優(yōu)選為pET-xynAGN16。將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到表達(dá)載體中，使其核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實(shí)施方案，將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到質(zhì)粒pET-28a ( + )上的HindIII和NotI限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET_xynAGN160
[0013]本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶基因xynAGN16的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株BL21 (DE3)/xynAGN16。
[0014]本發(fā)明制備木聚糖酶XynAGNie的方法按以下步驟進(jìn)行:
[0015]I)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0016]2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木聚糖酶表達(dá)；
[0017]3)回收所表達(dá)的木聚糖酶XynAGN16。
[0018]其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21 (DE3)/xynAGN16。
[0019]本發(fā)明提供了一個新的木聚糖酶基因，其編碼的木聚糖酶最適pH值為6.5，在pH6.0-8.0的范圍內(nèi)維持50%以上的酶活性，在pH9.0 - 11.0的范圍內(nèi)維持20%以上的酶活性；經(jīng)PH7.0-12.0的緩沖液處理lh，該酶酶活剩余達(dá)45%以上；該酶最適溫度為45°C，在(TC、10。。及20°C下分別具有17.2%,27.6%和41.8%的酶活；在37°C、50°C和60°C下處理lh，剩余酶活分別為52.4%、21.2%和23.3% ;該酶可水解燕麥木聚糖、樺木木聚糖和山毛櫸木聚糖，不能水解羧甲基纖維素納、普魯蘭多糖和β_葡聚糖。該酶可應(yīng)用于飼料及食品行業(yè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1:在大腸桿菌中表達(dá)的重組木聚糖酶XynAGN16的SDS-PAGE分析，其中，M:蛋白質(zhì)Marker ；CK:含有載體pET_28a ( + )的大腸桿菌菌體破碎上清液；S:含有重組載體pET-xynAGN16的大腸桿菌菌體破碎上清液。[0021]圖2:重組木聚糖酶XynAGN16的pH活性。
[0022]圖3:重組木聚糖酶XynAGN16的pH穩(wěn)定性。
[0023]圖4:重組木聚糖酶XynAGN16的熱活性。
[0024]圖5:重組木聚糖酶XynAGN16的熱穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0026]試驗材料和試劑
[0027]1、菌株及載體:節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)同文獻(xiàn)報道菌種性質(zhì),如中國普通微生物菌種保藏管理中心菌株Arthrobacter citreus CGMCC1.1893 ;大腸桿菌Escherichiacoli BL21 (DE3)和表達(dá)載體 pET_28a ( + )購于 Novagen 公司。[0028]2、酶類及其它生化試劑:DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶和dNTP購自TaKaRa公司；燕麥木聚糖、樺木木聚糖、山毛櫸木聚糖、羧甲基纖維素納、普魯蘭多糖和β_葡聚糖購自 Sigma 公司；Genomic DNA Clean&Concentration 試劑盒購自 Zymo Research 公司，TureseqTM DNA Sample Preparation Kit購自Illumima公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
[0029]3、培養(yǎng)基:
[0030]LB 培養(yǎng)基:PeptonelOg, Yeast extract5g, NaClIOg,加蒸懼水至 1000ml, pH 自然(約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0% (w/v)瓊脂。
[0031]說明:以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗方法，均參照《分子克隆實(shí)驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。
[0032]實(shí)施例1:木聚糖酶基因xynAGN16的克隆
[0033]提取節(jié)桿菌基因組DNA:將液體培養(yǎng)2d的菌液離心取菌體，加入ImL溶菌酶，37°C處理 60min，再加入裂解液，裂解液組成為:50mM Tris, 20mM EDTA, NaC1500mM, 2%SDS (w/v),pH8.0, 70°C水浴裂解60min,每隔IOmin混勻一次，在4°C下1000Orpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下1000Orpm離心lOmin。棄上清,沉淀用70%的乙醇洗漆兩次,真空干燥,加入適量TE溶解，置于-20°C備用。
[0034]用超聲打斷儀Biorupter將5μ g的節(jié)桿菌基因組打斷為400 - 600bp的片段，用Genomic DNA Clean&Concentration試劑盒對打斷的DNA片段進(jìn)行純化，純化后用TureseqTM DNA Sample Preparation Kit進(jìn)行DNA片段的末端補(bǔ)平、3’端加A喊基和加接頭、及DNA片段的PCR擴(kuò)增(操作按試劑盒說明書進(jìn)行)。用MiSeq基因組測序儀(Illumima公司)對上述制備好的文庫進(jìn)行基因組測序。
[0035]基因組測序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)讀碼框預(yù)測和本地BLAST比對，得到木聚糖酶基因xynAGN16，該基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0036]實(shí)施例2:重組木聚糖酶XynAGN16的制備
[0037]以 5’CCCAAGCTTGCGTGCAGCCGGAGGAAAAACGTC3’ 和 5’ATAAGAATGCGGCCGCGTGCCTTCCGTGGTGCCGGT3’為引物對，節(jié)桿菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94°C變性 5min ;然后 94°C變性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 3min30sec，30 個循環(huán)后72°C保溫lOmin。PCR結(jié)果得到木聚糖酶基因xynAGN16，并在該基因5’和3’端分別引入了 HindIII和NotI酶切位點(diǎn)。將編碼木聚糖酶的基因xynAGN16進(jìn)行雙酶切(Hindm和NotI),同時將表達(dá)載體pET-28a ( + )進(jìn)行雙酶切(Hindm和Notl)，將上述酶切的木聚糖酶基因xynAGN16與表達(dá)載體pET_28a ( + )相連接，獲得含有木聚糖酶基因xynAGN16的重組質(zhì)粒pET-xynAGN16，將pET_xynAGN16轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌菌株BL21(DE3)/xynAGN16。
[0038]取含有重組質(zhì)粒pET-xynAGN16的重組大腸桿菌菌株BL21 (DE3)/xynAGN16，以0.1%的接種量接種于LB (含50μ g Hir1Kan)培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩16h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB (含50 μ g mLlan)培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2 - 3h(OD600達(dá)到0.6 - 1.0)后，加入終濃度0.7mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于20°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20h或26°C振蕩培養(yǎng)約8h。12000rpm離心5min，收集菌體。用適量的pH7.0Tris-HCl緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體，破碎后經(jīng)13，OOOrpm離心lOmin，吸取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。以上過程以含有載體pET-28a( + )的大腸桿菌菌株為對照{(diào)將pET_28a(+ )轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，即獲得含有載體pET-28a ( + )的大腸桿菌菌株}。SDS-PAGE結(jié)果(圖1)表明，在大約130Kda的位置，含有載體pET-28a ( + )的大腸桿菌菌體破碎上清液無條帶，而含有重組載體pET-xynAGN16的大腸桿菌菌體破碎上清液有明顯條帶；同時，含有載體pET-28a ( + )的大腸桿菌菌體破碎上清液無木聚糖酶酶活，而含有重組載體pET-xynAGN16的大腸桿菌菌體破碎上清液有木聚糖酶酶活。以上結(jié)果說明重組木聚糖酶XynAGN16在大腸桿菌中得到了表達(dá)。
[0039]實(shí)施例3:重組木聚糖酶XynAGN16的性質(zhì)測定
[0040]1、重組木聚糖酶XynAGN16的活性分析
[0041]實(shí)施例2重組木聚糖酶XynAGN16的活性測定方法采用3，5 一二硝基水楊酸(DNS)法:將底物溶于0.1M緩沖液中，使其終濃度為0.5% (w/v);反應(yīng)體系含100 μ L適量酶液，900 μ L底物；底物在反應(yīng)溫度下預(yù)熱5min后，加入酶液后再反應(yīng)lOmin，然后加1.5mL DNS終止反應(yīng)，沸水煮5min，冷卻至室溫后在540nm波長下測定OD值。I個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生I μ mol還原糖(以木糖計)所需的酶量。
[0042]2、重組木聚糖酶XynAGN16的pH活性和pH穩(wěn)定性測定:
[0043]酶的最適pH測定:將木聚糖酶XynAGN16在37°C下和0.1M pH5.0 - 12.0的緩沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的PH穩(wěn)定性測定:將酶液置于0.1M pH5.0-12.0的緩沖液中，在37°C下處理lh，然后在pH6.5及37°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。緩沖液為:0.1M McIlvaine buffer (ρΗ5.0-8.0)和 0.1Mglycine-NaOH (ρΗ9.0 - 12.0)。以山毛櫸木聚糖為底物，反應(yīng)lOmin，測定XynAGN16的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明:XynAGN16的最適pH為6.5，在pH6.0-8.0的范圍內(nèi)維持50%以上的酶活性，在pH9.0 - 11.0的范圍內(nèi)維持20%以上的酶活性(圖2);經(jīng)pH7.0 - 12.0的緩沖液處理lh，該酶酶活剩余達(dá)45%以上(圖3)。
`[0044]3、重組木聚糖酶XynAGN16的熱活性及熱穩(wěn)定性測定:
[0045]酶的最適溫度測定:在pH6.5的緩沖液中，于O - 70°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的熱穩(wěn)定性測定:將同樣酶量的酶液置于37°C、50°C和60°C中，處理O -60min后，在pH6.5及37°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。以山毛櫸木聚糖為底物，反應(yīng)lOmin，測定XynAGN16的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明:XynAGN16的最適溫度為45°C，在(TC、10°C及20°C下分別具有17.2%,27.6%和41.8%的酶活(圖4);該酶在37°C、50°C和60°C下處理lh，剩余酶活分別為52.4%、21.2%和23.3% (圖5)。該結(jié)果表明重組木聚糖酶XynAGN16具有低溫活性，同時在60°C時的熱穩(wěn)定性要優(yōu)于已報導(dǎo)的低溫木聚糖酶(專利號:ZL201010238563.6、ZL201110360254.0 和 ZL201110142556.0)
[0046]4、不同金屬離子及化學(xué)試劑對重組木聚糖酶XynAGN16活力的影響:
[0047]在酶促反應(yīng)體系中加入10.0mM的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對酶活性的影響。在37°C及pH6.5條件下，以山毛櫸木聚糖為底物測定酶活性。結(jié)果(表1)表明，10.0mM的SDS 和 HgCl2 可完全抑制 XynAGN16，AgN03、MnSO4 和 ZnSO4 對 XynAGN16 的抑制較強(qiáng)，PbAC 和FeSO4對XynAGN16的抑制較弱，其余金屬離子和化學(xué)試劑對XynAGN16的影響較小。
[0048]表1.金屬離子及化學(xué)試劑對重組木聚糖酶XynAGN16活力的影響
【權(quán)利要求】
1.一種木聚糖酶XynAGN16，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—種編碼權(quán)利要求1所述的木聚糖酶XynAGN16的木聚糖酶基因xynAGN16，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.一種包含權(quán)利要求2所述木聚糖酶基因xynAGN16的重組載體。
4.一種包 含權(quán)利要求2所述木聚糖酶基因xynAGN16的重組菌株。
【文檔編號】C12N15/56GK103834627SQ201410087811
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】黃遵錫, 周峻沛, 張蕊, 唐湘華, 李俊俊, 許波, 丁俊美, 沈驥冬, 高雅潔 申請人:云南師范大學(xué)