一種酸性β-甘露聚糖酶及其基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種酸性β-甘露聚糖酶Man5DB及其基因和應(yīng)用，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。該酶具有以下性質(zhì)：最適pH為5.0，在pH3.5-6.0范圍內(nèi)，該酶能夠維持其60%以上的酶活力；最適反應(yīng)溫度為65℃，在45℃-70℃之間能保持50%以上的酶活；該酶在37℃下處理60min后，在pH4.0-pH9.0之間能夠維持80%以上的酶活力，說明該酶具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定性；在50℃下處理60min后，酶活沒有損失，65℃處理5min仍能保持20%以上的酶活。另外，其比活力為795Umg–1。該酸性甘露聚糖酶有良好的耐熱性，可應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)性質(zhì)優(yōu)良適合工業(yè)應(yīng)用的甘露聚糖酶。
【專利說明】一種酸性β-甘露聚糖酶及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)酸性的β-甘露聚糖酶及其基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等物質(zhì)構(gòu)成。甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，是由β_1，4-?-甘露糖連接而成的線狀多聚體，在多糖的側(cè)鏈上主要有葡萄糖基、乙?；桶肴樘腔热〈鶊F(tuán)。β -甘露聚糖酶(β -mannanase EC3.2.1.78)是一種水解甘露聚糖的內(nèi)切水解酶，以內(nèi)切方式降解甘露糖主鏈β -1, 4糖苷鍵，釋放出短的β_1，4甘露寡糖。
[0003]近年來，隨著甘露寡糖生理功能的發(fā)現(xiàn)，綠色飼料的興起以及人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，能源的再生利用研究，人們對β -甘的研究和利用已進(jìn)入了一露聚糖酶個新的階段。
甘露聚糖酶已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、造紙、紡織印染、石油開采、精細(xì)化工及生物技術(shù)等諸多領(lǐng)域，是一種新型的工業(yè)酶，具有很大的潛在應(yīng)用價值。
[0004]甘露聚糖酶廣泛存在于細(xì)菌、放線菌、真菌、植物、動物等生物中。細(xì)菌來源的甘露聚糖酶主要是酸偏中性的甘露聚糖酶。其分子量多在35kDa~55kDa之間，最適反應(yīng)作用溫度為50°C~70°C。目前研究最多的是芽孢桿菌，除嗜堿性芽孢桿菌的最適作用PH達(dá)到 pH9.0以 上，大多最適反應(yīng)pH在5.5~8.0之間。真菌的β -甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大約在45kDa~ 55kDa，最適作用pH為4.0~6.0，最適作用溫度為55°C~75°C。相對細(xì)菌而言，真菌來源的甘露聚糖酶最適反應(yīng)pH值、pH穩(wěn)定性都偏低，耐熱性比細(xì)菌差。目前國內(nèi)外，雖然許多β_甘露聚糖酶被克隆分離及性質(zhì)測定，但這些酶的性質(zhì)特征，均存在一些缺陷，例如，PH作用范圍不合適，熱穩(wěn)定性差，表達(dá)量低等，均不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。因此人們希望能夠找到一種新的能夠滿足實(shí)際應(yīng)用需求的β_甘露聚糖酶，從而能夠進(jìn)一步推廣該β-甘露聚糖酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明從Staphylotrichum coccosporum NBRC31817 菌株中得到了一個新的β_甘露聚糖酶基因，其編碼的甘露聚糖酶具有以下幾個優(yōu)點(diǎn):酸性、較好的熱穩(wěn)定性、容易發(fā)酵生產(chǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)都意味著新發(fā)明的β_甘露聚糖酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中，將會更有應(yīng)用價值比以前所報道的β_甘露聚糖酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種酸性、較好的熱穩(wěn)定性的β -甘露聚糖酶。
[0007]本發(fā)明的再一目的是提供上述β_甘露聚糖酶的基因。
[0008]本發(fā)明的再一目的是提供包含上述β -甘露聚糖酶的重組載體。
[0009]本發(fā)明的再一目的是提供包含上述甘露聚糖酶基因的重組菌株。
[0010]本發(fā)明的再一目的是提供一種制備β_甘露聚糖酶的方法。
[0011]本發(fā)明的再一目的是提供上述β_甘露聚糖酶的應(yīng)用。[0012]本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用的新的甘露聚糖酶。該甘露聚糖酶ManOTB，其氣基酸序列如SEQ ID N0.1:
[0013]1MKSVTSLLLL AGAAAGQQAA YGQCGGIGYS GPSSCVSGYA CTSYNPYYYQ
[0014]51CVPGTATSAP ATTSKTSSSV KTTSTSSSVK TTSTSTVKTS TSSTKTTSST
[0015]101TAGPTATGFA KTNGLMFEID GVTKYFAGTN CYffCGFLTAN ADVDHVFADM
[0016]151AAAGFKVVRV WGFNDVNSIP GSGTVffYQYL SASGSQINTG ANGLQRMDYV
[0017]201VSSAAAHGLK LIINFVNNWN DYGGINAYVN AFGGSASTffY TNTAAQAQYQ
[0018]251KYIEAVVSRY KTSTAVFAffE LANEPRCSGC DASVIYNWAA KTSQYIKSLD
[0019]301SNHMVTI⑶E GFGPLTGGDG SYPYQAGAGG YTffVDNLNIS TLDFGTLHLY
[0020]35IPDSffGQPYSff ⑶LWVSTHAS ACVKANKPCI LEEYGGTNNC TIENPffQKTA
[0021]401LSSKGIAGDM FffQYGDTLPS CNCQTSQDGN TVFYNQGNWD CMVTQHVAAI
[0022]451NSS*
[0023]其中，該酶全長454個氨基酸，N端16個氨基酸為信號肽序列“MKSVTSLLLLAGAAAG”。
[0024]因此，成熟的β-甘露聚糖酶Man?的理論分子量為47kDa，其氨基酸序列如SEQIDN0.2:
[0025]1QQAAYGQCGG IGYSGPSSCV SGYACTSYNP YYYQCVPGTA TSAPATTSKT
[0026]51SSSVKTTSTS SSVKTTSTST VKTSTSSTKT TSSTTAGPTA TGFAKTNGLM
[0027]101FEIDGVTKYF AGTNCYffCGF LTANADVDHV FADMAAAGFK VVRVffGFNDV
[0028]151NSIPGSGTVW YQYLSASGSQ INTGANGLQR MDYVVSSAAA HGLKLIINFV
[0029]201NNWNDYGGIN AYVNAFGGSA STffYTNTAAQ AQYQKYIEAV VSRYKTSTAV
[0030]25IFAffELANEPR CSGCDASVIY NWAAKTSQYI KSLDSNHMVT I⑶EGFGPLT
[0031]301GGDGSYPYQA GAGGYTffVDN LNISTLDFGT LHLYPDSffGQ PYSffGDLffVS
[0032]351THASACVKAN KPCILEEYGG TNNCTIENPff QKTALSSKGI AGDMFffQYGD
[0033]401TLPSCNCQTS QDGNTVFYNQ GNWDCMVTQH VAAINSS*
[0034]該β -甘露聚糖酶Man5DB具有酸性的特點(diǎn)。最適pH為5.0，在ρΗ3.5_ρΗ6.0范圍內(nèi)，該酶能夠維持其60%以上的酶活力；最適溫度65°C。在50°C下處理60min，剩余酶活沒有損失，即使該酶在60°C下處理60min，依然能夠保持50%的酶活力，具有較好的穩(wěn)定性；同時高密度發(fā)酵酶活性高，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0035]本發(fā)明還提供了編碼上述甘露聚糖酶的基因。該酶的全基因序列如SEQIDN0.3 所示:
[0036]1ATGAAGTCTGTCACCTCCCTCCTCCTCCTGGCTGGCGCCGCCGCCGGCCAGCAAGCGGCC
[0037]6ITACGGACAGTGCGGCGGCATCGGCTACTCCGGCCCTTCCAGCTGCGTGTCGGGGTACGCG
[0038]121TGTACCTCGTACAACCCGTACTACTACCAGTGCGTTCCGGGGACGGCCACTTCTGCCCCG
[0039]181GCCACGACGTCAAAGACTTCGTCGAGCGTGAAGACCACCTCGACGTCTTCCTCCGTGAAG
[0040]241ACCACCTCGACGTCGACTGTCAAGACGAGCACTTCGTCGACGAAGACCACCTCGTCCACC[0041 ] 301ACTGCCGGGCCGACGGCCACAGGCTTTGCGAAGACGAATGGTCTGATGTTTGAGATTGAC
[0042]361GGCGTCACCAAGTACTTTGCGGGCACCAACTGCTACTGTTTGTCACCTCTTTCACCTCCG
【權(quán)利要求】
1.一種酸性β-甘露聚糖酶ManOTB，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQID N0.2 所示。
2.—種酸性β_甘露聚糖酶基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的一種酸性β_甘露聚糖酶ManOTB。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酸性β-甘露聚糖酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.3、SEQ ID N0.4 或 SEQ ID N0.5 所示。
4.包含權(quán)利要求2所述酸性β_甘露聚糖酶基因的重組表達(dá)載體。
5.包含權(quán)利要求2所述酸性β-甘露聚糖酶基因的重組表達(dá)載體pPIC9-manroB。
6.包含權(quán)利要求2所述酸性β-甘露聚糖酶基因的重組菌株。
7.包含權(quán)利要求2所述酸性β-甘露聚糖酶基因的重組菌株GS115/manroB。
8.一種制備酸性甘露聚糖酶ManOTB的方法，其特征在于，包括以下步驟: (O以權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞； (2)培養(yǎng)宿主細(xì)胞； (3)分離純化獲得β-甘露聚糖酶ManOTB。
9.權(quán)利要求1所 述酸性β-甘露聚糖酶ManOTB的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/19GK103834628SQ201410088929
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】姚斌, 羅會穎, 王彩虹, 黃火清, 柏映國, 石鵬君, 王亞茹, 楊培龍, 孟昆 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所