用于檢測轉(zhuǎn)mCry1Ac基因抗蟲玉米品系的引物、方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種用于檢測轉(zhuǎn)mCry1Ac基因抗蟲玉米品系的引物和探針，正向引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；反向引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；探針核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，或其互補鏈，報告熒光基團(tuán)連接在探針的5′末端，淬滅熒光基團(tuán)連接在探針的3′末端。又提供了一種檢測方法，以樣品總DNA為模板，利用上述引物和探針對其進(jìn)行實時熒光PCR擴增，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。上述引物和探針檢測特異性好，用于檢測實時熒光PCR，靈敏性高；本發(fā)明檢測方法準(zhǔn)確性高，反應(yīng)靈敏，為轉(zhuǎn)基因安全提供了保證。
【專利說明】用于檢測轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系的引物、方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于檢測轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系的引物、方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米(Zea mays L.)是重要的食物、飼料和工業(yè)原料，種植面積僅次于小麥和水稻，在世界糧食生產(chǎn)中占有重要的地位。而害蟲是造成玉米產(chǎn)量損失的主要因子之一。世界范圍內(nèi)玉米害蟲達(dá)350多種之多，其中以蛀莖性和食葉性的歐洲玉米螟和亞洲玉米螟最為嚴(yán)重。玉米螟俗名鉆心蟲，成蟲屬鱗翅目螟蛾科，為世界性的蛀食性大害蟲，影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，世界每年因蟲害造成的損失約占農(nóng)作物產(chǎn)量的15%以上。玉米螟可危害玉米植株地上的各個部位，使受害部分喪失功能，降低籽粒產(chǎn)量。目前的防治措施主要是大量使用化學(xué)殺蟲劑，這不僅嚴(yán)重影響了生態(tài)環(huán)境和生物多樣性，增加了生產(chǎn)成本和勞動強度，也加大了人體中毒幾率。解決上述問題的有效途徑之一是提高玉米本身的抗蟲性。傳統(tǒng)的育種方法由于受到多種因素的限制，很難培育出抗蟲玉米。而在這種背景下產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米則可高效專一控制玉米螟，是防治玉米螟的新途徑。常用的方法是從微生物中分離得到目的基因，通過基因槍等轉(zhuǎn)化方法將目的基因轉(zhuǎn)移到常規(guī)玉米自交系的基因組中，使之穩(wěn)定遺傳從而賦予玉米新的農(nóng)藝性狀一抗蟲性。
[0003]Bt是蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)的簡稱,是一種革蘭氏陽性土壤芽胞桿菌。該細(xì)菌產(chǎn)生的Bt殺蟲蛋白能夠破壞昆蟲腸道內(nèi)的細(xì)胞滲透壓，導(dǎo)致昆蟲死亡。Bt基因是第一代抗蟲基因的典型代表，它所表達(dá)的蛋白統(tǒng)稱為Cry晶體蛋白。根據(jù)殺蟲譜及氨基酸同源性的不同，Cry基因分為不同的類型,其中CrylAb和CrylAc基因?qū)τ衩酌洒[翅目害蟲具有專一性毒性。無論是哪種來源的抗蟲基因用于基因工程，首要考慮的問題就是提高其表達(dá)量。一般來說，表達(dá)量越`高，抗蟲效果就越好。早期的轉(zhuǎn)抗蟲基因植物的殺蟲蛋白在植株上的表達(dá)量很低(占全部可溶性蛋白的0.001%以下)，抗蟲效果不理想。從已有的研究結(jié)果來看，通過對Cry基因的修飾與改造，轉(zhuǎn)Bt基因的作物可以獲得較好的抗蟲效果。
[0004]隨著轉(zhuǎn)基因作物的商品化發(fā)展，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的安全性問題，即它對環(huán)境保護(hù)、生態(tài)平衡存在潛在的危害，以及由它加工而成的轉(zhuǎn)基因食品中含有新的遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)而引起的食用安全性受到越來越廣泛地關(guān)注。目前世界上大多數(shù)國家如歐盟、俄羅斯、日本、韓國、澳大利亞、新西蘭等國主張對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品加貼限量標(biāo)簽，即規(guī)定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的顆粒比超過一定閾值(如1%，即100粒中有I粒為轉(zhuǎn)基因玉米)則需有強制性標(biāo)識。我國于2001年5月23日頒布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例，強調(diào)了對轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的管理與控制。不論是對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)注管理，或是對轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因原料的分別輸送，轉(zhuǎn)基因原料和食品的分析檢測技術(shù)是必不可少的更具有現(xiàn)實意義和應(yīng)用前景，這是對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行安全性評價和實施監(jiān)管的基礎(chǔ)。[0005]賴錦盛等對CrylAc基因進(jìn)行了優(yōu)化改造,通過基因槍共轉(zhuǎn)化的方法把mCryIAc基因轉(zhuǎn)入到具有高轉(zhuǎn)化效率的玉米自交系HiIIA和HiIIB的雜交組合中，用篩選標(biāo)記基因bar進(jìn)行篩選。通過實驗研究、中間試驗及環(huán)境釋放對獲得的轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行分子水平、蛋白水平及田間抗蟲性鑒定，將抗性優(yōu)良的轉(zhuǎn)化事件與鄭58進(jìn)行多代回交及自交，最終篩選出I個優(yōu)良轉(zhuǎn)基因品系BT-799。實驗結(jié)果顯示在分子水平轉(zhuǎn)基因株系的后代能夠穩(wěn)定遺傳抗蟲基因mCrylAc，每個世代均表達(dá)目標(biāo)蛋白且世代間表達(dá)量基本一致，從田間抗蟲性來看每代均有明顯的抗蟲性，抗蟲等級基本一致。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系的引物和探針，
[0007]其正向引物核苷酸序列為:Bt-799-F:5' -GGAACAAACGATGA TTCA-3 ' (SEQ IDN0.1)；
[0008]其反向引物核苷酸序列為:Bt-799-R:5' -CTTCCCTTTTAGTTG TGTC-3' (SEQ IDN0.2)；
[0009]其探針核苷酸序列為:Bt-799-P:5' -AGCCTCTCATTTTCTTCTT TGAGCT-3' (SEQ IDN0.3)或其互補鏈，報告熒光基團(tuán)連接在探針的5,末端，淬滅熒光基團(tuán)連接在探針的3,末端。
[0010]PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴增時，Taq酶的5' — 3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。通過這種方法，能夠檢測到樣品中是否有轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系Bt_799。
[0011]優(yōu)選的，所述報告熒光基`團(tuán)為Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、Cy3或Cy5 ;所述淬滅突光基團(tuán)為 Tamra、Rox> Dabcy、Bhql 或 Bhq2。
[0012]本發(fā)明的又一目的在于提供一種含有上述引物和探針的試劑盒。
[0013]本發(fā)明的又一目的在于提供一種用于檢測轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系的方法，以樣品總DNA為模板，利用上述引物和探針，或者上述試劑盒對其進(jìn)行實時熒光PCR擴增，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。
[0014]測試樣品外源基因檢測Ct值在36~40之間，應(yīng)調(diào)整模板濃度，重做實時熒光PCR0再次擴增后的外源基因檢測Ct值仍小于40，則可判定為該樣品含有所檢的外源基因。再次擴增后的外源基因檢測Ct值大于或等于40，則可判定為該樣品不含所檢的外源基因。
[0015]優(yōu)選的，本發(fā)明以樣品總DNA為模板進(jìn)行實時熒光PCR擴增的優(yōu)化體系為25 μ 1，反應(yīng)條件為Mixl2.5μ 1，引物終濃度0.2ymol/L，探針終濃度為0.lymol/L。所用Taq DNA聚合酶及其緩沖液為 AB TaqMan Gene Expression Master Mix。
[0016]優(yōu)選的，PCR反應(yīng)參數(shù)為 95°C 30sec ；95°C 5sec、60°C 30sec，共 4 個循環(huán)。
[0017]優(yōu)選的，實時熒光PCR的反應(yīng)過程中的退火溫度為55°C。
[0018]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所述引物、探針是根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米品系側(cè)翼序列設(shè)計的，檢測特異性好，用于檢測實時熒光PCR，靈敏性高。本發(fā)明檢測方法準(zhǔn)確性高，反應(yīng)靈敏，可以快速檢測樣品是否含有轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系Bt_799，為轉(zhuǎn)基因安全提供了保證。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖lBt-799實時熒光PCR檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0020]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0021 ] 實施例1樣品總DNA的提取
[0022]1.取樣品葉片約0.1g于研缽中，加入液氮迅速研磨至粉末狀。
[0023]2.將葉片粉末迅速轉(zhuǎn)入到事先加入700 μ I CTAB緩沖液的2ml離心管中，輕輕混勻后，65°C水浴保溫30分鐘。每隔十分鐘小心搖晃混勻。
[0024]3.取出離心管，待冷至室溫后(25°C)，加入等體積酚(350μ I)/氯仿(350μ I)700 μ L.上下顛倒充分混合，抽提5分鐘。
[0025]4.室溫下，12000rpm離心10分鐘,用剪去頭部的Iml槍頭將上清轉(zhuǎn)移到另一個新的離心管中。加 2μ1 RNaseA (10mg/ml)。
[0026]5.加入與上清等體積的的氯仿700μ 1，上下顛倒充分混合，抽提5分鐘。
[0027]6.室溫下，12000rpm離心10分鐘，吸取上清到另一新的離心管中。
[0028]7.加入等體積的異丙醇(700 μ I),充分混勻，常溫放置10分鐘后可見沉淀。為沉淀完全，可在_20°C放置I~2小時。`
[0029]8.室溫下，12000rpm離心10分鐘，沉淀積于管底。棄盡上清液。
[0030]9.加入700 μ 170%乙醇清洗30分鐘。
[0031]10.倒去離心管中的乙醇，使DNA沉淀在管中自然晾干。
[0032]11.加入適量TE (50 μ I)溶解，放入_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0033]實施例2引物探針設(shè)計
[0034]在獲得外源基因轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系Bt_799全序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計一對轉(zhuǎn)基因玉米Bt-799外源基因Bt-799檢測PCR弓丨物和TaqMan探針。設(shè)計軟件用Primer5.0。引物序列為:
[0035]Bt-799-F (正向):5' -GGAACAAACGATGATTCA-3'；
[0036]Bt-799-R (反向):5' -CTTCCCTTTTAGTTGTGTC-3'；
[0037]Bt-799-P (探針):5' -FAM-AGCCTCTCATTTTCTTCTTTGAGC T-Eclipse-3'。
[0038]所用探針5'端用報告熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記，3'端用淬滅熒光基團(tuán)Eclipse標(biāo)記。
[0039]實施例3實時熒光PCR擴增方法的建立
[0040]1.實時熒光PCR反應(yīng)體系
[0041]以樣品總DNA為模板進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，優(yōu)化后的實時熒光PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，反應(yīng)條件為Mixl2.5μ 1，引物終濃度0.2ymol/L，探針終濃度為0.1 μ mol/L。
[0042]2.實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)
[0043]實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為95°C 30sec ；95°C 5sec、60°C 30sec，共4個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。[0044]實施例4轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系Bt_799的特異性檢測
[0045]以轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系Bt_799 (GM0+)、非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58 (GM0-)、轉(zhuǎn)基因番茄(華番I號)、轉(zhuǎn)基因水稻Bt63、轉(zhuǎn)基因棉花(轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因)及轉(zhuǎn)基因玉米Mon810、Mon88017、nk603、油菜RT73、T45、、大豆GST40-3-2的總DNA為模板，進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，檢測引物探針的特異性。
[0046]如圖1所示，基線以下為陰性對照:Bt63、KF6號、華番I號、Mon810、Mon88017、nk603、油菜RT73、T45、大豆GST40-3-2，檢測轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系Bt-799的引物探針只在品系Bt-799有信號，在其它材料中均無信號。
[0047]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、【具體實施方式】及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。`
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系的引物和探針，其特征在于， 其正向引物核苷酸序列為:Bt-799-F:5' -GGAACAAACGATGA TTCA-3' (SEQ ID N0.1)； 其反向引物核苷酸序列為:Bt-799-R:5 ' -CTTCCCTTTTAGTTG TGTC-3 ' (SEQ IDN0.2)； 其探針核苷酸序列為:Bt-799-P:5' -AGCCTCTCATTTTCTTCTT TGAGCT-3 ' (SEQ IDN0.3)或其互補鏈，報告熒光基團(tuán)連接在探針的5,末端，淬滅熒光基團(tuán)連接在探針的3,末端。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物和探針，其特征在于，所述報告熒光基團(tuán)為Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、Cy3 或 Cy5 ;所述淬滅突光基團(tuán)為 Tamra> Rox> Dabcy、Bhql 或 Bhq2。
3.含有權(quán)利要求1或2所述的引物和探針的試劑盒。
4.一種用于檢測轉(zhuǎn)mCrylAc基因抗蟲玉米品系的方法，其特征在于，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求1或2所述的引物和探針，或者權(quán)利要求3所述的試劑盒對其進(jìn)行實時熒光PCR擴增，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果，測試樣品外源基因檢測Ct值大于或等于40，內(nèi)源基因檢測Ct值小于或等于24，則可判定該樣品不含所檢的外源基因；測試樣品外源基因檢測Ct值小于或等于36，判定該樣品含有所檢的外源基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)參數(shù)為95°C30sec ；95°C 5sec、60°C 30sec，共4個 循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，實時熒光PCR的反應(yīng)過程中的退火溫度為55。。。
【文檔編號】C12N15/11GK103882126SQ201410090599
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】付偉, 杜智欣, 彭萱子, 賴錦盛, 朱水芳 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院