嗜鹽混合菌以葡萄糖為底物一步連續(xù)生產(chǎn)phbv的方法
【專利摘要】嗜鹽混合菌以葡萄糖為底物一步連續(xù)生產(chǎn)PHBV的方法，屬于PHBV生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】。采集入?？诘啄嘟臃N在發(fā)酵罐中；然后采用間歇操作方式運行發(fā)酵罐，向發(fā)酵罐勻速注入空氣，控制底物溶液中的溶解氧濃度在1-3mg/L。連續(xù)運行5-8小時。發(fā)酵罐操作條件為：發(fā)酵罐恒溫37±0.1℃，pH=6-8；排除發(fā)酵罐中75%的混合液。如此連續(xù)重復(fù)使PHBV的質(zhì)量百分含量達到30%以上，回收排除混合液中生物質(zhì)，提取PHA。本發(fā)明實現(xiàn)簡單，易于工程操作。生產(chǎn)出的PHA為PHBV共聚物，其具有高分解溫度低熔點溫度。該方法降低PHA生產(chǎn)成本達到20-30%。
【專利說明】嗜鹽混合菌以葡萄糖為底物一步連續(xù)生產(chǎn)PHBV的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用微生物生產(chǎn)胞內(nèi)聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)的方法，尤其是以嗜鹽混合菌為生產(chǎn)者代謝葡萄糖生物一步合成生產(chǎn)PHBV的方法。該方法可以降低PHBV的生產(chǎn)成本，屬于PHBV生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]全球范圍內(nèi)，由于各行業(yè)大量地使用塑料用品塑料廢物的積累對環(huán)境產(chǎn)生了嚴重的威脅。為了應(yīng)對這個問題，生產(chǎn)生物可降解材料替代以石油為原料生產(chǎn)的塑料成為可持續(xù)性地解決這一問題的關(guān)鍵。聚羥基脂肪酸脂(PHA)是典型的環(huán)境友好材料，可以100%的生物降解。PHA可以被很多微生物作為碳源和能源儲存，被認為是可以替代以石油為原材料生產(chǎn)塑料的重要生材料。目前，商業(yè)生產(chǎn)PHA多以純菌發(fā)酵進行。該方法生產(chǎn)PHA的成本高限制了其廣泛的市場和商業(yè)應(yīng)用。在影響微生物生產(chǎn)PHA的成本因素中，底物成本、細胞內(nèi)PHA含量和后續(xù)PHA提取方法是最主要的因素。為了降低PHA的成本，需要使用廉價的底物并從工藝角度提高細胞內(nèi)PHA含量。以混合菌代替純菌生產(chǎn)PHA可以擴展對底物的選擇范圍，從而突破純菌以乙酸為底物生產(chǎn)PHA的限制，選擇更多廉價有機物甚至廢棄物降低生產(chǎn)成本。
[0003]嗜鹽微生物是一類生長在鹽湖，鹽田及曬鹽場等高鹽環(huán)境中的微生物。嗜鹽微生物在長期高鹽壓力的演化中形成了適應(yīng)環(huán)境脅迫的特殊細胞結(jié)構(gòu)、生理機能、遺傳基因和適應(yīng)機制。嗜鹽微生物具有PHA積累的能力，這可能是其在長期特殊生境中適應(yīng)環(huán)境一種生理機制。由于嗜鹽微生物生長環(huán)境中高鹽濃度可以阻止其他非嗜鹽微生物的生長，因此其可以減少滅菌程序，實現(xiàn)開放式PHA生產(chǎn)。目前，商業(yè)生產(chǎn)PHA需要嚴格的滅菌程序。以嗜鹽微生物作為生產(chǎn)者 生產(chǎn)PHA可以免除滅菌程序，降低生產(chǎn)成本。此外,使用嗜鹽微生物生產(chǎn)PHA在內(nèi)聚物回收上也具有顯著的成本優(yōu)勢。由于嗜鹽微生物高的內(nèi)部滲透壓，一旦進入淡水系統(tǒng)就會迅速導(dǎo)致細胞壁的破裂，實現(xiàn)快速的PHA釋放。為此，利用嗜鹽微生物生產(chǎn)PHA可以實現(xiàn)低成本的回收程序，進一步降低PHA提取成本。
[0004]在以混合菌生產(chǎn)PHA的生產(chǎn)工藝方面，目前普遍采用兩步法實現(xiàn)PHA的生產(chǎn)。兩步法生產(chǎn)工藝包括高聚PHA菌群篩選和PHA生產(chǎn)兩個步驟。在這兩個步驟中，分別采用不同的底物完成各自的目標(biāo)。盡管兩步法可以增加PHA的產(chǎn)量，但是該工藝無法實現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)和操作。由于每個過程中復(fù)雜的工藝要求，工藝控制復(fù)雜成為該方法的主要障礙。如果將兩步法變成一步法，即種群富集和PHA生產(chǎn)在一個反應(yīng)器內(nèi)以相同底物完成，將突破生產(chǎn)上的這些障礙。為此,尋求一種簡單地、可操作地、有效地微生物生產(chǎn)胞內(nèi)共聚物PHBV的方法，降低PHA生產(chǎn)成本成為一種亟待解決技術(shù)需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡單地、可操作地、有效地利用嗜鹽混合菌作為生產(chǎn)者以葡萄糖為底物合成生產(chǎn)PHBV的方法。該方法最大可能地降低了 PHA生產(chǎn)成本，并提高生產(chǎn)方法的可操作性。
[0006]嗜鹽混合菌以葡萄糖為底物一步連續(xù)生產(chǎn)PHBV的方法，主要包括以下步驟:
[0007]步驟1，采集嗜鹽混合菌接種在發(fā)酵罐中，然后向發(fā)酵罐中注滿底物水溶液；
[0008]步驟2，采用間歇操作方式運行發(fā)酵罐，啟動發(fā)酵罐的曝氣裝置，向發(fā)酵罐內(nèi)勻速注入空氣，控制底物溶液中的溶解氧濃度在l_3mg/L，連續(xù)運行5-8小時，發(fā)酵罐操作條件為:發(fā)酵罐恒溫37±0.10C, pH=6-8 ；
[0009]步驟3，排除發(fā)酵罐中75%的混合液；
[0010]步驟4，向發(fā)酵罐中注滿底物水溶液；
[0011]步驟5，重復(fù)步驟2-步驟4直到微生物細胞中PHBV的質(zhì)量百分含量達到30%以上；
[0012]步驟6，繼續(xù)連續(xù)重復(fù)步驟2-步驟4，對步驟5之后每次排除的發(fā)酵液進行離心，收集離心后的微生物，提取PHBV。
[0013]本發(fā)明基于的硬件系統(tǒng)為公知的商業(yè)發(fā)酵罐。所述的嗜鹽混合菌以接種河口底泥發(fā)展形成嗜鹽混合菌，將?？诘啄嘀苯咏臃N到發(fā)酵罐中。
[0014]發(fā)酵底物水溶液的成分配比:每升底物水溶液含:1.5g葡萄糖，30.0gNaCl，45.0mg MgCl2.6H20,113.3mg NH4Cl, 26.0mg KH2PO4, 7.6mg KCl，3.0mg FeSO4.7Η20,1.5mgZnSO4.7Η20，8.0mg CaCl2.2Η20,1.2mg MnSO4.H2O, 20.0mg 硫脲，余量為水。
[0015]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0016](I)以一步法完成高聚PHA能力的菌群的富集和PHBV的生產(chǎn)，操作簡單；
[0017](2)以嗜鹽混合微生物作為生產(chǎn)者，提高了 PHBV的細胞內(nèi)含量和產(chǎn)率；
[0018](3)該方法采用葡萄糖為底物開放式連續(xù)生產(chǎn)降低了 PHBV的生產(chǎn)成本，可以一直循環(huán)收集離心后的微生物和提取PHBV ；
[0019](4)生產(chǎn)的PHA為PHBV共聚物，增加其下游的商業(yè)利用價值。
[0020]本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)為:
[0021]1、相比較淡水微生物生產(chǎn)PHBV，本發(fā)明構(gòu)建的方法可以降低PHBV生產(chǎn)成本達20-30%ο
[0022]2、本發(fā)明構(gòu)建的一步法生產(chǎn)工藝將菌群篩選和PHBV生產(chǎn)聯(lián)合在一起，減少人員的工作，程序簡單便于操作和工程化。
[0023]3、該方法運行穩(wěn)定，PHBV產(chǎn)率高。其和淡水生產(chǎn)者相比，產(chǎn)生的PHBV不依賴前體物的投加，本發(fā)明實現(xiàn)簡單，易于工程操作。生產(chǎn)出的PHA為PHBV共聚物，其具有高分解溫度低溶點溫度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1:嗜鹽混合菌以葡萄糖為底物一步連續(xù)生產(chǎn)PHBV的方法圖框。
【具體實施方式】 說明和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0026]實施例1[0027]在一個容積2L的發(fā)酵罐內(nèi)，利用上述方法生產(chǎn)PHBV，【具體實施方式】:
[0028]步驟I，在河北省秦皇島市湯河河口采集河口底泥，采樣地點位于渤海600米處。采集的底泥經(jīng)過去除沙粒后，接種到發(fā)酵罐內(nèi)。向發(fā)酵罐里注入底物水溶液至2L，接種物濃度為 0.102g/L ；
[0029]步驟2，將發(fā)酵罐的溫度控制在37±0.10C, pH=7.2。打開曝氣裝置向發(fā)酵罐內(nèi)通入空氣，使發(fā)酵罐內(nèi)混合液中的溶解氧維持在2mg/L。連續(xù)曝氣運行6小時，停止曝氣；
[0030]步驟3，排除混合液1.5L，剩余0.5L用于下次發(fā)酵；
[0031]步驟4，再次向發(fā)酵罐內(nèi)注入1.5L底物，
[0032]步驟5，重復(fù)步驟2-480次，反應(yīng)液中PHBV的質(zhì)量百分含量不低于30% ；
[0033]步驟6，繼續(xù)連續(xù)重復(fù)步驟2-4176次；對步驟5以后每次排除的1.5L發(fā)酵液進行高速離心。收集離心后的微生物用于PHBV的提取。
[0034]本實施例中底物中使用的所有化學(xué)試劑均為化學(xué)純級。
[0035]按照上述步驟生產(chǎn)的PHBV的最大產(chǎn)率為3.36g PHBV/ (L.d)，最終混合菌最大污泥濃度3.2g/L，細胞內(nèi)PHBV平均含量為35%細胞干重。生產(chǎn)出的PHBV中戊酸脂單體(HV)含量為33-50%。 生產(chǎn)出的PHBV的熔點溫度是153°C，熱分解溫度為251_276°C。
【權(quán)利要求】
1.嗜鹽混合菌以葡萄糖為底物一步連續(xù)生產(chǎn)PHBV的方法，其特征在于，主要包括以下步驟: 步驟1，采集嗜鹽混合菌接種在發(fā)酵罐中，然后向發(fā)酵罐中注滿底物水溶液； 步驟2，采用間歇操作方式運行發(fā)酵罐，啟動發(fā)酵罐的曝氣裝置，向發(fā)酵罐內(nèi)勻速注入空氣，控制底物溶液中的溶解氧濃度在l_3mg/L，連續(xù)運行5-8小時，發(fā)酵罐操作條件為:發(fā)酵罐恒溫 37±0.10C, pH=6-8 ； 步驟3，排除發(fā)酵罐中75%的混合液； 步驟4，向發(fā)酵罐中注滿底物水溶液； 步驟5，重復(fù)步驟2-步驟4直到微生物細胞內(nèi)PHBV的質(zhì)量百分含量達到30%以上；步驟6，繼續(xù)連續(xù)重復(fù)步驟2-步驟4，對步驟5之后每次排除的發(fā)酵液進行離心，收集離心后的微生物，提取PHBV。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，每升底物水溶液含:1.5g葡萄糖，30.0g NaCl,45.0mg MgCl2.6H20,113.3mg NH4Cl, 26.0mg KH2PO4, 7.6mg KCl，3.0mg FeSO4.7Η20,1.5mgZnSO4.7Η20，8.0mg CaCl2.2Η20,1.2mg MnSO4.H2O, 20.0mg 硫脲，余量為水。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的嗜鹽混合菌以接種河口底泥發(fā)展形成嗜鹽混合菌, 將?？诘啄嘀苯咏臃N到發(fā)酵罐中。
【文檔編號】C12P7/62GK103865960SQ201410093245
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】崔有為, 盧鵬飛, 彭永臻 申請人:北京工業(yè)大學(xué)