常溫下對(duì)目標(biāo)dna序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法。利用Lambda外切酶與雙標(biāo)記熒光核酸探針建立DNA信號(hào)放大體系，并利用熒光標(biāo)記基團(tuán)及其5’鄰位共存的錯(cuò)配堿基協(xié)同作用，加快Lambda外切酶的反應(yīng)速率。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在常溫條件下，快速、高靈敏、高特異性地對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)規(guī)?；⒆詣?dòng)化檢測(cè)提供了便利。同時(shí)，本方法除了可以單獨(dú)使用進(jìn)行信號(hào)放大檢測(cè)外，還可以與其他基于模板擴(kuò)增的DNA放大技術(shù)如滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）和選擇性PCR等聯(lián)合使用，滿足各種DNA檢測(cè)的需求。
【專利說(shuō)明】常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及DNA序列檢測(cè)領(lǐng)域，包括微量DNA的定量檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型以及低豐度點(diǎn)突變檢測(cè)等【技術(shù)領(lǐng)域】。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明利用Lambda外切酶與雙標(biāo)記熒光核酸探針建立DNA信號(hào)放大體系，在常溫條件下，快速、高靈敏、高特異性地對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA信號(hào)放大，是指通過(guò)生物化學(xué)反應(yīng)使單個(gè)目標(biāo)DNA序列產(chǎn)生多倍的信號(hào)，從而提聞對(duì)目標(biāo)DNA序列的檢測(cè)靈敏度。當(dāng)彳目號(hào)放大體系可以對(duì)目標(biāo)DNA序列和與之有單喊基差異的干擾DNA序列進(jìn)行選擇性區(qū)分并使二者的信號(hào)放大倍數(shù)不同時(shí)，則可以實(shí)現(xiàn)二者信號(hào)差值的放大，從而實(shí)現(xiàn)SNP分型及低豐度點(diǎn)突變的檢測(cè)。[0003]目前已經(jīng)發(fā)展了以限制性內(nèi)切酶、核酸外切酶II1、核酸內(nèi)切酶IV、DNA酶等為基礎(chǔ)的DNA信號(hào)放大體系，這些體系均使用DNA作為探針，利用DNA雙鏈的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行特異性地識(shí)別。
[0004]基于限制性內(nèi)切酶的DNA信號(hào)放大體系，檢測(cè)限可以達(dá)到6.5pM (200yL體系)(Li, J.J., Chu, Y., Lee, B.Y., andXie, X.S..Enzymatic signal amplificationof molecular beaconsfor sensitive DNA detection.Nucleic Acids Res.(2008),36:e36.)。但該方法對(duì)要求目標(biāo)DNA序列中存在限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)。由于限制性內(nèi)切酶活性的限制，以及為了使切割后產(chǎn)生的短鏈片段更易離去，反應(yīng)需要在55°C下進(jìn)行。該體系對(duì)于目標(biāo)DNA序列和與之有單堿基差異的干擾DNA序列的區(qū)分度為3-76倍，其中高倍數(shù)的區(qū)分度要求堿基錯(cuò)配位置鄰近有限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。
[0005]基于核酸外切酶III的DNA信號(hào)放大體系，在37 °C下反應(yīng)30min，檢測(cè)限可以達(dá)到20pM (50 μ L體系)；在4 °C條件下反應(yīng)24h，其檢測(cè)限可以達(dá)到20aM(Zuo,X.,Xia,F., Xiao,Y., and Plaxco, K.ff..Sensitive and Selective AmplifiedFluorescence DNA Detection Based onExonuclease Ill-Aided Target Recycling.J.Am.Chem.Soc.(2010)，132:1816-1818.)。但核酸外切酶III放大體系對(duì)于識(shí)別匹配與單堿基錯(cuò)配DNA序列的區(qū)分度為不足1.5倍。
[0006]基于DNA酶的DNA信號(hào)放大體系，可以實(shí)現(xiàn)在25°C下的反應(yīng)，其檢測(cè)限為InM。通過(guò)對(duì)分子信標(biāo)序列的設(shè)計(jì)，可以使體系實(shí)現(xiàn)指數(shù)放大，使檢測(cè)限達(dá)到ΙρΜ。但整個(gè)反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá) 14h (Wang, F.，Elbazj J.，Teller, C.，and Willnerj 1..Amplified Detection of DNAthrough an Autocatalytic and CatabolicDNAzyme-Mediated Process.Angew.Chem.1nt.Ed.(2011)，50:295-299.)。
[0007]基于核酸內(nèi)切酶IV的DNA信號(hào)放大體系，檢測(cè)限可以達(dá)到60pM (50 μ L體系，檢測(cè)時(shí)間 50min) (Xiao, X., Song, C., Zhang, C., Suj X., andZhaoM..Ultra-selectiveand sensitive DNA detection by a universalapurinic/apyrimidinic probe-basedendonuclease IV signalamplification system.Chem.Commun.(2012)，48:1964-1966.)。當(dāng)引入內(nèi)切酶IV對(duì)切割位點(diǎn)兩側(cè)堿基錯(cuò)配的識(shí)別作用，并結(jié)合溫度對(duì)匹配鏈與錯(cuò)配鏈穩(wěn)定性的影響時(shí)，對(duì)于完全匹配與單堿基錯(cuò)配DNA序列的區(qū)分能力可達(dá)99-860倍，對(duì)于點(diǎn)突變的檢測(cè)靈敏度可達(dá) 0.01%-0.1% (Xiao, X., Liu, Y., andZhaoM..EndonucleaseIV discriminates mismatches next to theapurinic/apyrimidinic site in DNAstrands:constructingDNA sensing platforms with extremely highselectivity.Chem.Commun.，2013, 49，2819— 2821.)。但該放大體系需要對(duì)溫度進(jìn)行精確的優(yōu)化和控制，且需要在較高溫度下(>50°C)進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)于分析儀器的要求較高。當(dāng)不耦合溫度的影響，僅依靠?jī)?nèi)切酶IV本身識(shí)別錯(cuò)配堿基的性質(zhì)時(shí)，除C:C錯(cuò)配區(qū)分度可達(dá)179倍外，其他類型的堿基錯(cuò)配區(qū)分度僅為3.11-18.9倍。
[0008]基于核酸內(nèi)切酶IV/Lambda外切酶聯(lián)用的DNA信號(hào)放大體系，可以在37 °C下進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)限可達(dá)20pM (50 μ L體系)，對(duì)于匹配與單堿基錯(cuò)配DNA序列的區(qū)分能力為14-18倍，對(duì)于點(diǎn)突變的檢測(cè)最佳靈敏度可達(dá)0.5% (Xiao, X.，Zhang, C.，Su, X.，Song, C.,andZhaoM..A universal mismatch-directed signal amplification platform forultra-selectiveand sensitive DNA detection under mild isothermal conditions.Chem.Sc1.(2012),3:2257-2261.)。但該方法需要兩種酶的配合，體系較為復(fù)雜。另外在探針中需設(shè)計(jì)脫堿基位點(diǎn)，一方面使得探針自身的穩(wěn)定性下降，另一方面使得成本提高。更為重要的是，本發(fā)明在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脫堿基位點(diǎn)的5’鄰位為G堿基時(shí)，探針本身會(huì)被內(nèi)切酶IV緩慢切割，使熒光背景信號(hào)上升，影響檢測(cè)的靈敏度。
[0009]綜上所述，目前已報(bào)道的各種基于核酸酶的DNA信號(hào)放大體系大多數(shù)都較為復(fù)雜，需要通過(guò)精確控溫或耦合其他放大技術(shù)才能達(dá)到較高的靈敏度和對(duì)單堿基干擾DNA序列的區(qū)分能力。此外，分析時(shí)間還需縮短，檢測(cè)成本也有待進(jìn)一步降低，使方法能滿足疾病早期診斷和相關(guān)生命科學(xué)研究的需求，成為可廣泛使用的常規(guī)檢測(cè)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種可以在常溫條件下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行快速、高選擇性信號(hào)放大的方法，用于微量DNA的定量分析、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型以及低豐度點(diǎn)突變檢測(cè)等。
[0011]Lambda外切酶能特異性地識(shí)別雙鏈DNA的5’ -PO4末端，并從5’ -PO4末端開(kāi)始，連續(xù)性地切割其所在單鏈，釋放出5’ -單核苷酸。對(duì)于含5’ -PO4末端的單鏈DNA或5’末端非磷酸化的單鏈或雙鏈DNA，Lambda外切酶的水解效率都很低。本發(fā)明在研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雙鏈DNA中存在錯(cuò)配堿基時(shí)，Lambda外切酶可以對(duì)其進(jìn)行選擇性識(shí)別，表現(xiàn)為切割速率隨錯(cuò)配位置的不同而有規(guī)律地變化。當(dāng)錯(cuò)配堿基的鄰位有標(biāo)記基團(tuán)時(shí)，切割速率的變化更為明顯。
[0012]利用上述性質(zhì)，本發(fā)明設(shè)計(jì)針對(duì)目標(biāo)DNA序列的特異性雙標(biāo)記熒光探針，采用如下技術(shù)方案，在常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行快速、高選擇性信號(hào)放大和檢測(cè)。具體包括以下步驟:
[0013]I)設(shè)計(jì)合成含有5’ -PO4末端的雙標(biāo)記單鏈熒光核酸探針，構(gòu)建基于Lambda外切酶的信號(hào)放大體系。探針標(biāo)記熒光基團(tuán)(F)和猝滅基團(tuán)(Q)，其中熒光基團(tuán)靠近5’末端，并與5’末端相隔至少一個(gè)核苷酸，與3’末端的距離在十個(gè)核苷酸以上；猝滅基團(tuán)可標(biāo)記在靠近3’末端并與熒光基團(tuán)相隔七個(gè)核苷酸以上的任意位置。由于熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)之間存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)作用，使得該探針在初始狀態(tài)下熒光猝滅。
[0014]2)將上述探針與含目標(biāo)DNA序列的待測(cè)體系混合后，加入Lambda外切酶，在常溫(25°C_37°C間均可)下反應(yīng)。其中，探針相對(duì)目標(biāo)DNA序列應(yīng)大大過(guò)量，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大；Lambda外切酶的加入量沒(méi)有明確的限制，考慮到反應(yīng)時(shí)間和成本，推薦使其在體系中的終濃度為0.01-0.2U/ μ L0探針與該目標(biāo)DNA序列所形成的雙鏈DNA被Lambda外切酶識(shí)別，含有5’ -PO4末端的探針單鏈被Lambda外切酶逐步水解，當(dāng)標(biāo)記熒光基團(tuán)的核苷酸被切割離開(kāi)探針后，熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系被破壞，釋放出熒光信號(hào)。由于探針被水解后，目標(biāo)DNA序列仍保持完整，可以與新的探針?lè)肿咏Y(jié)合形成雙鏈，繼續(xù)被Lambda外切酶識(shí)別和切割，此過(guò)程不斷循環(huán)從而實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的放大。整個(gè)信號(hào)放大過(guò)程的原理參見(jiàn)附圖1所示。
[0015]進(jìn)一步地，本發(fā)明在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了 Lambda外切酶一系列新穎的性質(zhì)。附圖2a)顯示了實(shí)驗(yàn)所用的幾種主要探針的基本設(shè)計(jì)。下文中N3-F15探針指距5’ -PO4末端第3位上無(wú)標(biāo)記基團(tuán)(N)，在第15位上標(biāo)記熒光基團(tuán)(F)，在3’末端標(biāo)記猝滅基團(tuán)(Q)；D3-F15探針指距5’ -PO4末端第3位上標(biāo)記地高辛(D)，第15位上標(biāo)記熒光基團(tuán)(F)，3’末端標(biāo)記猝滅基團(tuán)(Q) ；F3-N15探針指距5’ -PO4末端第3位上標(biāo)記熒光基團(tuán)(F)，第15位上無(wú)標(biāo)記基團(tuán)(N), 3’末端標(biāo)記粹滅基團(tuán)(Q)。通常情況下，當(dāng)DNA底物序列中存在錯(cuò)配喊基時(shí),Lambda外切酶的水解速率會(huì)減慢(LeeG., YooJ., LeslieB.J.andHaT., Single-moleculeanalysis reveals three phases of DNAdegradation by an exonuclease.Nat.Chem.Biol.(2011)，7:367-374)。但在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA底物中5’_P04末端所在單鏈中有標(biāo)記基團(tuán)(如熒光基團(tuán)、地高辛基團(tuán)等)且其5’鄰位為錯(cuò)配堿基時(shí)，Lambda外切酶的水解速率不僅沒(méi)有減慢，反而明顯加快。具體數(shù)據(jù)和分析如下:
[0016](1)參見(jiàn)圖3a)所示,探針N3-F15與在不同位置有單堿基錯(cuò)配的目標(biāo)DNA鏈雜交時(shí)，Lambda外切酶水解反應(yīng)熒光上升速率的變化?？梢钥吹?，當(dāng)探針中的熒光基團(tuán)標(biāo)記在距5’ -PO4末端第15位的堿基上時(shí)，與完全匹配的底物雙鏈(O號(hào)樣)相比，在14位有單堿基錯(cuò)配時(shí)，熒光上升速率顯著加快。
[0017](2)如圖3b)所示探針F3-N15的測(cè)定結(jié)果，將熒光基團(tuán)標(biāo)記改在距5’ -PO4末端第3位的堿基上，當(dāng)2位有單堿基錯(cuò)配時(shí)，熒光上升速率顯著加快。
[0018]以上兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示，當(dāng)標(biāo)記基團(tuán)5’鄰位有單錯(cuò)配堿基時(shí)，熒光上升速率是5’鄰位匹配探針的1.8-2.0倍。
[0019](3)如圖3c)所示探針D3-F15的測(cè)定結(jié)果，該探針只比N3-F15探針在距5’ -PO4末端第3位的堿基上多標(biāo)記了一個(gè)地高辛的結(jié)構(gòu)，其余標(biāo)記和序列完全一致。對(duì)比探針N3-F15和D3-F15與全匹配目標(biāo)序列(O號(hào)樣)結(jié)合后的反應(yīng)速率可以看到，3位標(biāo)記地高辛基團(tuán)本身并未使Lambda外切酶水解反應(yīng)速率加快，反而略有減慢。當(dāng)其5’鄰位(即2位)為錯(cuò)配堿基時(shí)，反應(yīng)速率比全匹配的序列有所加快。而當(dāng)目標(biāo)序列14位為錯(cuò)配堿基時(shí)，加入D3-F15探針體系的反應(yīng)速率比全匹配序列顯著加快。
[0020]以上結(jié)果表明，熒光標(biāo)記基團(tuán)及其5’鄰位共存的錯(cuò)配堿基協(xié)同作用的結(jié)果可以使Lambda外切酶的反應(yīng)速率顯著加快。
[0021]根據(jù)以上性質(zhì)，我們可以通過(guò)在探針中標(biāo)記熒光基團(tuán)并在其5’鄰位引入錯(cuò)配堿基的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)(參見(jiàn)圖2b))來(lái)加速Lambda外切酶檢測(cè)目標(biāo)鏈時(shí)的反應(yīng)過(guò)程，從而在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)更高倍數(shù)的信號(hào)放大，提高對(duì)目標(biāo)鏈檢測(cè)的靈敏度。
[0022]更進(jìn)一步地，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于探針F3-N15，當(dāng)目標(biāo)序列2位為錯(cuò)配堿基時(shí)，若在4位或5位也同時(shí)為錯(cuò)配堿基，前者反應(yīng)速率明顯下降，而后者幾乎不變。而當(dāng)2，4，5三個(gè)位置同時(shí)為錯(cuò)配堿基時(shí)，Lambda外切酶的水解反應(yīng)幾乎無(wú)法進(jìn)行。利用這一特性，我們可以設(shè)計(jì)與目標(biāo)DNA序列雙錯(cuò)配的探針序列，實(shí)現(xiàn)兩條只有單堿基差異的DNA序列的區(qū)分。如圖2c)所示，探針的4位與目標(biāo)DNA序列中待區(qū)分的堿基相對(duì)應(yīng)并匹配，將熒光基團(tuán)標(biāo)記在3位，2，5位的堿基均設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列中的對(duì)應(yīng)堿基錯(cuò)配。這樣目標(biāo)DNA序列的放大反應(yīng)將會(huì)明顯加快，而與之有單堿基差異的干擾序列因2，4，5三位同時(shí)堿基錯(cuò)配，反應(yīng)將被顯著地抑制，由此通過(guò)Lambda外切酶特異性地的識(shí)別和水解作用，使目標(biāo)序列得到選擇性放大檢測(cè)，而干擾序列的影響降到最低，這對(duì)于提高SNP分型和點(diǎn)突變檢測(cè)的選擇性和靈敏度都是極為有利的。
[0023]綜上，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種不同的信號(hào)放大檢測(cè)體系，分別用于微量DNA的定量放大分析和單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型以及低豐度點(diǎn)突變檢測(cè)等。具體技術(shù)方案如下:
[0024]1.基于單錯(cuò)配雙標(biāo)記探針的微量DNA的信號(hào)放大分析方法。當(dāng)待測(cè)樣品中目標(biāo)DNA序列含量很低(DNA絕對(duì)含量在1.0pmol以下的樣品，最低可以測(cè)到0.1fmol),同時(shí)又無(wú)其他相似DNA序列共存時(shí)，設(shè)計(jì)合成含有5’ -PO4末端的雙標(biāo)記單鏈熒光核酸探針，將熒光基團(tuán)(F)標(biāo)記于距5’末端較近但距離不少于I個(gè)核苷酸的位置，并與3’末端的距離在十個(gè)核苷酸以上，猝滅基團(tuán)(Q)可標(biāo)記在與熒光基團(tuán)相隔七個(gè)核苷酸以上的任意位置。設(shè)計(jì)標(biāo)記基團(tuán)5’鄰位的喊基與目標(biāo)DNA序列中對(duì)應(yīng)位直的喊基為錯(cuò)配喊基，其他喊基均為匹配堿基。
[0025]與前述不含錯(cuò)配堿基的普通雙標(biāo)記5’ -PO4末端單鏈探針相比，Lambda外切酶對(duì)含單錯(cuò)配堿基的新探針與目標(biāo)鏈結(jié)合產(chǎn)物的水解速率大大加快，從而顯著提高信號(hào)放大方法檢測(cè)微量DNA含量的靈敏度(可達(dá)2pM-20nM (50 μ L體系))。
[0026]2.基于雙錯(cuò)配雙標(biāo)記探針的高選擇性DNA信號(hào)放大檢測(cè)方法。在進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型以及低豐度點(diǎn)突變檢測(cè)時(shí)，信號(hào)放大體系的技術(shù)難點(diǎn)在于如何選擇性地放大目標(biāo)DNA序列的信號(hào)，而其他有單堿基差異的干擾序列基本不被放大。根據(jù)前述性質(zhì)，針對(duì)待區(qū)分堿基所在位置設(shè)計(jì)合成含有5’-PO4末端的雙標(biāo)記單鏈熒光核酸探針，在探針序列上找到與該目標(biāo)DNA序列喊基互補(bǔ)對(duì)位的喊基，在此對(duì)位喊基的5’鄰位標(biāo)記突光基團(tuán)(F),3’鄰位設(shè)計(jì)成錯(cuò)配堿基，并將熒光基團(tuán)的5’鄰位設(shè)計(jì)為錯(cuò)配堿基，其他堿基均為匹配堿基。熒光基團(tuán)與5’末端相隔至少一個(gè)核苷酸，并與3’末端的距離在十個(gè)核苷酸以上，猝滅基團(tuán)(Q)可標(biāo)記在與熒光基團(tuán)相隔七個(gè)核苷酸以上的任意位置。
[0027]此探針與目標(biāo)序列結(jié)合后，由于標(biāo)記基團(tuán)兩側(cè)錯(cuò)配堿基的存在，使目標(biāo)序列被放大的反應(yīng)大大加快。而對(duì)于有單堿基差異的干擾序列，由于在標(biāo)記基團(tuán)兩側(cè)有三個(gè)錯(cuò)配堿基存在，反應(yīng)速率明顯下降。綜合以上兩方面的影響 ，所設(shè)計(jì)探針使目標(biāo)序列與干擾序列的差異被顯著放大，從而使檢測(cè)的選擇性大大提高。
[0028]以上方法可以用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)的分型及基因點(diǎn)突變的檢測(cè)。在SNP分型中，樣品中僅含有一種基因型，檢測(cè)相對(duì)較為各易；而在點(diǎn)突變中，樣品中冋時(shí)存在突變型DNA序列與野生型DNA序列，且在疾病初期，突變型DNA序列的豐度通常很低，檢測(cè)時(shí)信號(hào)往往被大量共存的野生型序列的信號(hào)所掩蓋。利用上述方法，將低豐度的突變型DNA序列視為目標(biāo)DNA序列，將野生型DNA序列視為有單堿基差異的干擾DNA序列，設(shè)計(jì)探針使之與突變型DNA序列有兩個(gè)位點(diǎn)錯(cuò)配(分別位于突變位點(diǎn)對(duì)位的3’鄰位和5’鄰位+1位，將熒光基團(tuán)標(biāo)記在突變位點(diǎn)對(duì)位的5’鄰位，猝滅基團(tuán)標(biāo)記在與熒光基團(tuán)相隔七個(gè)核苷酸以上探針3’末端附近)，則野生型DNA序列將與探針有三個(gè)位點(diǎn)錯(cuò)配。這樣，當(dāng)體系中同時(shí)存在突變型DNA序列與野生型DNA序列時(shí)，突變型DNA序列的信號(hào)將被選擇性放大，而野生型DNA序列的信號(hào)被有效抑制，從而實(shí)現(xiàn)低豐度點(diǎn)突變的高選擇性、高靈敏檢測(cè)。
[0029]本發(fā)明所述探針長(zhǎng)度一般設(shè)置為15-68個(gè)核苷酸。為保證探針與目標(biāo)DNA序列雜交的穩(wěn)定性，探針長(zhǎng)度應(yīng)在15個(gè)核苷酸以上。而探針過(guò)長(zhǎng)會(huì)使得放大體系的信號(hào)產(chǎn)生速率減慢，也會(huì)使方法成本提高，因此一般控制在68個(gè)核苷酸以內(nèi)。
[0030]所述探針上的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)選自常用的FRET基團(tuán)對(duì)，如熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)BHQl，熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)TAMRA，熒光基團(tuán)ROX和猝滅基團(tuán)BHQ2等。
[0031]本發(fā)明還提供了對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行特異性信號(hào)放大和檢測(cè)的試劑盒。該試劑盒包括:雙標(biāo)記熒光探針、Lambda外切酶和Lambda外切酶反應(yīng)緩沖溶液。所述雙標(biāo)記熒光探針為5’-PO4末端的單鏈，同時(shí)標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)；所述熒光基團(tuán)與所述單鏈的5’末端相隔至少一個(gè)核苷酸，并與所述單鏈的3’末端的距離在十個(gè)核苷酸以上，所述猝滅基團(tuán)標(biāo)記在與熒光基團(tuán)相隔七個(gè)核苷酸以上的任意位置。
[0032]所述Lambda外切酶反應(yīng)緩沖溶液為能使Lambda外切酶正常發(fā)揮活性的緩沖溶液，通常含有緩沖離子對(duì)和鹽(二者總濃度小于200mM)，Mg2+離子(濃度大于0.1mM)、表面活性劑，ρΗ8.8-9.4，優(yōu)選 5-20mMTris-HCl+5-30mM(NH4) 2S04+5-30mMKCl+l-6mMMgS04+0.05-0.3%TritonX-100, ρΗ8.8-9.4025。。。
[0033]常用的Lambda外切酶反應(yīng)緩沖溶液如ThermoPoI緩沖溶液，NEB公司提供的Lambda 外切酶反應(yīng)緩沖溶液(67mMGlycine-K0H+2.5mMMgCl2+50 μ g/mlBSA, ρΗ9.4i25°C )、Fermentas 公司提供的 Lambda 外切酶反應(yīng)緩沖溶液(67mMGlycine-K0H+2.5mMMgCl2+0.01%(v/v) TritonX-100, pH9.4i25°C )等。優(yōu)選 ThermoPol 緩沖溶液。
[0034]根據(jù)待檢測(cè)體系的不同，具體分為以下兩種:
[0035]1.微量DNA定量放大檢測(cè)試劑盒。適用于僅含待測(cè)目標(biāo)DNA序列，無(wú)其他相似DNA序列共存的樣品體系。試劑盒包括:單錯(cuò)配雙標(biāo)記熒光探針、Lambda外切酶和Lambda 外切酶反應(yīng)緩沖溶液(IOmMTris-HCl+IOmM (NH4) 2S04+10mMKCl+2mMMgS04+0.l%Tritoη Χ-100, ρΗ8.8@25°C或其他能使Lambda外切酶正常發(fā)揮活性的緩沖溶液，優(yōu)選終濃度為
IX ThermoPol 緩沖溶液)。
[0036]其中單錯(cuò)配雙標(biāo)記熒光探針為5’ -PO4末端的單鏈，同時(shí)標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。熒光基團(tuán)與5’末端相隔至少一個(gè)核苷酸，并與3’末端的距離在十個(gè)核苷酸以上，猝滅基團(tuán)可標(biāo)記在與熒光基團(tuán)相隔七個(gè)核苷酸以上的任意位置。探針中熒光基團(tuán)的5’鄰位堿基與目標(biāo)DNA序列的堿基錯(cuò)配，其他堿基匹配。
[0037]上述試劑盒的探針與待測(cè)體系混合后，加入Lambda外切酶，Lambda外切酶可以識(shí)別探針與目標(biāo)DNA序列形成的雙鏈，切割探針而產(chǎn)生熒光信號(hào)。探針被切割后，新的探針可以繼續(xù)與目標(biāo)DNA序列結(jié)合和被切割，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。
[0038]2.高選擇性DNA信號(hào)放大檢測(cè)試劑盒。適用于同時(shí)存在待測(cè)目標(biāo)DNA序列和與之只有一個(gè)堿基不同的干擾DNA序列的樣品體系。試劑盒包括:雙錯(cuò)配雙標(biāo)記熒光探針、Lambda 外切酶和 Lambda 外切酶反應(yīng)緩沖溶液(IOmMTri s_HCl+30mM (NH4) 2S04+30mMKCl+2mMMgS04+0.l%TritonX-100，pH8.8@25°C，或其他可以使Lambda外切酶正常發(fā)揮活性的緩沖溶液，優(yōu)選終濃度為IXThermoPol緩沖溶液+20mMKCl+20mM(NH4)2SO4X其中雙錯(cuò)配雙標(biāo)記熒光探針為5’-P04末端的單鏈，同時(shí)標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。熒光基團(tuán)應(yīng)標(biāo)記在探針中與目標(biāo)序列中待區(qū)分堿基互補(bǔ)對(duì)位堿基的5’鄰位堿基上，且與5’末端相隔至少一個(gè)核苷酸，與3’末端的距離在十個(gè)核苷酸以上，猝滅基團(tuán)可標(biāo)記在與熒光基團(tuán)相隔七個(gè)核苷酸以上的任意位置。同時(shí)，設(shè)計(jì)探針中熒光基團(tuán)的5’鄰位和3’鄰位+1位均為目標(biāo)DNA序列的錯(cuò)配堿基，其他堿基匹配。
[0039]上述試劑盒的探針與待測(cè)體系混合后，加入Lambda外切酶。Lambda外切酶對(duì)干擾序列與探針形成的雙鏈的水解速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)目標(biāo)DNA序列與探針形成的雙鏈的水解速率，從而選擇性地使目標(biāo)DNA序列的信號(hào)放大，而干擾序列的信號(hào)被有效抑制。
[0040]本發(fā)明的試劑盒中，所述雙標(biāo)記熒光探針長(zhǎng)度一般設(shè)置為15-68個(gè)核苷酸。
[0041]所述雙標(biāo)記熒光探針上的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)選自常用的FRET基團(tuán)對(duì)，如熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)BHQl，熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)TAMRA，熒光基團(tuán)ROX和猝滅基團(tuán)BHQ2
坐寸ο
[0042]相比于其他信號(hào)放大技術(shù)，本發(fā)明有以下一些顯著的優(yōu)點(diǎn):
[0043]1.普適性強(qiáng)?；贚ambda外切酶切割放大的反應(yīng)體系對(duì)目標(biāo)DNA序列無(wú)特殊要求。探針的長(zhǎng)度、標(biāo)記基團(tuán)的種類及其位置、與目標(biāo)DNA序列結(jié)合的區(qū)間可以靈活選擇。同時(shí)，本發(fā)明對(duì)六種不同類型堿基錯(cuò)配的選擇性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明可以用于所有類型的單堿基錯(cuò)配的檢測(cè)。因此，本方法適用于各類目標(biāo)DNA序列和各類單堿基突變類型的檢測(cè)。
[0044]2.靈敏度高，選擇性強(qiáng)。本方法利用了 Lambda外切酶對(duì)DNA探針上修飾基團(tuán)和相鄰錯(cuò)配堿基復(fù)合結(jié)構(gòu)的分子識(shí)別特性，對(duì)于目標(biāo)DNA的檢測(cè)靈敏度可達(dá)2pM (50 μ L體系)，且反應(yīng)在20min內(nèi)可以完成，比現(xiàn)有利用核酸酶進(jìn)行DNA放大檢測(cè)的方法在靈敏度和檢測(cè)速率兩方面均有大幅提高。而利用Lambda外切酶對(duì)標(biāo)記基團(tuán)兩側(cè)多個(gè)錯(cuò)配堿基區(qū)分的特性，無(wú)需優(yōu)化溫度條件，在常溫下反應(yīng)，對(duì)目標(biāo)DNA序列與有單堿基差異的干擾序列的區(qū)分度高達(dá)7.2-320倍，大大優(yōu)于現(xiàn)有體系。
[0045]3.體系簡(jiǎn)單，條件溫和，適用范圍廣。在本發(fā)明構(gòu)建的信號(hào)放大體系中，僅需要Lambda外切酶一種酶，并且探針中的堿基均為天然脫氧核糖核苷酸而不需要特殊合成的堿基，易制易得。特別值得強(qiáng)調(diào)的是，本方法可以在常溫條件下實(shí)現(xiàn)，無(wú)需復(fù)雜的控溫裝置，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)規(guī)?；⒆詣?dòng)化檢測(cè)提供了便利。同時(shí)，本方法除了可以單獨(dú)使用進(jìn)行信號(hào)放大檢測(cè)外，還可以與其他基于模板擴(kuò)增的DNA放大技術(shù)如滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和選擇性PCR等聯(lián)合使用，滿足各種DNA檢測(cè)的需求。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0046]圖1是本發(fā)明利用Lambda外切酶和5’ -PO4末端的雙標(biāo)記單鏈熒光核酸探針對(duì)DNA目標(biāo)鏈進(jìn)行信號(hào)放大檢測(cè)的原理示意圖。
[0047]圖2是本發(fā)明所設(shè)計(jì)使用的幾種主要探針的結(jié)構(gòu)示意圖。(a)在距5’ -PO4末端第3位或第15位標(biāo)記不同基團(tuán)的探針結(jié)構(gòu)示意圖；(b)熒光基團(tuán)標(biāo)于3位，其5’鄰位為錯(cuò)配堿基的單錯(cuò)配雙標(biāo)記探針結(jié)構(gòu)示意圖(其中X表示錯(cuò)配堿基);(C)熒光基團(tuán)標(biāo)于3位，其5’鄰位和3’鄰位+1位均為錯(cuò)配堿基的雙錯(cuò)配雙標(biāo)記探針結(jié)構(gòu)示意圖(其中X、Y表示錯(cuò)配堿基，N為根據(jù)目標(biāo)鏈序列設(shè)計(jì)的匹配堿基)。
[0048]圖3是三種不同探針與在不同位置有單堿基錯(cuò)配的目標(biāo)DNA鏈結(jié)合后，被Lambda外切酶水解的熒光上升速率的測(cè)定結(jié)果。其中O號(hào)表示探針與目標(biāo)DNA鏈完全匹配，1-14號(hào)分別表示探針與目標(biāo)DNA鏈在1-14位有單堿基錯(cuò)配的情況。(a)N3-F15探針；(b)D3_F15探針；(c)F3-N15探針。
[0049]圖4是熒光基團(tuán)標(biāo)于3位，其兩側(cè)與目標(biāo)DNA序列有兩個(gè)或三個(gè)錯(cuò)配堿基時(shí)，被Lambda外切酶水解的熒光上升速率的測(cè)定結(jié)果。其中匹配表示探針與目標(biāo)DNA鏈完全匹配。
[0050]圖5是實(shí)施例1利用熒光基團(tuán)標(biāo)于3位，其5’鄰位為錯(cuò)配堿基的單錯(cuò)配雙標(biāo)記探針對(duì)低濃度DNA目標(biāo)序列進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。(a)單錯(cuò)配雙標(biāo)記探針測(cè)定不同濃度DNA目標(biāo)序列的熒光值變化曲線；(b)與采用普通全匹配雙標(biāo)記熒光探針測(cè)定結(jié)果的對(duì)照。其中空白表示樣品溶液中不含目標(biāo)DNA序列時(shí)的測(cè)定結(jié)果。
[0051]圖6是實(shí)施例2利用熒光基團(tuán)標(biāo)于3位，其5’鄰位和3’鄰位+1位均為錯(cuò)配堿基的雙錯(cuò)配雙標(biāo)記探針對(duì)不同類型低豐度點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)的熒光值變化曲線。(a)C:C錯(cuò)配；(b)C:A 錯(cuò)配；(c)C:T 錯(cuò)配。
【具體實(shí)施方式】
[0052]下面結(jié)合附圖,通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0053]實(shí)施例1〈低濃度目標(biāo)DNA序列的檢測(cè)>
[0054]如圖2b)所示，在該實(shí)施例中，目標(biāo)物為DNA單鏈。5’ -PO4末端的單鏈雙標(biāo)記熒光核酸探針中的熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記在距5’末端第3位核苷酸的堿基上，猝滅基團(tuán)BHQl標(biāo)記在3’末端。分別配制不同濃度的目標(biāo)DNA溶液。檢測(cè)具體步驟如下:
[0055]在IXThermoPol 緩沖溶液(20mMTris-HCl+10mM(NH4)2S04+10mMKCl+2mMMgS04，pH8.8i25°C)中，將探針與不同濃度的目標(biāo)DNA混合，進(jìn)行升溫退火(熱程序85°C 90s,65°C90s，50°C90s，37°C 180s)后，加入Lambda外切酶，迅速測(cè)定溶液熒光值隨時(shí)間的變化。
[0056]在該實(shí)施例中，設(shè)計(jì)的探針序列如下:
[0057]5，-P04-TCT(-FAM)CCACAGACACATACTCCA-BHQl-3，(SEQ ID N0.1)
[0058]該探針的5’末端下游第3位核苷酸堿基上標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3’末端標(biāo)記猝滅基團(tuán) BHQl。
[0059]目標(biāo)DNA序列如下:
[0060]5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGAAACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID N0.2)(下劃線部分與探針互補(bǔ)匹配，加粗堿基與探針錯(cuò)配)
[0061]為進(jìn)行比對(duì)，另外合成與探針完全匹配的對(duì)照DNA序列
[0062]5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID N0.3)(下劃線部分與探針互補(bǔ)匹配)
[0063]不同濃度目標(biāo)序列的50 μ L反應(yīng)體系中:探針量:5.0pmol ;目標(biāo)序列SEQ IDN 0.2的量:1.0pmoI, IOOfmol, IOfmoI, 1.0fmol, IOOamol, IOamoI,各反應(yīng)溶液中均加入 1.25U 的Lambda外切酶。
[0064]空白對(duì)照體系:探針5.0pmol,目標(biāo)或?qū)φ誅NA序列含量:0。
[0065]熱程序:37°C 1200s,每5s測(cè)定一次熒光值。
[0066]熒光測(cè)定儀器為實(shí)時(shí)熒光PCR儀rOtOr-gene6000，檢測(cè)時(shí)檢測(cè)器的靈敏度(gainlevel)為:10。
[0067]檢測(cè)結(jié)果:熒光值變化曲線如圖5所示。其中圖5a)表示的是反應(yīng)體系中加入
1.0pmol, IOOfmol, IOfmol, 1.0fmol, IOOamol, IOamol 和 O 的目標(biāo)序列 SEQIDN0.2 時(shí)溶液的實(shí)時(shí)熒光變化曲線。由圖可見(jiàn)，當(dāng)目標(biāo)序列SEQIDN0.2的量大于等于IOOamol時(shí)，熒光信號(hào)可以與空白對(duì)照體系區(qū)分，即檢測(cè)限為lOOamol。圖5b)表示的是反應(yīng)體系中加入lfmol，IOOamol目標(biāo)序列SEQIDN0.3與加入lOOamol, IOamol目標(biāo)序列SEQIDN0.2及不含目標(biāo)序列空白樣品對(duì)照的結(jié)果，可見(jiàn)熒光基團(tuán)5’鄰位錯(cuò)配堿基的設(shè)計(jì)使得對(duì)于目標(biāo)序列的檢測(cè)限比普通全匹配雙標(biāo)記探針下降了約一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0068]實(shí)施例2〈低豐度點(diǎn)突變的檢測(cè)>[0069]在該實(shí)施例中，目標(biāo)物為DNA單鏈。5’ -PO4末端的單鏈雙標(biāo)記熒光核酸探針中的熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記在距5’末端第3位核苷酸的堿基上，猝滅基團(tuán)BHQl標(biāo)記在3’末端。探針距5’末端第2，5位與目標(biāo)DNA單鏈錯(cuò)配，其余堿基都匹配。樣品中同時(shí)存在與目標(biāo)DNA鏈有單堿基差異的干擾鏈，該單堿基的位置對(duì)應(yīng)探針距5’末端第4位核苷酸，因此干擾鏈與探針在第2，4，5位都形成錯(cuò)配。
[0070]該實(shí)施例包含兩個(gè)實(shí)驗(yàn):
[0071](一)不同類型錯(cuò)配的區(qū)分度
[0072]通過(guò)改變探針距5’末端第4位核苷酸的堿基類型，來(lái)測(cè)定不同類型錯(cuò)配的區(qū)分度。檢測(cè)具體步驟如下:
[0073]設(shè)計(jì)并合成5’端下游第3位核苷酸堿基上標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)BHQ1，第4位核苷酸分別為C、T、A三種不同堿基的雙標(biāo)記熒光探針。I XThermoPol緩沖溶液+20mM(NH4)2S04+20mMKCl組成的緩沖溶液中，將三種不同探針?lè)謩e與不同類型的2，5位錯(cuò)配目標(biāo)鏈或2，4，5位錯(cuò)配的干擾DNA序列混合，進(jìn)行升溫退火(熱程序85°C 90s, 65°C 90s,50°C 90s, 25°C 180s)后，加入Lambda外切酶混合均勻，迅速測(cè)定溶液熒光值隨時(shí)間的變化。
[0074]在該實(shí)驗(yàn)中，三種不同探針的序列設(shè)計(jì)如下:
[0075]5，-TCT(-FAM)CCACAGACACATACTCCA-BHQl-3，(SEQ ID N0.1)
[0076]5，-TCT(-FAM)TCACAGACACATACTCCA-BHQl-3，(SEQ ID N0.4)
[0077]5，-TCT(-FAM)ACACAGACACATACTCCA-BHQl-3，(SEQ ID N0.5)
[0078]目標(biāo)DNA序列如下:
[0079]5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTTGAAACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID N0.6)(下劃線部分與三種探針均互補(bǔ)匹配，加粗堿基與三種探針均錯(cuò)配，斜體堿基只與SEQ ID N0.1探針匹配，與另外兩種探針均錯(cuò)配)
[0080]5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTTCAAACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID N0.7)(下劃線部分與三種探針均互補(bǔ)匹配，加粗堿基與三種探針均錯(cuò)配)
[0081]5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTTAAAACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID N0.8)(下劃線部分與三種探針均互補(bǔ)匹配，加粗堿基與三種探針均錯(cuò)配，斜體堿基只與SEQ ID N0.4探針匹配，與另外兩種探針均錯(cuò)配)
[0082]5，-GTTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTTTAAACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID N0.9)(下劃線部分與三種探針均互補(bǔ)匹配，加粗堿基與三種探針均錯(cuò)配，斜體堿基只與SEQ ID N0.5探針匹配，與另外兩種探針均錯(cuò)配)
[0083]在50 μ L反應(yīng)體系中:探針量:IOpmol ;目標(biāo)序列量:5pmol。各反應(yīng)體系中分別加A 0.83U 的 Lambda 外切酶。
[0084]熱程序:25° C1200s，每5s測(cè)定一次熒光值。熒光測(cè)定儀器為實(shí)時(shí)熒光PCR儀rotor-gene6000,檢測(cè)時(shí)檢測(cè)器的靈敏度(gainlevel)為:7。
[0085]檢測(cè)結(jié)果:六種錯(cuò)配類型的區(qū)分度如表1所示。
[0086]表1不同類型堿基錯(cuò)配的區(qū)分度
【權(quán)利要求】
1.常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法，包括以下步驟: O設(shè)計(jì)合成含有5’ -PO4末端的雙標(biāo)記單鏈熒光核酸探針，探針標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)靠近5’末端，并與5’末端相隔至少一個(gè)核苷酸，與3’末端的距離在十個(gè)核苷酸以上；所述猝滅基團(tuán)標(biāo)記在靠近3’末端并與熒光基團(tuán)相隔七個(gè)核苷酸以上的任意位置； 2)將步驟I)設(shè)計(jì)合成的探針與含目標(biāo)DNA序列的待測(cè)體系混合后，加入Lambda外切酶，在常溫下反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法，其特征在于，將所述熒光基團(tuán)5’鄰位的堿基與目標(biāo)DNA序列中對(duì)應(yīng)位置的堿基設(shè)計(jì)為錯(cuò)配堿基，其他堿基均為匹配堿基。
3.如權(quán)利要求1所述的常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法，其特征在于，在所述探針序列上找到與所述目標(biāo)DNA序列喊基互補(bǔ)對(duì)位的喊基,在此對(duì)位喊基的5’鄰位標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’鄰位設(shè)計(jì)成錯(cuò)配堿基，并將熒光基團(tuán)的5’鄰位設(shè)計(jì)為錯(cuò)配堿基，其他堿基均為匹配堿基。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法，其特征在于，所述探針長(zhǎng)度設(shè)置為15-68個(gè)核苷酸。
5.如權(quán)利要求1-3任一所述的常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法，其特征在于，所述熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)選自FRET基團(tuán)對(duì)，包括熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)BHQ1，熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)TAMRA，熒光基團(tuán)ROX和猝滅基團(tuán)BHQ2。
6.常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的試劑盒，包括:雙標(biāo)記熒光探針、Lambda外切酶和Lambda外切酶反應(yīng)緩沖溶液；所述雙標(biāo)記熒光探針為5’_P04末端的單鏈，同時(shí)標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)；所述熒光基團(tuán)與所述單鏈的5’末端相隔至少一個(gè)核苷酸，并與所述單鏈的3’末端的距離在十個(gè)核苷酸以上，所述猝滅基團(tuán)標(biāo)記在與熒光基團(tuán)相隔七個(gè)核苷酸以上的任意位置。
7.如權(quán)利要求6所述的常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述Lambda外切酶反應(yīng)緩沖液含有總濃度小于200mM的緩沖離子對(duì)和鹽、濃度大于0.1mM的Mg2+離子、表面活性劑，ρΗ8.8-9.4。
8.如權(quán)利要求7所述的常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述 Lambda 外切酶反應(yīng)緩沖液包括 5-20mMTris-HCl+5-30mM(NH4) 2S04+5_30mMKCl+l-6mMMgS04+0.05-0.3%TritonX-100, ρΗ8.8-9.4i25°C。
9.如權(quán)利要求6所述的常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述雙標(biāo)記熒光探針為單錯(cuò)配雙標(biāo)記探針，所述單錯(cuò)配雙標(biāo)記探針中熒光基團(tuán)的5’鄰位堿基與目標(biāo)DNA序列的堿基錯(cuò)配，其他堿基匹配。
10.如權(quán)利要求6所述的常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述雙標(biāo)記熒光探針為雙錯(cuò)配雙標(biāo)記熒光探針，所述雙錯(cuò)配雙標(biāo)記熒光探針中熒光基團(tuán)的5’鄰位和3’鄰位+1位均為目標(biāo)DNA序列的錯(cuò)配堿基，其他堿基匹配。
11.如權(quán)利要求6-10任一所述的常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述雙標(biāo)記熒光探針長(zhǎng)度設(shè)置為15-68個(gè)核苷酸。
12.如權(quán)利要求6-10任一所述的常溫下對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)選自FRET基團(tuán)對(duì)，包括熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)BHQl，熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)T`AMRA，熒光基團(tuán)ROX和猝滅基團(tuán)BHQ2。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882128SQ201410093830
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】趙美萍, 吳曈勃, 肖先金 申請(qǐng)人:北京大學(xué)