一種茶蛋白高f值低聚肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種茶蛋白高F值低聚肽及其制備方法和應(yīng)用，該制備方法包括：將茶蛋白加入水中，混勻，然后加入蛋白酶A進(jìn)行第一步水解，得到第一步水解液；向第一步水解液中加入蛋白酶B進(jìn)行第二步水解，得到第二步水解液；將第二步水解液進(jìn)行脫鹽，得到脫鹽液；脫鹽液經(jīng)活性炭吸附、超濾、濃縮，得到茶蛋白高F值低聚肽。本發(fā)明以茶蛋白為原料，通過(guò)兩步酶水解以及脫鹽、活性炭吸附、超濾等分離純化工藝，制備得到高F值低聚肽，制備方法便捷，條件溫和可控，適合工業(yè)化應(yīng)用。本發(fā)明方法不僅拓展了高F值低聚肽的原料來(lái)源，而且對(duì)茶蛋白的增值加工和綜合開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重要意義。
【專利說(shuō)明】一種茶蛋白高F值低聚肽及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及功能肽研究領(lǐng)域，尤其涉及一種茶蛋白高F值低聚肽及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]高F值低聚肽是蛋白酶作用于食物蛋白后形成的一種低分子量生理活性肽，因其具有獨(dú)特的氨基酸組成和生理功能而受到食品和醫(yī)藥界的高度關(guān)注。Fischer值(F值)，是支鏈氨基酸(Branched chain amino acid, BCAA ;主要指亮氨酸、異亮氨酸和擷氨酸)與芳香族氨基酸(Aromatic amino acids, AAA ;主要指苯丙氨酸、酪氨酸)的摩爾比值,高F值的F值應(yīng)大于20。高F值低聚肽中BCAA含量高、AAA含量低，氨基酸組成獨(dú)特，易被人體消化吸收。
[0003]近年研究發(fā)現(xiàn)，高F值低聚肽具有減輕或消除肝性腦病癥狀及抗疲勞作用，補(bǔ)充高付出病人的膳食營(yíng)養(yǎng)，改善蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)狀況，可作為高強(qiáng)度工作者及運(yùn)動(dòng)員的食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑；此外，還具有解酒護(hù)肝、抑制癌細(xì)胞增值、降低血清膽固醇濃度等多種生理調(diào)節(jié)功倉(cāng)泛。
[0004]我國(guó)茶資源豐富，然而對(duì)于茶資源的綜合利用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，尤其是一些品質(zhì)較差的茶葉和茶葉深加工副產(chǎn)物。應(yīng)用一系列創(chuàng)新技術(shù)將它們開(kāi)發(fā)成品質(zhì)優(yōu)良的深加工產(chǎn)品，不僅可以滿足我國(guó)居民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)整的需求，而且對(duì)調(diào)整農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)，增加茶農(nóng)收入，改善農(nóng)村生態(tài)環(huán)境將起到很好的促進(jìn)作用。
[0005]茶葉中含有約20-30% (干重)的蛋白質(zhì)，主要包括谷蛋白(82.05%)和醇溶蛋白(13.61%)，還含有少量的白蛋白(3.47%)和球蛋白(0.87%);就氨基酸組成而言，茶葉蛋白中支鏈氨基酸和中性氨基酸含量均相當(dāng)高，是植物蛋白中頗少見(jiàn)的特色組成。在茶葉產(chǎn)量大幅提高的同時(shí)，如果能對(duì)其中占大部分的茶葉蛋白進(jìn)行深度利用，必將會(huì)給整個(gè)茶葉產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的利潤(rùn)和發(fā)展空間。目前國(guó)內(nèi)外的研究都是針對(duì)茶葉蛋白的提取、純化及改性等方面，而對(duì)茶蛋白進(jìn)一步深度加工的研究在我國(guó)基本是空白的，尤其是以其為原料制備高F值低聚肽在國(guó)內(nèi)外都鮮見(jiàn)報(bào)到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種茶蛋白高F值低聚肽的制備方法，用于制備茶蛋白來(lái)源的高F值低聚肽產(chǎn)品，解決目前高F值低聚肽產(chǎn)品中植物蛋白來(lái)源少的問(wèn)題。
[0007]—種茶蛋白高F值低聚肽的制備方法，包括:
[0008](1)將茶蛋白加入水中，混勻，然后加入蛋白酶A進(jìn)行第一步水解，得到第一步水解液；
[0009](2)向第一步水解液中加入蛋白酶B進(jìn)行第二步水解，得到第二步水解液；
[0010](3)將第二步水解液進(jìn)行脫鹽，得到脫鹽液；脫鹽液經(jīng)活性炭吸附、超濾、濃縮，得到茶蛋白高F值低聚肽；[0011]其中，所述的蛋白酶A為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶中的至少一種；
[0012]所述的蛋白酶B為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶中的至少一種。
[0013]第一步水解主要是為了將大分子茶蛋白盡可能多得水解成多肽，并使大部分被切下肽鏈的N-末端或C-末端為芳香族氨基酸；第二步水解的主要目的是將內(nèi)切蛋白酶水解所暴露出的疏水性氨基酸(特別是芳香族氨基酸)從多肽末端切除；活性炭吸附能將游離出來(lái)的芳香族氨基酸有效去除，從而得到F值較高的肽產(chǎn)品。
[0014]步驟(1)中，所述的茶蛋白可以為茶葉或茶渣中提取得到的茶蛋白粉，也可以為茶蛋白粉經(jīng)預(yù)處理后得到的改性茶蛋白。
[0015]所述的預(yù)處理可以為熱處理、亞硫酸鈉處理或擠壓組織化改性處理。通過(guò)預(yù)處理，能有效打開(kāi)茶蛋白緊密的分子結(jié)構(gòu)，便于后續(xù)水解。
[0016]所述的茶蛋白用量可以為水重量的1_10%，優(yōu)選為4%。
[0017]所述的蛋白酶A優(yōu)選為堿性蛋白酶或中性蛋白酶；更優(yōu)選為堿性蛋白酶。堿性蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，是一種非特異性內(nèi)切蛋白酶。堿性蛋白酶的作用位點(diǎn)主要在羧基側(cè)具有芳香族或疏水性氨基酸的肽鍵，能從肽鏈內(nèi)部將肽鏈斷開(kāi)，較好地分解蛋白或肽，使蛋白內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露出來(lái)，形成含有疏水性氨基酸的肽。同時(shí)，由于茶蛋白在堿性條件下溶解性較好，采用堿性蛋白酶更有利于酶與蛋白的接觸，便于水解的進(jìn)行。
[0018]以每千克茶蛋白計(jì)，所述的堿性蛋白酶的用量可以為10_50g，優(yōu)選為40g。該條件下堿性蛋白酶對(duì)茶蛋白的水解度能達(dá)到20%以上,水解效果較好。
[0019]所述的第一步水解的反應(yīng)體系pH可以為7-10，優(yōu)選為9。pH值過(guò)高或過(guò)低均對(duì)酶活不利；且在偏堿性條件下茶蛋白溶解性更好，更利于酶的作用。
[0020]所述的第一步水解的反應(yīng)溫度可以為40_60°C，優(yōu)選為50°C。反應(yīng)溫度會(huì)影響單位時(shí)間內(nèi)酶與底物分子間的有效接觸次數(shù)，溫度過(guò)低，酶活受到抑制；溫度過(guò)高，酶蛋白易失活變性。
[0021]所述的第一步水解的反應(yīng)時(shí)間可以為l_6h，優(yōu)選為3h。水解反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)水解度的提高不顯著，水解后期會(huì)產(chǎn)生限制水解繼續(xù)進(jìn)行的肽；綜合考慮時(shí)間成本等因素，反應(yīng)3h最合適。
[0022]步驟(2)中，所述的蛋白酶B可以為復(fù)合風(fēng)味蛋白酶或中性蛋白酶；優(yōu)選為復(fù)合風(fēng)味蛋白酶。復(fù)合風(fēng)味蛋白酶是一種真菌蛋白酶/肽酶復(fù)合酶，包含內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性，一方面，通過(guò)內(nèi)切作用可進(jìn)一步切斷蛋白或多肽內(nèi)部的肽鍵，增加含疏水性氨基酸多肽的含量；另一方面，通過(guò)外切作用可特異性地將多肽末端的疏水性氨基酸切斷、釋放出來(lái)，在增加芳香族氨基酸游離程度的同時(shí)，能有效減少肽的苦味，改善口感。
[0023]以每千克第一步水解液計(jì)，所述的復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的用量可以為l-10g，優(yōu)選為2g。酶用量不足，芳香族氨基酸被游離出的程度不夠；酶過(guò)量會(huì)增加成本。在優(yōu)選用量條件下，芳香族氨基酸能被較好地釋放出來(lái)。
[0024]所述的第二步水解的反應(yīng)體系pH為5-7.5，優(yōu)選為6.5。此條件下酶活較高，且反應(yīng)體系接近中性，便于后續(xù)除鹽。
[0025]所述的第二步水解的反應(yīng)溫度為40_60°C，優(yōu)選為55°C。溫度過(guò)高或過(guò)低芳香族氨基酸游離程度均不夠。[0026]所述的第二步水解的反應(yīng)時(shí)間為0.5_3h，優(yōu)選為2h。反應(yīng)初期，底物與酶的濃度均處在較高水平，隨著時(shí)間推移，芳香族氨基酸被快速游離出來(lái)；但反應(yīng)2h后，繼續(xù)增加時(shí)間對(duì)提高芳香族氨基酸游離率貢獻(xiàn)不大。
[0027]步驟(3)中，所述的活性炭為疏水性吸附劑，對(duì)芳香族氨基酸具有選擇性吸附特性，可將其從蛋白水解液中有效去除。
[0028]活性炭的用量影響吸附效果。所述活性炭與脫鹽液的用量比可以為1:10-1:60，優(yōu)選為1:40。
[0029]水解液pH會(huì)影響氨基酸帶電量，進(jìn)而影響吸附劑與吸附質(zhì)之間的解離情況。所述的脫鹽液的pH可以為2.0-6.0，優(yōu)選為3.0。
[0030]所述的活性炭吸附的反應(yīng)溫度可以為25_45°C，優(yōu)選為35°C。該條件下，活性炭吸附效果較好，且節(jié)約能耗。
[0031]所述的活性炭吸附的反應(yīng)時(shí)間可以為0.25-2.5h，優(yōu)選為1.5h。反應(yīng)初期，隨著吸附時(shí)間的增加，吸附效果增加顯著；吸附Ih后趨勢(shì)變緩；繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，由于吸附已達(dá)到平衡狀態(tài)，吸附過(guò)久反而增加了對(duì)支鏈氨基酸和小分子肽的吸附，導(dǎo)致吸附量減少。在
.1.5h時(shí)，芳香族氨基酸去除效果和支鏈氨基酸保留效果均較好。
[0032]本發(fā)明還提供了一種采用上述制備方法制得的茶蛋白高F值低聚肽，該茶蛋白高F值低聚肽的F值在20以上。試驗(yàn)表明，制得的低分子量混合小肽體系的F值能夠達(dá)到20以上，符合高F值低聚肽的要求。
[0033]本發(fā)明還提供了上述茶蛋白高F值低聚肽在保健食品制備中的應(yīng)用。所述的茶蛋白高F值低聚肽中支鏈氨基酸含量高、芳香族氨基酸含量低，易被消化吸收，能起到抗疲勞、補(bǔ)充膳食營(yíng)養(yǎng)、減輕或消除肝性腦病癥狀、解酒護(hù)肝、抑制癌細(xì)胞增值、降低血清膽固醇等生理活性作用。以該茶蛋白高F值低聚肽為功效成分制得的保健食品具有抗疲勞、補(bǔ)充膳食營(yíng)養(yǎng)和解酒護(hù)肝等作用。
[0034]本發(fā)明以茶蛋白為原料，通過(guò)兩步酶水解后，茶蛋白分子緊密的立體結(jié)構(gòu)被破壞，大分子蛋白被水解成多肽，且肽鏈末端的芳香族氨基酸被有效游離下來(lái)，所得的水解液再經(jīng)后續(xù)的活性炭吸附去除游離芳香族氨基酸以及超濾等分離純化工藝后，制備得到了支鏈氨基酸含量高、芳香族氨基酸含量低的茶蛋白高F值低聚肽。制備方法操作簡(jiǎn)單，條件溫和可控，適合工業(yè)化應(yīng)用。本發(fā)明方法不僅拓展了高F值低聚肽的原料來(lái)源，而且對(duì)茶蛋白的增值加工和綜合開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0035]實(shí)施例1茶蛋白高F值低聚肽的制備
[0036](1)第一步水解:取茶蛋白粉，加入水中，混勻，然后加入中性蛋白酶進(jìn)行第一步水解，完成后于90°C滅酶10min，得到第一步水解液；
[0037]其中，底物濃度8% (w/w)、加酶量(E/S) 4%、反應(yīng)液ρΗ7.0、反應(yīng)溫度45°C、反應(yīng)時(shí)間3h。
[0038](2)第二步水解:向第一步水解液中加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行第二步水解，完成后于90°C滅酶10min,得到第二步水解液；
[0039]其中，加酶量(w/v) 0.2%、反應(yīng)液ρΗ6.5、反應(yīng)溫度55°C、反應(yīng)時(shí)間2h。[0040](3)分離純化:將第二步水解液脫鹽，得到脫鹽液；將脫鹽液的pH調(diào)節(jié)至3.0，按照1:40的固液比加入活性炭，攪拌均勻，置于35°C、轉(zhuǎn)速120rpm的恒溫水浴搖床中吸附處理1.5h ;然后進(jìn)行過(guò)濾、超濾(截留分子量3000Da的超濾膜)、濃縮，得到茶蛋白高F值低聚肽。
[0041]所得的高F值低聚肽產(chǎn)品為澄清、淡黃色、無(wú)苦味、無(wú)異味的液體。經(jīng)測(cè)定，產(chǎn)品在220nm處有紫外吸收，而在260nm處沒(méi)有特征性吸收峰。產(chǎn)品中分子量在1000_180Da之間的占58.24%，占比最大，表明主要為幾個(gè)氨基酸組成的低聚肽。
[0042]經(jīng)氨基酸組成分析，得知產(chǎn)品含有人體必需的8種必需氨基酸，F(xiàn)值=20.17，符合高F值低聚肽產(chǎn)品的要求。
[0043]實(shí)施例2茶蛋白高F值低聚肽的制備
[0044](I)預(yù)處理:采用擠壓組織化對(duì)茶蛋白粉進(jìn)行預(yù)處理，得到改性后的茶蛋白；其中，擠壓組織化條件:物料含水率35%，喂料速度25g/min，機(jī)筒溫度160°C，螺桿轉(zhuǎn)速170rpmo
[0045](2)第一步水解:將改性后的茶蛋白加入水中，混勻，然后加入堿性蛋白酶進(jìn)行第一步水解，完成后于90°C滅酶lOmin，得到第一步水解液；
[0046]其中，底物濃度3% (w/w)、加酶量(E/S) 3%、反應(yīng)液pH9.0、反應(yīng)溫度50°C、反應(yīng)時(shí)間 3.5h。
[0047](3)第二步水解:向第一步水解液中加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行第二步水解，完成后于90°C滅酶IOmin ,得到第二步水解液；
[0048]其中，加酶量(w/v) 0.2%、反應(yīng)液ρΗ6.5、反應(yīng)溫度55°C、反應(yīng)時(shí)間2h。
[0049](4)分離純化:將第二步水解液脫鹽，得到脫鹽液；將脫鹽液的pH調(diào)節(jié)至3.0，按照1:40的固液比加入活性炭，攪拌均勻，置于35°C、轉(zhuǎn)速120rpm的恒溫水浴搖床中吸附處理1.5h ;然后進(jìn)行過(guò)濾、超濾(截留分子量3000Da的超濾膜)、濃縮，得到茶蛋白高F值低聚肽。
[0050]所得的高F值低聚肽產(chǎn)品為澄清、淡黃色、無(wú)苦味、無(wú)異味的液體。經(jīng)測(cè)定，產(chǎn)品在220nm處有紫外吸收，而在260nm處沒(méi)有特征性吸收峰。產(chǎn)品中分子量在1000_180Da之間的占60.13%，占比最大，表明主要為幾個(gè)氨基酸組成的低聚肽。
[0051]經(jīng)氨基酸組成分析，得知產(chǎn)品含有人體必需的8種必需氨基酸，F(xiàn)值=20.69，符合高F值低聚肽產(chǎn)品的要求。
[0052]實(shí)施例3茶蛋白高F值低聚肽的制備
[0053](I)預(yù)處理:采用擠壓組織化對(duì)茶蛋白粉進(jìn)行預(yù)處理，得到改性后的茶蛋白；其中，擠壓組織化條件:物料含水率35%，喂料速度25g/min，機(jī)筒溫度160°C，螺桿轉(zhuǎn)速170rpmo
[0054](2)第一步水解:將改性后的茶蛋白加入水中，混勻，然后加入堿性蛋白酶進(jìn)行第一步水解，完成后于90°C滅酶lOmin，得到第一步水解液；
[0055]其中，底物濃度5% (w/w)、加酶量(E/S) 4%、反應(yīng)液pH9.0、反應(yīng)溫度50°C、反應(yīng)時(shí)間3h。
[0056](3)第二步水解:向第一步水解液中加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行第二步水解，完成后于90°C滅酶IOmin,得到第二步水解液；[0057]其中，加酶量(w/v) 0.2%、反應(yīng)液pH6.5、反應(yīng)溫度55°C、反應(yīng)時(shí)間2h。
[0058](4)分離純化:將第二步水解液脫鹽，得到脫鹽液；將脫鹽液的pH調(diào)節(jié)至3.0，按照1:40的固液比加入活性炭，攪拌均勻，置于35°C、轉(zhuǎn)速120rpm的恒溫水浴搖床中吸附處理1.5h ;然后進(jìn)行過(guò)濾、超濾(截留分子量3000Da的超濾膜)、濃縮，得到茶蛋白高F值低聚肽。
[0059]所得的高F值低聚肽產(chǎn)品為澄清、淡黃色、無(wú)苦味、無(wú)異味的液體。經(jīng)測(cè)定，產(chǎn)品在220nm處有紫外吸收，而在260nm處沒(méi)有特征性吸收峰。產(chǎn)品中分子量在1000_180Da之間的占61.47%，占比最大，表明主要為幾個(gè)氨基酸組成的低聚肽。
[0060]經(jīng)氨基酸組成分析，得知產(chǎn)品含有人體必需的8種必需氨基酸，F(xiàn)值=21.56，符合高F值低聚肽產(chǎn)品的要求。
【權(quán)利要求】
1.一種茶蛋白高F值低聚肽的制備方法，包括: (1)將茶蛋白加入水中，混勻，然后加入蛋白酶A進(jìn)行第一步水解，得到第一步水解液； (2)向第一步水解液中加入蛋白酶B進(jìn)行第二步水解，得到第二步水解液； (3)將第二步水解液進(jìn)行脫鹽，得到脫鹽液；脫鹽液經(jīng)活性炭吸附、超濾、濃縮，得到茶蛋白高F值低聚肽； 其中，所述的蛋白酶A為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶中的至少一種； 所述的蛋白酶B為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶中的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的蛋白酶A為堿性蛋白酶或中性蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的蛋白酶A為堿性蛋白酶；以每千克茶蛋白計(jì)，堿性蛋白酶的用量為10-50g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的第一步水解的反應(yīng)體系PH為7-10，反應(yīng)溫度為40-60°C，反應(yīng)時(shí)間為l_6h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的蛋白酶B為復(fù)合風(fēng)味蛋白酶；以每千克第一步水解液計(jì)，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的用量為l-10g。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的第二步水解的反應(yīng)體系PH為5-7.5，反應(yīng)溫度為40-60°C，反應(yīng)時(shí)間為0.5_3h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，活性炭吸附時(shí)，活性炭與脫鹽液的用量比為1:10-1:60。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，活性炭吸附時(shí)，脫鹽液的pH為2.0-6.0,反應(yīng)溫度為25-450C，反應(yīng)時(shí)間為0.25-2.5h。
9.一種采用如權(quán)利要求1-8任一所述的制備方法制得的茶蛋白高F值低聚肽。
10.如權(quán)利要求9所述的茶蛋白高F值低聚肽在保健食品制備中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23L1/29GK103865971SQ201410095492
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】王彬, 張士康, 劉婧, 汪輝, 朱躍進(jìn), 蔣玉蘭 申請(qǐng)人:中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究所