一種重組肺炎支原體蛋白及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組肺炎支原體蛋白，以及該重組肺炎支原體蛋白在制備檢測試劑盒中的應用。本發(fā)明的重組肺炎支原體蛋白制備的診斷試劑盒具有特異性強、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點，很好的滿足了肺炎支原體感染臨床診斷的需要。
【專利說明】一種重組肺炎支原體蛋白及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程、疫苗研制和診斷試劑等領域，具體地涉及一種肺炎支原體蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002]肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae, MP)是引起上呼吸道感染、氣管支氣管炎及非典型肺炎的常見病原體之一。由于肺炎支原體感染所致的社區(qū)獲得性肺炎患者臨床表現(xiàn)不典型，經(jīng)過10-20d的潛伏期，可出現(xiàn)一些非特異性癥狀如頭痛和發(fā)熱，常伴有無力和干咳，根據(jù)臨床癥狀不易作出鑒別診斷。常被忽視而導致嚴重的合并癥。由于肺炎支原體無細胞膜，作用于細胞膜的抗菌藥物對其無殺傷作用，加上其感染初期臨床表現(xiàn)不明顯，另外，MP感染還可以造成肺外各系統(tǒng)改變，且有死亡病例的報道，已引起臨床關注。因此，及時、有效的進行肺炎支原體感染的實驗室診斷變得尤為重要。
[0003]MP感染可在任何年齡發(fā)生，尤其以5~20歲更多見。MP通過飛沫，以氣溶膠微粒的形式傳播，感染后引起肺炎支原體肺炎(Mycoplasmalpneumonia,MPP),每隔3~5年出現(xiàn)I次地區(qū)性流行，占各類肺炎總數(shù)的10%~20%，入伍新兵患肺炎者30%~50%由MP引起，約占非細菌性肺炎的1/3以上。另外，還可以造成肺外各系統(tǒng)改變，且有死亡病例的報道，已引起臨床關注。
[0004]肺炎支原體肺炎的臨床表現(xiàn)、X線征象均缺乏特異性，且須與病毒性肺炎、軍團菌肺炎相鑒別，只能通過實驗室檢查病原體分離陽性和血清學試驗進行鑒別診斷、確診。雖然分離培養(yǎng)雖然是最可靠的確診依據(jù)，但存在著臨床標本中病原體含量少、呼吸道污染的雜菌較多、分離培養(yǎng)需要時間長、陽性率低以及支原體培養(yǎng)要求高，一般實驗室難以開展等缺點。因而不能作為臨床快速診斷的方法。而血清學檢查具有簡便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種重組肺炎支原體蛋白，本發(fā)明的另一目的是提供該重組肺炎支原體蛋白在制備檢測試劑盒中的應用。
[0006]本發(fā)明提供了一種編碼肺炎支原體蛋白的重組DNA，其核苷酸序列如SEQIDN0.1所不。同時提供了由該重組DNA序列編碼的肺炎支原體蛋白，其氣基酸序列如SEQIDN0.2所示。
[0007]本發(fā)明還提供了一種肺炎支原體蛋白的表達載體pET-28a-rMP_pll6,它是將SEQIDN0.1所示所述的重組DNA序列插入到質(zhì)粒pET-28a上得到的重組質(zhì)粒,其質(zhì)粒圖譜如附圖2所示。將表達載體pET-28a-rMP-pll6導入大腸桿菌中，得到表達肺炎支原體蛋白的工程菌株，其保藏編號為CGMCCN0.8895，于2014年03月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。[0008]本發(fā)明利用SEQIDN0.1所示核苷酸序列通過基因工程方法制備肺炎支原體蛋白可以通過如下步驟實現(xiàn):
[0009]I)獲得具有SEQIDN0.1所示的核苷酸序列；
[0010]2)將該核苷酸序列導入質(zhì)粒,優(yōu)選pET_28a質(zhì)粒；
[0011]3)將該質(zhì)粒導入原核宿主細胞，優(yōu)選大腸桿菌宿主細胞，更優(yōu)選BL21 (DE3)菌株中；
[0012]4)在有利于所述核苷酸序列表達的條件下(轉(zhuǎn)速200r/min、37°C培養(yǎng)3小時，加入Immol/mL誘導劑，轉(zhuǎn)速200r/min、37°C誘導表達5小時)培養(yǎng)所述宿主細胞；
[0013]5)回收、純化及復性所表達的重組蛋白。
[0014]本發(fā)明提供的檢測肺炎支原體感染的試劑盒，其組分中的抗原是本發(fā)明所述的重組肺炎支原體蛋白。優(yōu)選地，用于標記肺炎支原體蛋白的標記物為體金。
[0015]本發(fā)明所述的采用膠體金標記抗原的試劑盒中，MP抗原劃線包被濃度為1.0mg/ml, MP抗原膠體金復合物在濃縮原液到稀釋一倍之間包被載金墊，膠體金結(jié)合物噴點量為60.0 μ L/cm2。兔抗MP抗體包被量為1.0 μ 1/cm，包被濃度為5.0mg/ml。
[0016]以下將更詳細的描述本發(fā)明的技術方案:
[0017]本發(fā)明提供了一種編碼肺炎支原體蛋白的如SEQIDN0.1所示的核苷酸序列，利用該核苷酸序列制備肺炎支原體蛋白的方法，由該方法制備的包含SEQIDN0.2所示氨基酸序列的肺炎支原體蛋白，以及包含該蛋白的組合物和試劑盒，同時還公開了它們在檢測肺炎支原體感染的應用。
[0018]SEQIDN0.1所示核苷酸序列可以通過本領域常規(guī)的方法制備，選擇其強抗原表位即肺炎支原體MP129-B7基因組(GenBank:NP_109974.1)中DNA序列為模板，設計兩對PCR引物(Pl，P2)和(P3，P4)。pi和p2用于擴增pll6中第31位到第912位核苷酸，p3和p4用于擴增P116第1015位到第1395核苷酸；引物pl和p4分別帶有BamHl和XhoI的酶切位點，引物P2和p3順序互補；利用P2中的連接引物將中間部分疏水片斷去除，并根據(jù)大腸桿菌的表達子偏愛性對基因序列進行了部分點突變。
[0019]引物序列如下:
[0020]Pl:ATAGGATCCGGGCACAGATATGGGAATGACCAC
[0021]P2:
[0022]GAATCTTCCAAAGCCACCCTGATCTTAATCAAACCCCGGTCGGGTTAC
[0023]P3:CCGAGGTAACCCGACCGGGGTTTGATTAAGATCAGGGTGGCTTTGG
[0024]P4:
[0025]TATCTCGAGTTAATGATGGTGATGGTGATGCCAGAGGAACCTACTTTTTTCCC
[0026]以肺炎支原體培養(yǎng)物為模板，以引物Pl和P2擴增pll6第11位到第304位核苷酸片段，以引物P3和P4擴增pll6第389位到第465核苷酸片段；再以第一輪PCR擴增得到的兩片段為模板，加入引物Pl和P4，擴增pll6片段；得到串聯(lián)的目的基因重組片段pll6。
[0027]本發(fā)明對上述核苷酸序列的核酸分子采用適當載體和宿主細胞表達時可以大大提高表達產(chǎn)率。
[0028]本發(fā)明還提供應用如SEQIDN0.1所示的核苷酸序列制備肺炎支原體蛋白的方法。根據(jù)常規(guī)方法，可將含編碼肺炎支原體蛋白的如SEQIDN0.1所示核苷酸序列的核酸分子連接到一個表達載體中，然后通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)化細胞。通常，優(yōu)選原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本發(fā)明的載體構(gòu)建。例如，大腸桿菌等腸科桿菌。
[0029]編碼本發(fā)明蛋白的核酸與pET_28a形成的雜合質(zhì)粒具有高度的穩(wěn)定性，有利于本發(fā)明的蛋白的表達。
[0030]在本發(fā)明的一個實施方案中，如圖2所示，制備含有SEQIDN0.1所示核苷酸序列的核酸分子和pET-28a質(zhì)粒的表達構(gòu)建體，并將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)后，收集菌體，得到大腸埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-28a-rMP-pll6?？刹捎贸Ｒ?guī)的純化方法純化所得到的蛋白。
[0031]本發(fā)明還提供用上述方法制備、純化的肺炎支原體蛋白，該蛋白具有SEQIDN0.2所示氨基酸序列。
[0032]本發(fā)明還提供包含本發(fā)明肺炎支原體蛋白的組合物和試劑盒。所述組合物或試劑盒可制備成檢測人肺炎支原體感染的試劑或試劑盒形式，在臨床上用于方便、快速和準確的檢測肺炎支原體感染。任何生物學樣品，只要它們含有肺炎支原體抗體，就可用本發(fā)明蛋白，包含該蛋白的組合物或試劑盒來檢測。
[0033]本文所述“試劑盒”是指利用本發(fā)明蛋白完成肺炎支原體感染檢測而組配制成的成套試劑。該試劑盒用于診斷肺炎支原體感染。在用于肺炎支原體感染檢測的試劑盒中，本發(fā)明的肺炎支原體蛋白也可以是經(jīng)過標記的。具體可使用酶、金屬螯合物等標記。優(yōu)選的標記性酶例如，辣根過氧化物酶，過氧化物酶，堿性磷酸酶等。優(yōu)選的金屬物質(zhì)有膠體金
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[0034]目前市場上只有日本富士瑞必歐株式公社生產(chǎn)的“肺炎支原體抗體檢測試劑盒(被動凝集法)”是對肺炎支原體抗體進行檢測的。
[0035]而采用本發(fā)明提供的重組肺炎支原體蛋白制備的診斷試劑盒，與該試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點，很好的滿足了肺炎支原體感染臨床診斷的需要。
[0036]本發(fā)明涉及的表達肺炎支原體蛋白的工程菌株為大腸埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-28a-rMP-pl 16，其保藏編號為CGMCCN0.8895，于2014年03月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖，其中M表示Marker，I表示擴增產(chǎn)物；
[0038]圖2是表達質(zhì)粒pET-28a-rMP_pll6的構(gòu)建流程圖；
[0039]圖3是誘導后菌體12% SDS — PAGE電泳圖，其中M表示Marker，I表示目的蛋白?！揪唧w實施方式】
[0040]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護范圍。
[0041 ] 實施例1肺炎支原體蛋白的制備
[0042]1.1肺炎支原體蛋白抗原表位篩選及目的基因克隆
[0043]通過計算機分析肺炎支原體的全部氨基酸序列篩選出肺炎支原體蛋白的強抗原表位，所述的重組蛋白質(zhì)從N-末端到C-末端依次含有MP129-B7基因組中pl 16從N-末端第11位到第289位核苷酸，和第339位到第421位核苷酸的421個氨基酸。其中上述重組蛋白質(zhì)的DNA序列如SEQIDN0.2所示。
[0044]根據(jù)肺炎支原體MP129-B7基因組中目的肽段的cDNA序列和質(zhì)粒上的酶切位點，設計兩對PCR引物(Pl，P2)和(P3，P4)。pl和p2用于擴增pll6中第11位到第304位核苷酸，P3和p4用于擴增pll6第389位到第465核苷酸；引物pl和p4分別帶有BamHI和XhoI的酶切位點，引物p2和p3部分核苷酸序列互補。
[0045]引物序列如下:
[0046]Pl:ATAGGATCCGGGCACAGATATGGGAATGACCAC
[0047]P2:CAGGGTGGCTTTGGAAGATTCCGAGTCCGTGGAGGGTAA
[0048]P3:TCGGAATCTTCCAAAGCCACCCTGATCTTAATCAAACCC
[0049]P4:
[0050]TATCTCGAGTTAATGATGGTGATGGTGATGCCAGAGGAACCTACTTTTTTCCC
[0051]上述引物由(華美生物技術有限公司)合成。
[0052]以肺炎支原體培養(yǎng)物(中國預防醫(yī)學科學院病毒研究所贈)為模板，以引物Pl和P2擴增pll6第11位到第304位核苷酸片段，以引物P3和P4擴增pll6第389位到第465核苷酸片段；再以第一輪PCR擴增得到的兩片段為模板，加入引物Pl和P4，擴增pll6片段；得到串聯(lián)的目的基因重組片段P116 ;擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如附圖1所示。切割含目的DNA條帶的膠塊，用DNA快速純化試劑盒(購自六合通-北京TAKARA公司，產(chǎn)品名稱:TAKARA MiniBESTPlasmidpurification)回收目的DNA，操作按產(chǎn)品說明書進行。
[0053]1.2表達載體pET-28a-rMP_pll6的構(gòu)建及鑒定
[0054]pET_28a載體(購自華美生物技術有限公司)與PCR擴增產(chǎn)物目的DNA片段經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切，產(chǎn)物純化(采用TAKARAMiniBESTPlasmidpurification試劑盒，購自六合通-北京TAKARA公司)后經(jīng)T4DNA連接酶與載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)(購自華美生物技術有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落，堿裂解法抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳選擇可疑重組質(zhì)粒作為模板進行PCR擴增，對有擴增產(chǎn)物的重組子質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切、鑒定，其中有3個重組子為陽性重組子。從3個陽性重組子中選一個陽性重組子送賽百勝公司測序鑒定，結(jié)果表明該質(zhì)粒上確實插入了目的基因，且插入方向正確，將此重組質(zhì)粒命名為表達質(zhì)粒 pET-28a-rMP-pll6。
[0055]1.3表達肺炎支原體蛋白的工程菌的構(gòu)建
[0056]將表達質(zhì)粒pET-28a-rMP_pll6用化學轉(zhuǎn)化法((美)J.薩姆布魯克(JosephSambrook),(美)D.W.拉塞爾(DavidW.Russell)著，黃培堂等譯.分子克隆實驗指南.科學出版社，2002.)轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌BL21 (DE3)菌株(購自華美生物技術有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導表達5小時，誘導后的菌體用12% SDS 一 PAGE分析(同上文獻)，結(jié)果如附圖3所示，確定表達肺炎支原體蛋白的菌株即為所需的工程菌株大腸埃希氏菌 Escherichiacoli YNTpET-28a_rMP-pll6 (CGMCCN0.8895)，用甘油冷凍保存。
[0057]1.4重組肺炎支原體蛋白的表達制備及純化[0058]誘導培養(yǎng)已構(gòu)建的表達肺炎支原體蛋白的大腸埃希氏菌，用IPTG誘導表達5小時，離心收集菌體，以1:10 (W/V)加入菌體裂解液(50mmpH8.0Tris-Cl，50mmNaCl，50%甘油)，加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子攪拌30分鐘，經(jīng)超聲破菌(冰浴，功率200W，超聲3秒，間隔5秒，超聲80次)、組氨酸親和柱(300ml200mm的NiCl2過柱，流速5ml/min ；500ml平衡緩沖液洗注，流速10ml/min ;超聲離心后的沉淀用200ml平衡緩沖液稀釋后上樣,流速3ml/min, 500ml平衡緩沖液洗注，流速5ml/min ;用分別含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的洗脫緩沖液洗脫，紫外檢測儀280nm檢測吸收值，收集洗脫峰；SDS — PAGE電泳檢測純化組分)得到純化的重組蛋白。1.5肺炎支原體重組融合蛋白鑒定
[0059]1.5.1純度和分子量的測定:經(jīng)SDS — PAGE電泳檢測(蛋白上樣量10 μ g)，為單一區(qū)帶，薄層掃描鑒定純度為95.8%。分子量約為49Kd，檢測結(jié)果見附圖3。
[0060]1.4.2濃度測定:經(jīng)Folin-酚法測定，以牛血清白蛋白作為標準參比品，抗原蛋白濃度為 5.0±0.5mg/mL。
[0061]1.4.3 重組蛋白 Western-blot 驗證
[0062]為驗證重組rMP_pll6型蛋白質(zhì)與抗MP抗血清反應性及重組目的基因獲得表達并具有抗原性，用Western-blot法進行了測試。陽性血清為:10份兔抗MP抗體陽性血清(購自北京百安天地醫(yī)藥科技有限公司)和30份人抗MP抗體陽性血清(經(jīng)ELISA法檢測證實)。陰性血清為:10份對照正常兔血清和30份人抗MP抗體陰性血清(經(jīng)ELISA法檢測證實)。結(jié)果如表1。
[0063]表1重組蛋白Western-blot驗證結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種編碼肺炎支原體蛋白核酸，如SEQIDN0.1所示。
2.一種肺炎支原體蛋白，其特征在于它由權(quán)利要求1所述的核酸編碼，其氨基酸序列如 SEQIDN0.2 所示。
3.包含權(quán)利要求1所述核酸的肺炎支原體蛋白的表達載體，其特征在于它是將權(quán)利要求I所述的核酸插入到質(zhì)粒pET-28a上得到的重組pET-28a-rMP-pll6質(zhì)粒。
4.一株表達肺炎支原體蛋白的工程菌株，其特征在于它含有權(quán)利要求3所述的表達載體pET-28a-rMP-pll6，宿主菌為大腸桿菌，保藏編號為CGMCCN0.8895。
5.一種重組肺炎支原體蛋白的制備方法，其特征在于I)獲得具有SEQIDN0.1所示的核苷酸序列； 2)將該核苷酸序列導入質(zhì)粒，優(yōu)選pET-28a質(zhì)粒； 3)將該質(zhì)粒導入原核宿主細胞，優(yōu)選大腸桿菌宿主細胞，更優(yōu)選BL21(DE3)菌株中； 4)培養(yǎng)所述宿主細胞； 5)回收、純化及復性所表達的重組蛋白。
6.一種檢測肺炎支原體感染的試劑盒，其特征在于其組分中的抗原是根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺炎支原體蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測肺炎支原體感染的試劑盒，其特征在于所述抗原是以膠體金標記的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測肺炎支原體感染的試劑盒，其特征在于所述肺炎支原體抗原劃線包被濃度為1.0mg/ml，膠體金結(jié)合物噴點量為60.0 μ L/cm2，兔抗肺炎支原體抗體包被量為1.0 μ 1/cm,包被濃度為5.0mg/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺炎支原體蛋白在制備檢測試劑盒中的應用。
【文檔編號】C12R1/19GK103834668SQ201410097117
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】張秀杰, 張曉剛, 華艷 申請人:英諾特（唐山）生物技術有限公司