一種重組人柯薩奇病毒b組蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種編碼重組人柯薩奇病毒B組蛋白的重組DNA，提供了一種重組人柯薩奇病毒B組蛋白，提供了一種重組人柯薩奇病毒B組蛋白的制備方法，提供了一種檢測人柯薩奇病毒B組感染的試劑盒，以及提供了一種將所述重組人柯薩奇病毒B組蛋白用于檢測人柯薩奇病毒B組感染的用途。本發(fā)明的重組DNA具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，本發(fā)明提供的重組人柯薩奇病毒B組蛋白制備的診斷試劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，很好的滿足了人柯薩奇病毒B組感染臨床診斷的需要。
【專利說明】—種重組人柯薩奇病毒B組蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程、疫苗研制和診斷試劑等領(lǐng)域，具體地涉及一種編碼重組人柯薩奇病毒B組蛋白的重組DNA，一種重組人柯薩奇病毒B組蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]柯薩奇病毒(Coxsackievirus)是一種腸病毒(enteroviruses),分為A和B兩類，是常見的經(jīng)呼吸道和消化道感染人體的病毒。感染后人會出現(xiàn)發(fā)熱、打噴嚏、咳嗽等感冒癥狀。妊娠期感染可引起非麻痹性脊髓灰質(zhì)炎性病變，并致胎兒宮內(nèi)感染和致畸。
[0003]柯薩奇病毒A組有23型病毒，B組有6型病毒。通過型特異性抗原，經(jīng)中和試驗，ELISA方法等可以對各型進行鑒定。[0004]柯薩奇病毒所有的B組及A組的第9型有共同的組特異性抗原，在B組內(nèi)病毒之間有交叉反應(yīng)，但是A組病毒沒有共同的組特異性抗原。A組某些型別的型特異性抗原可在37 °C引起人類O型紅細(xì)胞凝集反應(yīng)。
[0005]柯薩奇B組病毒(coxsackievirusgroupB,CVB)感染自1954年在美國紐約州柯薩奇鎮(zhèn)發(fā)生及被報道以來，除引起新生兒散發(fā)感染外，也陸續(xù)在世界的某些地區(qū)發(fā)生了多次流行。主要侵犯免疫力低下的圍生兒?？滤_奇B組病毒包括柯薩奇BI，柯薩奇B2，柯薩奇B3，柯薩奇B5幾種病毒。
[0006]柯薩奇B組病毒是微小RNA病毒科腸道病毒屬成員，病毒性心肌炎的病例中大約有20%-25%是由柯薩奇B組病毒引起。CVB的致病機制十分復(fù)雜，病毒基因組以及病毒蛋白均在病毒致病過程中發(fā)揮重要作用。因此，對柯薩奇B組病毒的基因組、結(jié)構(gòu)蛋白以及某些非結(jié)構(gòu)蛋白與靶細(xì)胞內(nèi)分子間相互作用生物信息的認(rèn)識是闡述該病分子機制的基礎(chǔ)。
[0007]實驗室檢查是本病早期和確定診斷的主要依據(jù)，主要包括病毒分離，血清學(xué)特異性抗體的檢測等。但分離培養(yǎng)耗時長，必須在早期進行分離才能提高病原體的陽性檢出率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種編碼重組人柯薩奇病毒B組蛋白的重組DNA，提供一種重組人柯薩奇病毒B組蛋白，提供一種重組人柯薩奇病毒B組蛋白的制備方法，提供一種檢測人柯薩奇病毒B組感染的試劑盒，以及提供一種將所述重組人柯薩奇病毒B組蛋白用于檢測人柯薩奇病毒B組感染的用途。
[0009]本發(fā)明提供了一種編碼重組人柯薩奇病毒B組蛋白的重組DNA，該重組DNA的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。
[0010]本發(fā)明提供了一種包含所述重組DNA的人柯薩奇病毒B組蛋白的表達載體，它是將權(quán)利要求1所述的重組DNA插入到質(zhì)粒pET-30a上得到的重組pET-30a_C0XB質(zhì)粒，其質(zhì)粒圖譜如附圖2所示。
[0011 ] 本發(fā)明提供了一種重組人柯薩奇病毒B組蛋白，它由所述重組DNA編碼，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。[0012]本發(fā)明提供了一種重組人柯薩奇病毒B組蛋白的制備方法，包括以下步驟:
[0013]I)獲得具有SEQIDN0:1所示核苷酸序列的重組DNA ；
[0014]2)將所述重組DNA導(dǎo)入質(zhì)粒，構(gòu)建表達載體；
[0015]3)將所得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞；；
[0016]4)在有利于所述核苷酸序列表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，表達由所述重組DNA編碼的重組人柯薩奇病毒B組蛋白；
[0017]5)回收、純化及復(fù)性所表達的重組蛋白。
[0018]所述原核宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選BL21 (DE3)菌株。
[0019]所述質(zhì)粒優(yōu)選為pET_30a質(zhì)粒。
[0020]上述步驟4)中的培養(yǎng)條件為:37°C培養(yǎng)3小時后(轉(zhuǎn)速200r/min)，加入誘導(dǎo)劑(終濃度為lmmol/mL)，37°C誘導(dǎo)表達5小時(轉(zhuǎn)速200r/min)。
[0021]本發(fā)明提供了一種表達重組人柯薩奇病毒B組蛋白的工程菌株，該菌株含有所述表達載體pET-30a_C0XB,該工程菌株是大腸埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-30a_C0XB,其菌種保藏號為CGMCCN0.88 92，該菌株于2014年03月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
[0022]本發(fā)明提供了一種檢測人柯薩奇病毒B組感染的試劑盒，其組分中的抗原是本發(fā)明所述的重組人柯薩奇病毒B組蛋白，用于標(biāo)記所述重組人柯薩奇病毒B組蛋白的標(biāo)記物選自膠體金或辣根過氧化物酶(HRP )。
[0023]本發(fā)明所述的采用膠體金標(biāo)記抗原的試劑盒中，抗人IgG抗體劃線包被濃度為1.0mg/ml, COXB抗原膠體金復(fù)合物在濃縮原液到稀釋一倍之間包被載金墊,抗人IgG抗體劃線量為1.0 μ 1/cm，膠體金結(jié)合物噴點量為60.0μ 1/cm2，羊抗鼠IgG抗體包被量為
1.0 μ Ι/cm,包被濃度為 1.0mg/ml。
[0024]本發(fā)明提供了一種將所述的重組人柯薩奇病毒B組蛋白用于檢測人柯薩奇病毒B組感染的用途。
[0025]以下將更詳細(xì)的描述本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0026]本發(fā)明公開了一種編碼重組人柯薩奇病毒B組蛋白的重組DNA，該重組DNA如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，利用該重組DNA制備重組人柯薩奇病毒B組蛋白的方法，由該方法制備的包含SEQIDN0:2所示氨基酸序列的重組人柯薩奇病毒B組蛋白，以及包含該蛋白的組合物和試劑盒，同時還公開了它們在檢測人單純皰疹病毒感染方面的用途。
[0027]具有SEQIDN0:1所示核苷酸序列的重組DNA可以通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備。選擇其強抗原表位，即柯薩奇病毒B4基因組(Genbank:AFR79234.1，菌株為JX308222.1)中DNA序列為模板，設(shè)計兩對PCR引物(Pl，P2)和(P3，P4)。引物Pl和P2用于擴增片段I，引物P3和P4用于擴增片段2，引物Pl和P4分別帶有BamHI和XhoI的酶切位點，并共同對應(yīng)于目的片段的5’末端3’末端，引物p2和p3順序互補。
[0028]引物序列如下:
[0029]Pl:5，-GCTACTCATGGCTCGGGATCCGAAATGCAATCAGC-3’
[0030]P2:5， -CACAGATGACTCACCCGTGGCTGCGTTCT-3’
[0031]P3:5， -GAACGCAGCCACGGGTGAGTCATCTGTGGAG-3’[0032]P4:5，-ATACTCGAGTTAACCCTCAGTCCAAAAGAT-3’
[0033]由于選取了親水性較強的序列，本發(fā)明對上述核苷酸序列的核酸分子采用適當(dāng)載體和宿主細(xì)胞表達時可以大大提高表達產(chǎn)率。
[0034]本發(fā)明的一個實施方案涉及應(yīng)用具有如SEQIDN0:1所示的核苷酸序列的重組DNA制備重組人柯薩奇病毒B組蛋白的方法。根據(jù)常規(guī)方法，可將含編碼重組人柯薩奇病毒B組蛋白的如SEQIDN0:1所示核苷酸序列的重組DNA分子連接到一個表達載體中，然后通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通常，優(yōu)選原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本發(fā)明的載體構(gòu)建。例如，大腸桿菌等腸科桿菌。
[0035]編碼本發(fā)明蛋白的重組DNA與pET_30a質(zhì)粒形成的重組質(zhì)粒具有高度的穩(wěn)定性，有利于本發(fā)明的蛋白的表達。
[0036]在本發(fā)明的一個實施方案中，如圖2所不,制備含有SEQIDN0:1所不核苷酸序列的重組DNA分子和pET-30a質(zhì)粒的表達構(gòu)建體，并將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，收集菌體?？刹捎贸Ｒ?guī)的純化方法純化所得到的蛋白。[0037]本發(fā)明的一個實施方案涉及用上述方法制備、純化的重組人柯薩奇病毒B組蛋白，該蛋白具有SEQIDN0:2所不氣基酸序列。
[0038]本發(fā)明的一個實施方案涉及包含本發(fā)明人柯薩奇病毒B組蛋白的組合物和試劑盒。所述組合物或試劑盒可制備成檢測人柯薩奇病毒B組感染的試劑或試劑盒形式，在臨床上用于方便、快速和準(zhǔn)確的人柯薩奇病毒B組感染。任何生物學(xué)樣品，只要它們含有人柯薩奇病毒B組抗體，就可用本發(fā)明蛋白，包含該蛋白的組合物或試劑盒來檢測。
[0039]本文所述“試劑盒”是指利用本發(fā)明蛋白完成人柯薩奇病毒B組感染檢測而組配制成的成套試劑。該試劑盒用于診斷人柯薩奇病毒B組感染。本發(fā)明試劑盒可包括其它多個容器，其中可分別含有檢測所用的標(biāo)準(zhǔn)品，抗體或經(jīng)過標(biāo)記的抗體、酶，底物或緩沖液等。在該試劑盒中，還包括標(biāo)簽和包裝插頁用以提供試劑盒的使用說明。還可包括符合用戶需要的其它材料，如微量滴定板等。
[0040]在用于人柯薩奇病毒B組感染檢測的試劑盒中，本發(fā)明的人柯薩奇病毒B組蛋白也可以是經(jīng)過標(biāo)記的。具體可使用酶、金屬螯合物等標(biāo)記。優(yōu)選的標(biāo)記性酶例如，辣根過氧化物酶，過氧化物酶，堿性磷酸酶等。優(yōu)選的金屬物質(zhì)有膠體金等。
[0041]有益效果
[0042]本發(fā)明提供的COXB蛋白抗原具有高特異性、強免疫原性和盡量完整的抗原決定簇，采用本發(fā)明提供的重組人柯薩奇病毒B組蛋白制備的診斷試劑盒，可以檢測全部重組人柯薩奇病毒B組病毒的感染，而不是某個亞型病毒的感染，因此與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，很好的滿足了人柯薩奇病毒B組感染臨床診斷的需要。
[0043]本發(fā)明涉及的大腸埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-30a-C0XB，其菌種保藏號為CGMCCN0.8892，該菌株于2014年03月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1是PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖，其中，泳道I是擴增產(chǎn)物，泳道2是核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0045]圖2是重組表達質(zhì)粒pET-30a_C0XB的構(gòu)建流程圖。
[0046]圖3是誘導(dǎo)后菌體12% SDS 一 PAGE電泳圖，其中，泳道I是誘導(dǎo)后的結(jié)果，泳道2是誘導(dǎo)前的結(jié)果，泳道3是純化后的結(jié)果，泳道4是標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。
【具體實施方式】
[0047]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護范圍。
[0048]實施例1重組人柯薩奇病毒B組蛋白的制備
[0049]1.1重組人柯薩奇病毒B組蛋白抗原表位篩選及目的基因克隆
[0050]通過計算機分析柯薩奇病毒B4型(Genbank:AFR79234.1，菌株為JX308222.1)的全部氨基酸序列，篩選出人柯薩奇病毒B組的特異性蛋白的優(yōu)勢抗原表位，包括柯薩奇病毒B組蛋白從N-末端第1162位到第1434位的273位核苷酸(片段I)和從第2626位到第2970位的345位核苷酸(片段2)。編碼所述重組蛋白質(zhì)的重組DNA序列如SEQIDN0.1所示。
[0051]根據(jù)目的片段的DNA序列，即COXB的目的肽段的cDNA序列和質(zhì)粒上的酶切位點，設(shè)計兩對PCR引物(P1，P2)和(P3，P4)。引物Pl和P2用于擴增片段1，引物P3和P4用于擴增片段2，引物Pl和P4分別帶有BamH I和XhoI的酶切位點，并共同對應(yīng)于目的片段的5’末端3’末端，引物p2和p3順序互補。
[0052]引物序列如下: [0053]Pl:5，-GCTACTCATGGCTCGGGATCCGAAATGCAATCAGC-3’
[0054]P2:5， -CACAGATGACTCACCCGTGGCTGCGTTCT-3’
[0055]P3:5， -GAACGCAGCCACGGGTGAGTCATCTGTGGAG-3’
[0056]P4:5，-ATACTCGAGTTAACCCTCAGTCCAAAAGAT-3’
[0057]以上引物由華美生物技術(shù)有限公司合成。
[0058]以柯薩奇病毒B4病毒培養(yǎng)物(中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所贈)為模板，以引物Pl和P2、P3和P4分別擴增片段I和片段2 ;再以第一輪PCR擴增得到的兩片段為模板，加入引物Pl和P4，擴增目的DNA片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如附圖1所示。切割含目的DNA條帶的膠塊，用DNA快速純化試劑盒(購自六合通-北京TAKARA公司，產(chǎn)品名稱:TAKARAMiniBESTPlasmidpurification)回收目的DNA，操作按產(chǎn)品說明書進行。
[0059]1.2重組表達載體pET-30a_C0XB的構(gòu)建及鑒定
[0060]pET_30a載體(購自華美生物技術(shù)有限公司)與PCR擴增產(chǎn)物目的DNA片段經(jīng)BamHI 和 XhoI 雙酶切，產(chǎn)物純化(米用 TAKARAMiniBESTPlasmid purification 試劑盒，購自六合通-北京TAKARA公司)后，經(jīng)T4DNA連接酶與載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(購自華美生物技術(shù)有限公司)，涂布于含卡那霉素(終濃度為50 μ g/mL)的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落，堿裂解法抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳選擇可疑重組質(zhì)粒作為模板進行PCR擴增，對有擴增產(chǎn)物的重組子質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切、鑒定，其中有3個重組子為陽性重組子。從3個陽性重組子中選一個陽性重組子送賽百勝公司測序鑒定，結(jié)果表明該質(zhì)粒上確實插入了目的基因，且插入方向正確，將此重組質(zhì)粒命名為表達質(zhì)粒pET-30a-C0XB。
[0061]1.3表達重組人柯薩奇病毒B組型蛋白的工程菌的構(gòu)建[0062]將表達質(zhì)粒pET-30a_C0XB用化學(xué)轉(zhuǎn)化法((美)J.薩姆布魯克(JosephSambrook),(美)D.W.拉塞爾(DavidW.Russell)著，黃培堂等譯.分子克隆實驗指南.科學(xué)出版社，2002.)轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌BL21 (DE3)菌株(購自華美生物技術(shù)有限公司)，涂布于含卡那霉素(終濃度為50μ g/mL)的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落用含卡那霉素(終濃度為50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG (終濃度為Immo I/mL)誘導(dǎo)表達5小時，誘導(dǎo)后的菌體用12% SDS 一 PAGE分析(同上文獻)，結(jié)果如附圖3所示，確定表達重組人柯薩奇病毒B組蛋白的菌株即為所需的工程菌株，用甘油冷凍保存。該菌株于2014年03月04日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為 CGMCCN0.8892。
[0063]1.4重組人柯薩奇病毒B組蛋白的表達制備及純化
[0064]誘導(dǎo)培養(yǎng)已構(gòu)建的表達重組人柯薩奇病毒B組蛋白的大腸埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-30a_C0XB,用 IPTG (終濃度為 Immol/mL)誘導(dǎo)表達 5 小時,離心收集菌體，以1:10(1八)加入菌體裂解液(50臟?!18.0Tris-Cl, 50mmNaCl, 50%甘油)，加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子攪拌30分鐘，經(jīng)超聲破菌(冰浴，功率200W，超聲3秒，間隔5秒，超聲80次)、組氨酸親和柱(300ml200mm的NiCl2過柱,流速5ml/min ；500mlPBS緩沖液洗注,流速10ml/min ；超聲離心后的上清液用200mlPBS稀釋后上樣，流速3ml/min ；500mlPBS緩沖液洗注，流速5ml/min ;用分別含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的PBS緩沖液洗脫，紫外檢測儀280nm檢測吸收值，收集洗脫峰；SDS — PAGE電泳檢測純化組分)得到純化的重組蛋白。
[0065]1.5 重組蛋白 Western-blot 驗證
[0066]為驗證重組COXB蛋白質(zhì)與抗COXB血清反應(yīng)性及重組目的基因獲得表達并具有抗原性，用Western-blot法進行了測試。陽性血清為:10份兔抗COXB抗體陽性血清(購自北京百安天地醫(yī)藥科技有限公司)和30份人抗COXB抗體陽性血清(經(jīng)ELISA法檢測證實)。陰性血清為:10份對照正常兔血清和30份人抗COXB抗體陰性血清(經(jīng)ELISA法檢測證實)。結(jié)果如表1。
[0067]表1重組蛋白Western-blot驗證結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種編碼重組人柯薩奇病毒B組蛋白的重組DNA，其特征在于該重組DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.包含權(quán)利要求1所述重組DNA的人柯薩奇病毒B組蛋白的表達載體，其特征在于它是將權(quán)利要求1所述的重組DNA插入到質(zhì)粒pET-30a上得到的重組pET-30a_C0XB質(zhì)粒。
3.一種重組人柯薩奇病毒B組蛋白，其特征在于它由權(quán)利要求1所述重組DNA編碼，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。
4.一種重組人柯薩奇病毒B組蛋白的制備方法，包括以下步驟: 1)獲得具有SEQIDN0:1所示核苷酸序列的重組DNA； 2)將所述重組DNA導(dǎo)入質(zhì)粒，構(gòu)建表達載體； 3)將所得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞；； 4)在有利于所述核苷酸序列表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，表達由所述重組DNA編碼的重組人柯薩奇病毒B組蛋白； 5)回收、純化及復(fù)性所表達的重組蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述原核宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞BL21(DE3)菌株。
6.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于所述質(zhì)粒為pET-30a質(zhì)粒。
7.—種表達重組人柯薩奇病毒B組蛋白的工程菌株,其特征在于該菌株含有權(quán)利要求2所述的表達載體pET-30a-C0XB，該工程菌株的菌種保藏號為CGMCCN0.8892。
8.—種檢測人柯薩奇病毒B組感染的試劑盒，其特征在于其組分中的抗原是根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人柯薩奇病毒B組蛋白，用于標(biāo)記所述重組人柯薩奇病毒B組蛋白的標(biāo)記物選自膠體金或辣根過氧化物酶(HRP )。
9.將權(quán)利要求2所述的人柯薩奇病毒B組蛋白用于檢測人柯薩奇病毒B組感染的用途。
【文檔編號】C12N15/41GK103834671SQ201410098277
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】張秀杰, 華艷, 張曉剛 申請人:北京英諾特生物技術(shù)有限公司