日照海蟬的dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列以及基于該基因序列的物種鑒定方法
【專利摘要】日照海蟬的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列以及基于該基因序列的物種鑒定方法，涉及物種鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及日照海蟬的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列以及基于該基因序列的物種鑒定方法。所述DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)镃OI基因，具有如SEQIDNO.1所示的基因序列。所述的鑒定方法是：從待測(cè)組織中分離提取DNA，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出目的基因，擴(kuò)增反應(yīng)中所使用的一對(duì)引物的序列如下：正向引物5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，反向引物5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。本發(fā)明獲得的基因序列有利于實(shí)現(xiàn)日照海蟬的分子鑒定，能有效縮短日照海蟬的鑒定時(shí)間。
【專利說(shuō)明】日照海蟬的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列以及基于該基因序列的物種鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及物種鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及日照海蟬的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列以及基于該基因序列的物種鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]日照海蟬，是日照當(dāng)?shù)厮追Q為“海知了”的一種生物，其形似陸上幼蟬，學(xué)名為解放眉足蟹，又稱海蟬蟹，是一種介于蝦和蟹之間的海洋甲殼動(dòng)物。在中國(guó)大陸沿海，僅產(chǎn)于山東日照沿海一帶，為正宗日照特產(chǎn)。海蟬蟹經(jīng)煎炒后，入口香脆，鮮美異常，其肉質(zhì)味美媲美龍蝦，富含鈣磷鉀等礦物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)豐富。近年來(lái)由于解放眉足蟹被作為海鮮特色菜端上餐桌，消費(fèi)者對(duì)解放眉足蟹的需求量大大增加，從而導(dǎo)致了其采挖量的隨之增高；加之沿海污染物的排放破壞了其生存環(huán)境，嚴(yán)重影響了解放眉足蟹的繁殖成活率；所以解放眉足蟹的生存數(shù)量一直處于下降的趨勢(shì)。因此，對(duì)日照海蟬地方特有物種進(jìn)行搶救性收集、保護(hù)已刻不容緩。
[0003]DNA條形碼(DNA barcoding)是一段標(biāo)準(zhǔn)的，能快速、高效鑒定物種的DNA序列。這個(gè)概念的產(chǎn)生是受在零售業(yè)中條形碼技術(shù)應(yīng)用的啟發(fā)。DNA條形碼技術(shù)就像在零售業(yè)中廣泛運(yùn)用的商品條形碼一樣，通過(guò)對(duì)一個(gè)生物實(shí)體的一個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)行掃描，來(lái)鑒定物種和發(fā)現(xiàn)新種，以期建立起DNA序列和生物物種之間一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。隨著分子生物技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，DNA條形碼一這種新興的技術(shù)己經(jīng)得到了許多領(lǐng)域的越來(lái)越多的科學(xué)家的關(guān)注，利用DNA條形碼發(fā)現(xiàn)新物種或隱存種，鑒定瀕危物種和鑒別外來(lái)入侵種的工作方興未艾 ，并為保護(hù)生物多樣性作出了巨大的貢獻(xiàn)。
[0004]物種識(shí)別鑒定是認(rèn)識(shí)自然的第一步，也是分類學(xué)乃至幾乎所有的生物領(lǐng)域上的研究至關(guān)重要的基礎(chǔ)步驟。因此，正確認(rèn)識(shí)和區(qū)分物種，特別是對(duì)那些具有保護(hù)意義的種類，分類鑒定工作就顯得尤其重要。海洋生物占據(jù)著全球物種量中的很大一部分，目前己被發(fā)現(xiàn)的海洋生物約有21萬(wàn)種，對(duì)如此龐大的海洋生物群體進(jìn)行分類是一項(xiàng)非常艱巨的工作。自2003年Hebert對(duì)DNA條形碼開(kāi)展研究以來(lái)，越來(lái)越多的研究表明DNA條形碼在物種分類上具有高效可行性。近幾年，DNA條形碼技術(shù)己被應(yīng)用到海洋生物的分類研究中。
[0005]相對(duì)于其他海洋生物，DNA條形碼技術(shù)在魚類分類研究和應(yīng)用更為廣泛。目前己獲得5000多種魚類的DNA條形碼序列，其中多數(shù)為海洋魚類，并建立了專門的魚類條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，計(jì)劃獲得全球1.5萬(wàn)多種海洋魚類的條形碼數(shù)據(jù)，每個(gè)物種至少5條記錄。在其他海洋生物中，DNA條形碼研究也已經(jīng)逐漸開(kāi)展。劉君等研究了 DNA條形碼技術(shù)在貽貝科種類鑒定中的應(yīng)用，王鶴等研究了中國(guó)近海習(xí)見(jiàn)頭足類DNA條形碼及其分子系統(tǒng)進(jìn)化，梁華芳等對(duì)中國(guó)沿海龍蝦屬8種龍蝦COI基因DNA條形碼的分子系統(tǒng)學(xué)研究，王琳楠等對(duì)中國(guó)簾蛤目主要經(jīng)濟(jì)貝類的分子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，線粒體COI基因作為簾蛤目貝類條形碼在物種鑒定的適用性上提供了一定的依據(jù)，同時(shí)也為形態(tài)分類系統(tǒng)提供了必要補(bǔ)充。[0006]大量的研究結(jié)果都顯示以CO 基因?yàn)闃?biāo)記的DNA條形碼能夠準(zhǔn)確對(duì)海洋生物進(jìn)行物種鑒定，可以選用COI基因作為各海洋生物條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)條形碼。該方法與傳統(tǒng)的分類方法互為佐證，不僅可解決鑒定中標(biāo)本殘缺不全等問(wèn)題，而且有利于實(shí)現(xiàn)快速鑒定。目前，Genbank中已有部分蟬蟹的COI基因序列，但至今尚無(wú)日照海蟬的相關(guān)基因序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種日照海蟬的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列，以實(shí)現(xiàn)日照海蟬的快速鑒定。
[0008]本發(fā)明提供的日照海蟬的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列，其特征在于:所述DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)镃OI基因，具有如SEQ ID N0.1所示的基因序列。
[0009]本發(fā)明還提供了一種日照海蟬的物種鑒定方法，其特征在于包括以下步驟:
1)從待測(cè)組織中分離提取DNA;
2)以步驟I)提取到的DNA為模板，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出目的基因，擴(kuò)增反應(yīng)中所使用的一對(duì)引物的序列如下:
正向引物 5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，
反向引物 5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ ；
3)取適量步驟2)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的目的基因用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)嗅乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出709 bp的條帶，則送生物公司測(cè)序；
4)根據(jù)測(cè)序結(jié)果，如果與如SEQID N0.1所示的基因序列的同源性在98%以上，即可判斷該待測(cè)組織即為日照海蟬。
[0010]有益效果:
與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，本發(fā)明獲得的基因序列有利于實(shí)現(xiàn)日照海蟬的分子鑒定，能有效縮短日照海蟬的鑒定時(shí)間。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程圖；
圖2是待測(cè)樣本PCR擴(kuò)增后獲得的目的基因的電泳鑒定圖，編號(hào)說(shuō)明如下:泳道1-6均為目的基因，檢出大小為709 bp的條帶，M為DL2000的DNA marker。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋，本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。
[0013]實(shí)施例1
1、待測(cè)樣本的采集保存與處理
在魯南海濱森林公園(日照大沙洼)海邊采集待測(cè)樣本，取一部分肌肉組織，然后將樣品保存于95%酒精或-20°c的冰柜中。
[0014]2、DNA模板制備
酚-氯仿方法提取樣品中的DNA，于_20°C保存?zhèn)溆?。[0015]3、引物合成
正向引物:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’
反向引物:5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，
4、PCR擴(kuò)增
本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系如表1所示。
[0016]表1為待測(cè)樣本目的基因PCR反應(yīng)體系(50uL體系)
【權(quán)利要求】
1.日照海蟬的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列，其特征在于:所述DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)镃OI基因，具有如SEQ ID N0.1所示的基因序列。
2.一種日照海蟬的物種鑒定方法，其特征在于包括以下步驟: 1)從待測(cè)組織中分離提取DNA; 2)以步驟1)提取到的DNA為模板，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出目的基因，擴(kuò)增反應(yīng)中所使用的一對(duì)引物的序列如下:
正向引物 5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’， 反向引物 5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ ； 3)取適量步驟2)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的目的基因用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)嗅乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出709 bp的條帶，則送生物公司測(cè)序； 4)根據(jù)測(cè)序結(jié)果，如果與如SEQID N0.1所示的基因序列的同源性在98%以上，即可判斷該待測(cè)組織即為日照海蟬。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103937802SQ201410100160
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】劉豐銘 申請(qǐng)人:劉豐銘