鑒別檢測狗源性成分的pcr檢測引物試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及動(dòng)物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到狗源性PCR檢測試劑盒及其檢測方法。一種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測試劑盒，其主要特點(diǎn)在于包括雙蒸水，Mix；上游引物GF：5’-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’；下游引物GR：5’-TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’，Taq酶。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確、快速、可靠的鑒別狗的源性成分，對有效抵御狗源疾病疫病的傳播和蔓延以及各行業(yè)狗源產(chǎn)品真假鑒別具有重要的意義。
【專利說明】鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測引物試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到狗源性PCR檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]畜禽肉食品的動(dòng)物源性成分的鑒別檢測已涉及到肉食品的工業(yè)、進(jìn)出口貿(mào)易、市場及餐飲業(yè)等領(lǐng)域。目前國內(nèi)外利用分子標(biāo)記技術(shù)對畜禽源性成分鑒別方法做出了一定的研究工作。美國、意大利對牛源性成分的檢測進(jìn)行了研究，日本對牛、綿羊、豬、雞的動(dòng)物源性成分進(jìn)行了研究。國內(nèi)對畜禽源性成分鑒別檢測中的研究報(bào)道大多是對牛、羊、豬、雞、馬、驢、鹿等源性成分的檢測研究，但對狗源性成分鑒別檢測的研究報(bào)道幾乎沒有。隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展以及人們生活水平的提高，肉狗養(yǎng)殖和整體開發(fā)作為一個(gè)全新產(chǎn)業(yè)應(yīng)運(yùn)而生，掀起了肉狗養(yǎng)殖熱，取得了可觀的經(jīng)濟(jì)效益。然而，由于多年來對肉狗飼養(yǎng)的研究工作滯后，未能形成肉狗的規(guī)?；曫B(yǎng)，一些不法商販為獲取暴利，一些行為嚴(yán)重地?fù)p害了消費(fèi)者利益。另外，由于狗的屠宰比較分散，狗肉來源不明，動(dòng)物檢疫員上市場補(bǔ)檢，無法實(shí)施宰前、宰后檢疫程序，檢疫質(zhì)量得不到根本保證，從而存在極大的食品安全隱患。因此，研究出一種準(zhǔn)確、快速、可靠的鑒別檢測食品、非食用性動(dòng)物產(chǎn)品、飼料及飼料添加劑中狗源性成分的PCR引物就具有非常重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測引物及其試劑盒。以通過PCR擴(kuò)增準(zhǔn)確、快速、可靠的鑒別檢測食品、非食用性動(dòng)物產(chǎn)品、飼料及飼料添加劑等產(chǎn)品中的狗源性成分。
[0004]本發(fā)明的又一目的在于一種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測引物，其主要特點(diǎn)在于:
[0006]上游引物GF: 5，-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3 ’ ；
[0007]下游引物GR: 5 ’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3 ’。
[0008]一種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測試劑盒，其主要特點(diǎn)在于包括雙蒸水，Mix;上游引物 GF:5’-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’ ；下游引物 GR:5，-TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3，，Taq 酶。
[0009]一種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測方法，其主要特點(diǎn)在于，檢測步驟如下:
[0010](I)樣品采集:
[0011](2)基因組DNA的提??；
[0012](3) PCR反應(yīng)體系:雙蒸水3.4 μ L、Mix5 μ L、模版0.4 μ L、上游引物GF:5’ -GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’ 0.4 μ L、下游引物 GR:5’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’ 0.4 μ1^;丁&9酶0.4“1^，1(^1^體系；[0013]PCR 反應(yīng)條件:98°C預(yù)變性 Imin ;98°C變性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 lmin，31個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；
[0014](4)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:源性成分的檢測研究最初從飼料食品行業(yè)的畜產(chǎn)品開始，逐漸涉及到各個(gè)領(lǐng)域，技術(shù)不斷提高，范圍不斷擴(kuò)大。隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展以及人們生活水平的提高，狗養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)應(yīng)運(yùn)而生，取得了可觀的經(jīng)濟(jì)效益，但狗的養(yǎng)殖未能形成規(guī)?；曫B(yǎng)，一些不法商販為獲取暴利使用低價(jià)動(dòng)物肉源及副產(chǎn)品以次充好，損害了消費(fèi)者利益。另外，狗肉檢疫程序及質(zhì)量體系還不完善，存在極大的食品安全隱患。因此，研究出準(zhǔn)確、快速、可靠的鑒別狗源性成分的方法和技術(shù)，對有效抵御狗源疾病疫病的傳播和蔓延以及各行業(yè)狗源產(chǎn)品真假鑒別對具有重要的意義。
[0016]本發(fā)明利用滅菌超純水對狗DNA模板進(jìn)行稀釋，使其濃度分別降低到IlOng/ μ L、Ilng/ μ L、l.lng/ μ L> IlOpg/ μ L、llpg/ μ L、l.lpg/ μ L> IlOfg/ μ L> llfg/ μ L,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果可知，能檢測到的最低濃度為:llng/ul，即該引物的靈敏度是 llng/ul。
[0017]本發(fā)明具有準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0018]圖1是雞、鴨、鵝、鶴鵓、鴻子、鶴聘、馬、牛、羊、豬、5戶、兔子、魚、狗等動(dòng)物的基因組DNA的電泳檢測結(jié)果圖；
[0019]圖2狗PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；
[0020]圖3狗特異性基因片段的PCR檢測電泳圖；
[0021]圖4特異性PCR靈敏度驗(yàn)證圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0023]實(shí)施例1:一種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測引物，其主要特點(diǎn)在于:
[0024]上游引物GF: 5 ’ -GTTATTTGACTGCGTTAGG-3 ’ ；
[0025]下游引物GR: 5 ’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3 ’。
[0026]實(shí)施例2:—種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測試劑盒，其主要特點(diǎn)在于包括雙蒸7jC (3.4-340 μ L),Mix (5-50 μ L);上游引物 GF:5’-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’ (0.4-40 μ L)；下游引物 GR:5’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’ (0.4-40 μ L)，Taq 酶(0.4-40) μ L。(數(shù)量按1-100次計(jì)算)
[0027]實(shí)施例3:—種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測方法，其特征在于，檢測步驟如下:
[0028](1)樣品米集:常規(guī)米集試驗(yàn)動(dòng)物樣品。
[0029](2)基因組DNA的提取；采用氯仿抽提法或生物公司提供試劑盒。
[0030](3) PCR反應(yīng)體系:雙蒸水3.4 μ L、Mix5 μ L、模版0.4 μ L、上游引物GF:5，-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3，0.4 μ L、下游引物 GR:5，-TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3，0.4 μ1^;丁&9酶0.4“1^，1(^1^體系；
[0031] PCR 反應(yīng)條件:98°C預(yù)變性 Imin ;98°C變性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 lmin，31個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。
[0032]( 4 )擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0033]實(shí)施例4:一種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測方法，其檢測步驟如下:
[0034]1.總DNA的提取
[0035]采用氯仿抽提法或生物公司提供的試劑盒，發(fā)明人使用天根生化科技(北京)有限公司提供的試劑盒，提取雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴿子、鷓鴣、馬、牛、羊、豬、驢、兔子、魚、狗等動(dòng)物的基因組DNA，結(jié)果見圖1。
[0036]2.特異性引物設(shè)計(jì)
[0037]用于檢測狗源性成分的PCR特異性引物(只能擴(kuò)增出狗DNA限制性片段，而擴(kuò)增不出其它動(dòng)物DNA限制性片段)是根據(jù)狗的mtDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。
[0038]引物信息如下:
[0039]上游引物GF: 5，-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3 ’
[0040]下游引物GR: 5，-TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3，
[0041]擴(kuò)增序列長度為549bp。
[0042]3.狗 PCR 擴(kuò)增
[0043]利用設(shè)計(jì)的特異性引物GF和GR，以狗DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0044]PCR反應(yīng)體系
[0045]體系為:雙蒸水3.4μ L、Mix5 μ L、模版 0.4 μ L、引物(各)0.4μ L、Taq 酶 0.4μ L,10 μ L體系。
[0046]PCR反應(yīng)條件:
[0047]98°C預(yù)變性 Imin ;98°C變性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 lmin，31 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2，可以看出，擴(kuò)增出約549bp的DNA片段，與預(yù)期擴(kuò)增的片段長度相符。
[0048]4.引物的特異性驗(yàn)證:
[0049]利用所設(shè)計(jì)的特異性引物GF和FR，分別以狗、雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴿子、鷓鴣、馬、牛、羊、豬、驢、兔子、魚等動(dòng)物的總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的特異性。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3，該引物能夠從狗的DNA中擴(kuò)增出特異性的目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為549bp，而從其它動(dòng)物組織的DNA中均沒有能夠擴(kuò)增出目的條帶。5.擴(kuò)增狗DNA產(chǎn)物測序序列:
[0050]將狗PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后送測序公司測序。測序結(jié)果與GenBank中狗mt_DNA序列比對分析，結(jié)果表明:PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的測序如下，與狗mt-DNA段同源性達(dá)到96%。[0051 ] ttgtcagtaattgtcagtatctccaggtaaacccttcttccctcccctatgtacgtcgtg 60
[0052]cattaatggtttgccccatgcatataagcatgtacataatattatattcttacataggac 120
[0053]atatcaactcaatctcataattcattgatctgtcagcagtaatcaaatgcatatcactta 180
[0054]gtccaataagggcttaatcaccatgcctcgagaaaccatcaacccttgctcgtaatgtcc 240
[0055]ctcttctcgctccgggcccatactaacgtgggggttactatcatgaaactatacctggca 300
[0056]tctggttcttacctcagggccataactctatttactccaatcctactaattctcgcaaat 360
[0057]gggacatctcgatggactaatgactaatcagcccatgatcacacataactgtggtgtcat 420[0058]gcatttggtatcttttaatttttagggggggaatctgctatcactcatctacgaccgcaa 480
[0059]cggcactaactctaacttatcttctgctctcaggggatatgcccgtcgcggccctaacga 540
[0060]agtcaaata549
[0061]7.PCR的靈敏度驗(yàn)證
[0062]以滅菌超純水對狗DNA模板進(jìn)行稀釋，使其濃度分別降低到IlOng / μ LUlng /μ L>1.1ng / μ L>IlOpg / μ L>Ilpg / μ L>1.1pg / μ L>IlOfg / μ L>Ilfg / μ L,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖4，可知，能檢測到的最低濃度為:1.lng / ul，即該引物的靈敏度是1.1ng / ul。
[0063]實(shí)驗(yàn)例:
[0064]1.引物設(shè)計(jì)
[0065]根據(jù)GenBank中公布的狗mtDNA(AY729880)非保守區(qū)序列設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)軟件為vector NT10
[0066]2.檢測樣品基因組DNA提取
[0067]采用氯仿抽提法或商業(yè)提供的試劑盒，提取雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴿子、鷓鴣、馬、牛、羊、豬、驢、兔子、魚、狗等動(dòng)物的基因組DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。提取的基因組DNA均經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定其純度和濃度，測定0D260 / 0D280值均為1.76左右，說明DNA純度較高符合PCR擴(kuò)增要求。
[0068]3.狗源性成分PCR擴(kuò)增。
[0069]用步驟I設(shè)計(jì)的引物，以狗DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:雙蒸水3.4μ L、Μ?χ5μ L、模版0.4μ L、引物(各)0.4 μ L、Taq酶0.4 μ L，10 μ L體系。反應(yīng)條件為:98°C預(yù)變性 Imin ;98°C變性 30s，57°C退火 30s，72。。延伸 Imin, 31 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
[0070]4.電泳檢測
[0071]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0072]5.引物的特異性驗(yàn)證
[0073]用步驟I設(shè)計(jì)的引物，分別以狗、雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴿子、鷓鴣、馬、牛、羊、豬、驢、兔子、魚等動(dòng)物的總DNA為模板，按照步驟3反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的特異性。電泳檢測結(jié)果顯示，該引物能夠從狗的DNA中擴(kuò)增出特異性的目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為549bp，而從其它動(dòng)物種的DNA中均沒有能夠擴(kuò)增出目的條帶。
[0074]6.PCR靈敏度驗(yàn)證
[0075]用滅菌超純水對狗DNA模板進(jìn)行稀釋，使其濃度分別降低到IIOng/μ L、llng/μ LU.lng/μ LUlOpg/μ LUlpg/μ LU.lpg/μ L、IlOfg/μ L、llfg/μ L，然后按步驟 3 反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示，能檢測到的最低濃度為:1.lng/ul。
[0076] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0077]<110>畢節(jié)學(xué)院
<120>鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測引物試劑盒及其檢測方法<130>
<160>I
< 170>PatentIn version 3.3
<210>I
<211〉549
<212>DNA
<213>狗源性基 因序列
<400> I
Ugicagtaa Ugicaglat clccagglaa acccUcttc cctcccctal gtacgicglg60
cattaaiggi Ugccccalg catataagca tgtacataat attatattct tacataggac120
alatcaactc aaictcataa Ucaltgaic Igtcagcagl aatcaaalgc alatcactla180
gtccaataag ggcttaatca ccatgcctcg agaaaccatc aacccttgcl cglaalgl.cc240
clcttctcgc tccgggccca Iactaacglg ggggtlacta tcatgaaact atacctggca300
tciggilclt acclcagggc calaaclcla tllaclccaa icclactaat Iclcgcaaat360
gggacatclc gatggacIaa tgactaatca gcccalgatc acacaiaact glgglgtcat420
gcalllggla IclULaali Ulagggggg gaalclgcta tcaclcalct acgaccgcaa480
[0078]
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測引物，其特征在于: 上游引物 GF:5’ -GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’: 下游引物 GR:5’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’。
2.一種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測試劑盒，其特征在于包括雙蒸水；Mix ;上游引物 GF:5’ -GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’ ；下游引物61?:5’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’ ；Taq酶；
3.一種鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測方法，其特征在于，檢測步驟如下: (1)樣品采集: (2)基因組DNA的提??； (3)PCR反應(yīng)體系:雙蒸水3.4 μ L、Mix5 μ L、模版0.4 μ L、上游引物GF:5’ -GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’ 0.4 μ L、下游引物 GR:5’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’ 0.4 μ1^;丁&9酶0.4“1^，1(^1^體系； PCR反應(yīng)條件:98°C預(yù)變性Imin ;98°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸lmin，31個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 IOmin ； (4)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂 糖凝膠電泳檢測。
【文檔編號】C12N15/11GK103923979SQ201410101176
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】李麗娟, 王忻, 周建華, 袁曉龍 申請人:畢節(jié)學(xué)院