一種基因組dna提取方法及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基因組DNA提取方法及試劑盒，該試劑盒包含研磨器、溶液A（裂解液）、溶液B（DNA結(jié)合液）、溶液C（DNA洗滌液）、溶液D（DNA洗脫液）和純化柱。該發(fā)明的試劑盒，成本低廉，試劑成分簡(jiǎn)單，操作流程少，不僅適用于微生物基因組的提取而且還適用于動(dòng)物組織和植物組織的基因組的提取。同時(shí)提取基因組的過(guò)程耗時(shí)短（30min以?xún)?nèi)），提取的基因組質(zhì)量高，基因組條帶大小約為23kb，基因組的量可穩(wěn)定保持在1μg-30μg的范圍內(nèi)；提取的過(guò)程不會(huì)用到有毒的試劑苯酚、氯仿，能很好的滿(mǎn)足SouthernBlot，PCR，RFLP，DNA文庫(kù)構(gòu)建等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種基因組DNA提取方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基因組DNA提取試劑盒及提取方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]自PCR擴(kuò)增技術(shù)發(fā)明以來(lái)，生物分子學(xué)的研究突飛猛進(jìn)。對(duì)基因的研究己經(jīng)遍及醫(yī)療健康、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)及生物各學(xué)科領(lǐng)域。基因組DNA的提取是分子生物學(xué)研究的前提，在上述各領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。提取基因組DNA常用的方法是用物理方法破壁，例如液氮研磨和高溫加熱；或者是酶解，例如溶菌酶酶解；或者非離子表面活性劑處理例如，CTAB法(Walker WH等，1991)氯化芐法和SDS法(林福呈和王洪凱，2010)，細(xì)胞破壁和破膜后利用有機(jī)溶劑使用苯酚、氯仿、異戊醇的混合溶液使蛋白質(zhì)變性達(dá)到與DNA分離的目的。雖然這些方法能夠提取出高質(zhì)量的基因組DNA，但是提取過(guò)程中的這些有機(jī)溶劑對(duì)人體皮膚、呼吸道粘膜、眼睛等有較大的傷害，而且提取的基因組常有有機(jī)溶劑殘留，使得后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定；后來(lái)又出現(xiàn)了利用DNA吸附材料來(lái)達(dá)到蛋白質(zhì)與DNA分離的目的，同時(shí)也開(kāi)發(fā)了很多試劑盒來(lái)提取不同材料的基因組，雖然提取的基因組質(zhì)量很高但成本較高、通用性不強(qiáng)。但是不論是使用苯酚、氯仿等有機(jī)溶劑抽提還是使用DNA提取試劑盒來(lái)提取基因組，樣品的預(yù)處理始終是一個(gè)繁瑣和耗時(shí)的過(guò)程。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和酵母菌細(xì)胞壁非常堅(jiān)實(shí)，常見(jiàn)的提取基因組方法中都會(huì)加入溶菌酶消化細(xì)胞壁。對(duì)于人類(lèi)和動(dòng)物組織，需要加入蛋白酶K過(guò)夜處理使組織更分散。對(duì)于植物組織和絲狀真菌菌絲或者是真菌孢子，需要使用液氮研磨破壁。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克 服上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種快速基因組DNA提取試劑盒及其制備方法，該方法可以針對(duì)絕大多數(shù)生物樣品，操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、無(wú)毒無(wú)污染，高質(zhì)高效。
[0004]一種基因組DNA提取試劑盒，包括溶液A (裂解液)、溶液B (DNA結(jié)合液)、溶液C(DNA洗滌液)和溶液D (DNA洗脫液)；
[0005]溶液A(裂解液):10mM-50mM Tris-HCl pH8.0,10mM-50mM EDTA, 1%-10% (w/v)SDS,2M-4M NaCl，0.5%-2% (v/v)的 β -巰基乙醇；
[0006]溶液B (DNA結(jié)合液):2.5-6M的鹽酸胍或者異硫氰酸胍，20%_40% (v/v)異丙醇或者是無(wú)水乙醇，5mM-20mM EDTA, pH4.5-6.5 ；
[0007]溶液C (DNA 洗滌液):70%-80% (v/v)的無(wú)水乙醇，ρΗ4.5-6.5 ；
[0008]溶液D (DNA洗脫液):5-50 μ g/mL的RNA酶水溶液，用IM NaOH溶液將pH調(diào)到
7.0-8.5 ο
[0009]還包括研磨器:該研磨器可以為電動(dòng)組織研磨器或者小型的手提電鉆其轉(zhuǎn)速800-12000rpm,配有長(zhǎng)度為40-80mm,直徑3_7mm的錐形研磨件。
[0010]上述試劑盒的優(yōu)選配方
[0011]溶液A:50mM Tris_HCl、50mM EDTA、3%SDS、2M NaCl,1% 的 β _ 巰基乙醇，ρΗ8.0 ；[0012]溶液B:4M的鹽酸胍、20%異丙醇、IOmM EDTA, pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液；
[0013]溶液C:70%的無(wú)水乙醇、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液
[0014]溶液D:20 μ g/mL的RNA酶水溶液，用IM NaOH溶液將pH調(diào)到8.0。研磨器:轉(zhuǎn)速8000rpm、配有長(zhǎng)度為70mm,直徑5mm的錐形研磨件。
[0015]本發(fā)明的主要原理:研磨器在高速條件下產(chǎn)生的剪切力不僅能將絲狀真菌的細(xì)胞壁破碎，同時(shí)研磨杵與離心管壁的摩擦作用而產(chǎn)生較高的溫度(500C -700C )，有利于SDS裂解細(xì)胞。在研磨器、高溫和SDS的相互作用下，絲狀真菌的基因組DNA釋放出來(lái)。在2MNaCl溶液中DNA的溶解度最大。EDTA是金屬螯合劑能抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解。β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。DNA結(jié)合液提供一個(gè)高鹽低PH值的環(huán)境，在這種條件下，DNA可以與硅膠柱可逆結(jié)合。洗滌液是70%乙醇可以對(duì)硅膠柱脫鹽。DNA在pH7.0-8.5的低鹽溶液中，具有最大洗脫效率。洗脫液是含有RNA酶的堿性水溶液，能將硅膠柱上DNA洗脫下來(lái)。
[0016]本發(fā)明的另一方面是使用該試劑盒提取基因組DNA的方法，包括以下步驟:
[0017]1、樣品的預(yù)處理
[0018](I)取1.5mL的錐底離心管，加入0.1mg-1OOmg組織樣品或者IO6-1O9細(xì)胞樣品；
[0019](2)向(I)中加入 50 μ L-100 μ L 的溶液 A ;
[0020](3)開(kāi)動(dòng)研磨器研磨樣品30s_5min ；
[0021]2、樣品的過(guò)柱純化
[0022](4)向研磨好的菌絲中加入溶液A使樣品終體積在150 μ L左右；
[0023](5)漩渦振蕩器震蕩30s，使菌體盡量分散；
[0024](6)離心機(jī)轉(zhuǎn)速 10000g_12000g,離心 5min ；
[0025](7)小心取上清100 μ L至一新的1.5mL離心管中，加入300 μ L-600 μ L的溶液B，上下顛倒混勻；
[0026](8)將(7)的混合液加入純化柱中，10000g_12000g，離心30s_lmin ；
[0027](9)棄收集管中的液體，向純化柱中加入300 μ L-600 μ L的溶液B，10000g_12000g,離心 30s_lmin ；
[0028](10)棄收集管中的液體，向純化柱中加入500 μ L-700 μ L的溶液C，10000g_12000g,離心 30s_lmin ；
[0029](11)重復(fù)(10);
[0030](12)棄收集管中的液體，10000g-12000g，離心 2_5min ；
[0031](13)將(12)的純化柱轉(zhuǎn)移到一新的1.5mL離心管中，加入30-50 μ L的溶液D，37°C 放置 5min ；
[0032](14) 10000g-12000g,離心 l_2min ；
[0033](15) _20°C保存提取的基因組DNA溶液。
[0034]本發(fā)明提取 樣本的對(duì)象可以是培養(yǎng)細(xì)胞(動(dòng)物細(xì)胞或人類(lèi)細(xì)胞)或細(xì)菌(革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)或酵母菌等單細(xì)胞、人類(lèi)及動(dòng)物組織或者是植物組織或者是大型真菌組織、血液或骨髓、絲狀真菌(米曲霉、黑曲霉等)、真菌孢子(米曲霉孢子、黑曲霉孢子、靈芝孢子等)。但處理的樣本不同，裂解處理的步驟有所不同。[0035]a、對(duì)于樣本為培養(yǎng)細(xì)胞(動(dòng)物細(xì)胞或人類(lèi)細(xì)胞)或細(xì)菌(革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)或酵母菌等單細(xì)胞:所述樣品預(yù)處理步驟為:取ImL濃度≥ 1.0X 106/mL的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)速≥5000rpm的離心機(jī)中離心5min收集細(xì)胞，加入50 μ L-100 μ L的裂解液，并用研磨器研磨l_2min。
[0036]b、對(duì)于樣本為人類(lèi)及動(dòng)物組織或者是植物組織或者是大型真菌組織,例如,蘑菇、木耳等；所述預(yù)處理步驟為:將樣本剪碎或者是磨碎，轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中，樣品量控制在0.1mg-1OOmg加入50 μ L-100 μ L的裂解液，并用研磨器研磨3_5min。
[0037]C、對(duì)于樣本為血液或骨髓；所述預(yù)處理步驟為:取ImL血液,在轉(zhuǎn)速≥5000rpm的離心機(jī)中離心5min收集細(xì)胞,加入50 μ L-100 μ L的裂解液,并用研磨器研磨l_2min。
[0038]d、對(duì)于樣本為絲狀真菌，例如米曲霉、黑曲霉等。對(duì)于生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上的菌絲可以用牙簽或者移液器槍頭挑?。粚?duì)于生長(zhǎng)在液體培養(yǎng)基中菌絲可以用轉(zhuǎn)速≥1000Orpm的離心機(jī)中離心10min或者是過(guò)濾收集菌絲。菌絲量在0.1mg-1OOmg加入50 μ L-100 μ L的裂解液，并用研磨器研磨l_2min。
[0039]e、對(duì)于樣本為真菌孢子，例如米曲霉孢子、黑曲霉孢子、靈芝孢子等。所述預(yù)處理步驟為:可以用轉(zhuǎn)速≥1000Orpm的離心機(jī)中離心10min收集孢子或者是使用過(guò)濾的方式收集孢子，加入50 μ L-100 μ L的裂解液,并用研磨器研磨3_5min。
[0040]與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0041]本方法主要是采用機(jī)械研磨破碎細(xì)胞并結(jié)合SDS裂解細(xì)胞，不需要用到各種裂解酶，例如溶菌酶、蛋白酶K，后續(xù)的基因組柱純化試劑成分簡(jiǎn)單，操作流程少；該試劑盒適用范圍廣，不僅適用于微生物基因組的提取而且還適用于動(dòng)物組織和植物組織的基因組的提取，同時(shí)能夠快速得到純度高和質(zhì)量高的基因組DNA，整個(gè)過(guò)程控制在30分鐘以?xún)?nèi)，得到的DNA片段約為23Kb，基因組的量可穩(wěn)定保持在I μ g-30 μ g范圍內(nèi)，不會(huì)用到有毒的試劑苯酹、氯仿，能很好的滿(mǎn)足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，可用于Southern,PCR,RFLP,DNA酶切,DNA文庫(kù)構(gòu)建等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。并且，本方法操作簡(jiǎn)單、花費(fèi)低廉，更重要的是清潔無(wú)毒，對(duì)使用者和環(huán)境均無(wú)害。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1為使用該試劑盒提取米曲霉RIB40基因組的電泳圖。
[0043]圖2為使用該試劑盒提取產(chǎn)孢黑曲霉CBS513.88基因組的電泳圖。
[0044]圖3為使用該試劑盒提取無(wú)孢黑曲霉SH-2基因組的電泳圖。
[0045]圖4為使用該試劑盒提取米曲霉RIB40分生孢子基因組的電泳圖。
[0046]圖5為使用該試劑盒提取食用真菌黑木耳基因組的電泳圖。
[0047]圖6為使用該試劑盒提取食用真菌香燕基因組的電泳圖。
[0048]圖7為使用該試劑盒提取食用真菌平菇基因組的電泳圖。
[0049]圖8為使用該試劑盒提取食用真菌茶樹(shù)菇基因組的電泳圖。
[0050]圖9為使用該試劑盒提取酵母GM2.8基因組的電泳圖。
[0051]圖10為使用該試劑盒提取枯草芽孢桿菌WB800基因組的電泳圖。
[0052]圖11為使用該試劑盒提取大腸桿菌JMllO基因組的電泳圖。
[0053]圖12為使用該試劑盒提取培養(yǎng)細(xì)胞基因組的電泳圖。[0054]圖13為使用該試劑盒提取植物組織樹(shù)葉基因組的電泳圖。
[0055]圖14為使用該試劑盒提取動(dòng)物組織豬肉基因組的電泳圖。
[0056]圖15為使用該試劑盒提取動(dòng)物組織魚(yú)內(nèi)臟組織基因組的電泳圖。
[0057]附圖中的數(shù)字M代表使用的Maker是使用的寶生物工程(大連)有限公司的λ -Hind III digest Maker,條帶大小自上而下分別為 23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、2322bp、2027bp、564bp、125bp。數(shù)字 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 分別代表對(duì)應(yīng)圖中不同樣品的基因組。
【具體實(shí)施方式】
[0058] 以下用【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體闡述，下列所有實(shí)施例中所述的操作步驟皆為在1.5mL的錐底離心管中操作。以下實(shí)例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不應(yīng)當(dāng)做對(duì)本發(fā)明的限制。該實(shí)例中所用的材料米曲霉RIB40、黑曲霉CBS513.88、黑曲霉SH-2、大腸桿菌JM110、枯草芽孢桿菌WB800、產(chǎn)朊假絲酵母菌GM2.8都為本實(shí)驗(yàn)室保存，也可以采用市售產(chǎn)品；人培養(yǎng)細(xì)胞為華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院丁孝茹博士惠贈(zèng)；黑木耳、香菇、平菇、茶樹(shù)菇、豬肉、魚(yú)內(nèi)臟組織均購(gòu)于廣州市大學(xué)城穗石村菜市場(chǎng)；樹(shù)葉組織采摘于華南理工大學(xué)。
[0059]實(shí)施例1
[0060]米曲霉菌絲基因組的提取方法
[0061]1、以下配方制作米曲霉菌絲基因組提取試劑盒:
[0062]研磨器:轉(zhuǎn)速8000rpm、配有長(zhǎng)度為70mm,直徑5mm的錐形研磨件；
[0063]溶液A:50mM Tris_HCl、50mM EDTA、3%SDS、2M NaCl,1% 的巰基乙醇，pH8.0 ；
[0064]溶液B:4M的鹽酸胍、20%異丙醇、IOmM EDTA, pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液；
[0065]溶液C:70%的無(wú)水乙醇、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液；
[0066]溶液D:20 μ g/mL的RNA酶水溶液，用IM NaOH溶液將pH調(diào)到8.0。
[0067]DNA純化柱:硅膠柱。
[0068]其中，研磨器購(gòu)自天根生化科技有限公司。
[0069]2、按照以下步驟完成米曲霉基因組的提取:
[0070]a、樣品的預(yù)處理
[0071](I)取1.5mL的錐底離心管，加入IOmg的米曲霉RIB40菌體；
[0072](2)向(I)的離心管中加入100 μ L的溶液A ;
[0073](3)用研磨器研磨菌體2min ；
[0074]b、樣品過(guò)柱純化
[0075](4)向研磨好的菌絲中加入溶液A使終體積在150 μ L左右；
[0076](5)在漩渦振蕩器震蕩30s，使菌體盡量分散；
[0077](6)離心機(jī)轉(zhuǎn)速12000g，離心5min ；
[0078](7)小心取上清100 μ L至一新的1.5mL離心管中，加入300 μ L的溶液B，上下顛倒混勻；
[0079](8)將(7)的混合液加入純化柱中，12000g，離心Imin ；[0080](9)倒掉收集管中的液體，向純化柱中加入500 μ L的溶液B，12000g，離心Imin ；
[0081](10)倒掉收集管中的液體，向純化柱中加入700 μ L的溶液C，12000g，離心Imin ；
[0082](11)重復(fù)(10);
[0083](12)倒掉收集管中的液體，12000g，離心3min ；
[0084](13)將(12)的純化柱加入一新的1.5mL離心管中，加入30μL的溶液0，37°〇放置 5min ；
[0085](14) 12000g,離心 2min ；
[0086](15) _20°C保存提取的基因組DNA溶液。
[0087]C、使用該方法提取的基因組可以從IOmg菌體中提取約1.5 μ g，提取的基因組如圖1所示。
[0088]實(shí)施例2
[0089]產(chǎn)孢黑曲霉CBS513.88菌絲基因組的提取
[0090]基因組提取方法同實(shí)施例1中的步驟，使用該方法提取的基因組可以從IOmg菌體中提取約1.5 μ g，提取的基因組如圖2所示。
[0091]實(shí)施例3
[0092]無(wú)孢黑曲霉SH-2菌絲基因組的提取
[0093]基因組提取過(guò)程中步驟方法同實(shí)施例1中的步驟，使用該方法提取的基因組可以從IOmg菌體中提取約2 μ g,提取的基因組如圖3所不。
[0094]實(shí)施例4
[0095]米曲霉分生孢子基因組的提取
[0096]基因組提取方法同實(shí)施例1，只是將實(shí)施例1中步驟(3)改為用研磨器研磨孢子5min，使用該方法提取的基因組可以從IXlO8量的孢子中提取約1.5 μ g，提取的基因組如圖4所示。
[0097]實(shí)施例5
[0098]食用真菌黑木耳基因組的提取
[0099]基因組提取方法同實(shí)施例1，只是將實(shí)施例1中步驟(3)改為用研磨器研磨菌體5min，使用該方法提取的基因組可以IOmg的黑木耳中提取約2 μ g，提取的基因組如圖5所
/Jn ο
[0100]實(shí)施例6
[0101]食用真菌香菇基因組的提取
[0102]基因組提取方法同實(shí)施例1，只是將實(shí)施例1中步驟(3)改為用研磨器研磨菌體5min,使用該方法提取的基因組可以IOmg的香菇中提取約2 μ g，提取的基因組如圖6所示。
[0103]實(shí)施例7
[0104]食用真菌平菇基因組的提取
[0105]基因組提取方法同實(shí)施例1，只是將實(shí)施例1中步驟(3)改為用研磨器研磨菌體5min，使用該方法提取的基因組可以IOmg的平菇中提取約2 μ g，提取的基因組如圖7所示。
[0106]實(shí)施例8
[0107]食用真菌茶樹(shù)菇基因組的提取
[0108]基因組提取方法同實(shí)施例1，只是將實(shí)施例1中步驟(3)改為用研磨器研磨菌體5min，使用該方法提取的基因組可以IOmg的茶樹(shù)菇中提取約2 μ g，提取的基因組如圖8所示。[0109]實(shí)施例9
[0110]產(chǎn)朊假絲酵母菌GM2.8基因組的提取
[0111]基因組提取同實(shí)施例1所述的方法，使用該方法提取的基因組可以從I X IO9量的酵母細(xì)胞中提取約3 μ g，提取的基因組如圖9所示。
[0112]實(shí)施例10
[0113]革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌枯草芽孢桿菌WB800基因組的提取
[0114]基因組提取同實(shí)施例1所述的方法，使用該方法提取的基因組可以從I X IO9量的枯草細(xì)胞中提取約5yg，提取的基因組如圖10所示。
[0115]實(shí)施例11
[0116]革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌桿菌JMllO基因組的提取
[0117]基因組提取同實(shí)施例1所述的方法，使用該方法提取的基因組可以從I X IO9量的大腸細(xì)胞中提取約5 μ g，提取的基因組如圖11所示。
[0118]實(shí)施例12
[0119]人培養(yǎng)細(xì)胞基因組的提取
[0120]基因組提取同實(shí)施例1所述的方法，使用該方法提取的基因組可以從I X IO9量的人細(xì)胞中提取約6 μ g，提取的基因組如圖12所示。
[0121]實(shí)施例13
[0122]植物組織植物葉片基因組的提取
[0123]基因組提取方法同實(shí)施例1，只是將實(shí)施例1中步驟(3)改為用研磨器研磨植物葉片5min，使用該方法提取的基因組可以IOmg的植物葉片中提取約2 μ g，提取的基因組如圖13所示。
[0124]實(shí)施例14
[0125]動(dòng)物組織豬肉基因組的提取
[0126]基因組提取方法同實(shí)施例1，只是將實(shí)施例1中步驟(3)改為用研磨器研磨豬肉5min，使用該方法提取的基因組可以IOmg的豬肉中提取約1.5 μ g，提取的基因組如圖14所
/Jn ο
[0127]實(shí)施例15
[0128]動(dòng)物組織魚(yú)內(nèi)臟組織基因組的提取
[0129]基因組提取方法同實(shí)施例1，只是將實(shí)施例1中步驟(3)改為用研磨器研磨魚(yú)內(nèi)臟5min，使用該方法提取的基因組可以IOmg的魚(yú)內(nèi)臟中提取約2yg，提取的基因組如圖15所
/Jn ο
【權(quán)利要求】
1.一種基因組DNA提取試劑盒，其特征在于，包括溶液A、溶液B、溶液C、溶液D和純化柱； 溶液 A:10mM-50mM Tris-HCl,10mM-50mM EDTA,1%-10%w/v SDS，2M_4M NaCl,0.5%-2%v/v β -巰基乙醇，ρΗ7.5-8.5 ； 溶液B:2.5-6M的鹽酸胍或異硫氰酸胍，20%-50%v/v異丙醇或是無(wú)水乙醇，5mM-20mMEDTA, ρΗ4.5-6.5 ； 溶液 C:70%-80%v/v 的無(wú)水乙醇，ρΗ4.5-6.5 ； 溶液D:5-50 μ g/mL的RNA酶水溶液，用IM NaOH溶液調(diào)pH至7.0-8.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括研磨器，該研磨器可以為電動(dòng)組織研磨器或者小型的手提電鉆其轉(zhuǎn)速800-12000rpm，配有長(zhǎng)度為40_80mm，直徑3_7mm的錐形研磨杵。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述研磨器的轉(zhuǎn)速1500-8000rpm、并配有長(zhǎng)度70mm,直徑5mm的錐形研磨件。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的試劑盒，其特征在于， 溶液 A:50mM Tris-HCl、50mM EDTA、3%SDS、2M NaCl,1% 的 β -巰基乙醇，ρΗ8.0 ； 溶液B:4Μ的鹽酸胍、20%異丙醇、IOmM EDTA, ρΗ5.0的0.2Μ的乙酸-乙酸鈉緩沖液； 溶液C:70%的無(wú)水乙醇、ρΗ5.0的0.2Μ的乙酸-乙酸鈉緩沖液； 溶液D:20 μ g/mL的RNA酶水溶液，用lmol/L NaOH溶液將pH調(diào)到8.0。
5.一種基因組DNA提取方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1~4任意一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行提取，具體包含以下步驟: (1)取L5mL的錐底離心管，加入0.1mg-1OOmg組織樣本或者IO6-1O9細(xì)胞樣本與50 μ L-100 μ L的溶液A混合；開(kāi)動(dòng)研磨器研磨樣本30s-5min，向研磨好的樣本中加入溶液A使樣品終體積為150 μ L ; (2)漩渦振蕩器震蕩30s，使菌體盡量分散；離心轉(zhuǎn)速10000g-12000g，時(shí)間5min；取上清100 μ L至一離心管中，加入300 μ L-600 μ L的溶液B，上下顛倒混勻；再將混合液加入純化柱中，10000g-12000g，離心30s-lmin ;棄收集管中的液體，向純化柱中加入300 μ L-600 μ L 的溶液 B, 10000g_12000g，離心 30s_lmin ； (3)棄收集管中的液體，向純化柱中加入500yL-700yL的溶液C，10000g-12000g，離心30s-lmin ;棄收集管中的液體，向純化柱中加入500 μ L-700 μ L的溶液C，10000g-12000g，離心 30s-lmin ;棄收集管中的液體，10000g_12000g，離心 2_5min ； (4)將純化柱轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入30-50μ L的溶液D，37 V放置5min ；10000g-12000g，離心l-2min ;即得到提取的基因組DNA溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞樣本為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母菌、血液或骨髓；所述細(xì)胞樣品還經(jīng)如下預(yù)處理:將細(xì)胞樣品在轉(zhuǎn)速> 5000rpm的離心機(jī)中離心5min收集細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述組織樣本為動(dòng)植物組織或者大型真菌組織；該組織樣本還經(jīng)剪碎或者磨碎的預(yù)處理。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述組織樣本為絲狀真菌，對(duì)于生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上的菌絲用牙簽或者移液器槍頭挑??；對(duì)于生長(zhǎng)在液體培養(yǎng)基中菌絲用轉(zhuǎn)速≥ 1000Orpm的離心機(jī)中離心10min或者是過(guò)濾收集菌絲。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述組織樣本為真菌孢子懸液，用轉(zhuǎn)速≥ 1000Orpm的離心機(jī)中離心10mi n收集孢子或者是使用過(guò)濾的方式收集孢子。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103911366SQ201410103466
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】潘力, 周斌, 王斌, 何攀, 呂揚(yáng)勇, 廖瑜玲, 李秀鵬 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)