偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒株及其構建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒株及其構建方法和應用。本發(fā)明提供了一株缺失gI和gE基因的偽狂犬病病毒株，其微生物保藏編號是CGMCC.No.8786。本發(fā)明進一步提供了構建所述雙基因缺失毒株的方法，包括：（1）構建含有EGFP和Neo基因完整表達盒的偽狂犬病病毒TJ株轉移載體；（2）將轉移載體轉染于接種偽狂犬病病毒TJ株后的細胞，獲得過渡病毒；（3）過渡病毒基因組酶切處理后與轉移載體共轉染細胞，經(jīng)蝕斑篩選即得。本發(fā)明缺失毒株被完全致弱，免疫豬只后未出現(xiàn)任何臨床反應，能夠迅速誘導偽狂犬病病毒特異性抗體的產(chǎn)生，中和抗體滴度高，對當前流行的偽狂犬病病毒變異株的攻擊能提供完全的免疫保護。
【專利說明】偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒株及其構建方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及偽狂犬病病毒變異株，尤其涉及一株偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失 毒株及其構建方法，本發(fā)明還涉及偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒株在制備防治由偽狂 犬病病毒變異株引起的動物傳染病藥物中的應用，屬于偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒 株的構建及應用領域。

【背景技術】
[0002] 偽狂犬?。╬seudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV)引 起的豬、羊、牛等多種家畜及野生動物的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、腦脊髓炎、呼吸和神 經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要特征的急性傳染病。PRV是皰疫病毒科α皰疫病毒亞科水痘病毒屬的 成員，基因組為線性雙鏈DNA，長約145kb，G+C含量高達73%。整個基因組由獨特長區(qū)UL、 獨特短區(qū)US及位于US兩側的末端重復序列TRS和內(nèi)部重復序列IRS構成，共編碼約70? 100種病毒蛋白，其中有近一半基因被認為是病毒復制非必需的（Pomeranz LE, Reynolds AE, Hengartner CJ. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 2005, 69(3):462-500·)。PRV 含有 11種糖蛋白，即：gB、gC、gD、gE、gG、gH、gl、gK、gL、gM和gN，其中gE糖蛋白是PRV的主 要毒力因子，屬于典型的I型跨膜蛋白，在介導細胞的感染融合、病毒在細胞間的擴散、 病毒粒子的釋放及病毒的嗜神經(jīng)性等方面發(fā)揮著重要作用（Mengeling WL, Brockmeier SL, Lager KM, Vorwald AC. The role of biotechnologically engineered vaccines and diagnostics in pseudorabies(Aujeszky's disease)eradication strategies.Vet Microbiol. 1997,55 (1-4):49-60 ；Nauwynck HJ, Labarque GG, Pensaert MB. Efficacy of an intranasal immunization with gEgC and gEgl double-deletion mutants of Aujeszky' s disease virus in maternally immune pigs and the effects of a successive intramuscular booster with commercial vaccines. Zentralbl Veterinarmed B. 1999, 46(10) :713-22.)。
[0003] 偽狂犬病目前尚無特效治療藥物，主要以預防為主，其中，疫苗免疫接種是防 治偽狂犬病的重要措施。然而，自2011年以來，中國大部分免疫過偽狂犬病弱毒疫 苗Bartha-K61的豬場出現(xiàn)了典型的偽狂犬病癥狀（Wu R，Bai C，Sun J，Chang S，Zhang X.Emergence of virulent pseudorabies virus infection in northern China. J Vet Sci. 2013, 14(3) :363-365.)，感染豬表現(xiàn)為高熱（40?42°C )，精神沉郁、食欲下降、咳嗽、 氣喘及神經(jīng)癥狀，且新生豬死亡率高達50 %以上（彭金美，安同慶，趙鴻遠，趙鴻遠，劉益 民，陳家锃，冷超糧，孫艷，常丹，田志軍，童光志.豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及 抗原差異性分析.中國預防獸醫(yī)學報，2013, 35 (1) : 1-4.)，感染豬出現(xiàn)了以往PR病例未見 的瘙癢癥狀。初步研究結果表明，與以前的毒株相比，新的流行毒株的抗原性已發(fā)生變異， PRV變異株致病性明顯增強，傳統(tǒng)疫苗Bartha-K61株對目前流行的PRV變異株不能提供完 全的免疫保護。因此，研制針對PRV變異株的疫苗，對于偽狂犬病的有效預防具有重要的意 義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一是提供一株偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒株；
[0005] 本發(fā)明的目的之二是提供一種構建偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒株的方 法；
[0006] 本發(fā)明的目的之三是提供構建的偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒株在制備防 治由偽狂犬病病毒（尤其是PRV變異株）引起的動物傳染病藥物中的應用。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一株偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒 株。
[0008] 本發(fā)明以PRV變異毒株PRVTJ株為親本毒，利用改進的方法構建了 gl/gE雙基因 缺失并且不含任何外源基因的偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒株rPRVTJ-delgE。
[0009] 本發(fā)明所用的親本毒PRV TJ株是2012年從中國天津某豬場的病豬腦組織中分離 到的。該毒株與目前流行的PRV變異株具有極高的同源性，而與以往的PRV毒株具有明顯 差異，尤其是該毒株與PRV經(jīng)典強毒株有明顯差異，其主要毒力蛋白gE基因蛋白中有18處 氨基酸發(fā)生了突變，并且在第48位和第494位氨基酸處插入了天冬氨酸。動物實驗表明， PRV TJ株對綿羊和仔豬表現(xiàn)為高度致死性，接種后4?5d大部分死亡；仔豬感染PRV TJ株 后，出現(xiàn)明顯的瘙癢癥狀，這在以往的PRV感染病例中是罕見的。
[0010] 本發(fā)明構建的缺失病毒rPRVTJ-delgE缺失了 PRV TJ株的gE基因和gl基因（缺 失位點為PRV TJ株基因組的第122804-125101位序列，共缺失2298bp)。gE是一個重要的 毒力基因，gl也與毒力有關。gE蛋白和gl蛋白以非共價鍵形式結合成復合體gE/gl，它們 與PRV在神經(jīng)系統(tǒng)中的侵襲和擴散作用密切相關。gE和gl基因的共同缺失，將使病毒致弱 更加充分，作為疫苗株更加安全可靠。有研究指出，gl/gE復合物具有結合IgG的能力，從而 阻止補體途徑，導致機體免疫抑制。單獨缺失gl或gE基因所獲得的缺失病毒，無論是滅活 還是直接接種動物，所誘導的抗體滴度均不高，不能夠對PRV強毒的攻擊提供完全保護（呂 素芳，郭廣君，管宇，魏風，張松林，沈志強.偽狂犬病毒SA株gI-/gE-/YFP+基因缺失載體 構建及突變株篩選.中國動物檢疫.2009, 26(8) :38-40.董炳梅，郭廣君，呂素芳，唐娜，魏 鳳，管宇，張松林，沈志強.豬偽狂犬病病毒雙基因缺失gI-/gE-/PRV SA738滅活疫苗的安 全性與免疫效力.中國獸醫(yī)學報.2011，31 (7) :950-954.)。另外，本發(fā)明所構建的缺失病毒 rPRVTJ-delgE不含有任何外源基因，接種動物后不會誘導針對其它外源蛋白的抗體產(chǎn)生， 有效提高了缺失病毒的生物安全性和穩(wěn)定性。
[0011] PCR檢測及間接免疫熒光試驗表明，本發(fā)明所構建的缺失病毒株rPRVTJ-delgE已 正確缺失gl和gE基因。一步生長曲線結果顯示，缺失病毒株rPRVTJ-delgE具有與親本毒 PRV TJ株相類似的生長動力學，只是在感染細胞10h后增殖速度較親本毒PRV TJ株緩慢， 毒價上略低于親本毒。在缺失病毒株rPRVTJ-delgE與親本毒PRV TJ株接種細胞后所產(chǎn)生 的蝕斑形態(tài)和大小上未見有明顯差異。
[0012] 本發(fā)明用不同滴度的缺失病毒株rPRVTJ-delgE免疫豬只后，免疫豬沒有出現(xiàn)任 何臨床反應和排毒現(xiàn)象，說明缺失病毒株被完全致弱。該缺失病毒株免疫豬只后1周就能 夠產(chǎn)生較高的gB特異性抗體，至攻毒后3天，rPRVTJ-delgE株不同劑量免疫組均產(chǎn)生了中 和抗體，平均抗體滴度分別為105TCID5Q免疫組1:7. 75、104TCID5Q免疫組1:6. 25、103TCID5Q 免疫組1:5. 25,均高于Bartha-K61疫苗免疫組5. 00,表明本發(fā)明所構建的缺失病毒株保持 良好免疫原性；攻毒后，rPRVTJ-delgE免疫豬得到完全保護。
[0013] 本發(fā)明將構建的偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒株rPRVTJ-delgE提交專利認 可的機構進行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No. 8786 ;分類命名為：偽狂犬病病毒變異 株雙基因缺失毒株。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時 間是2014年2月17日：保藏地址：中國北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生 物研究所。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種構建偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒株的方法，包括以下 步驟：
[0015] (1)構建轉移載體；所述的轉移載體含有PRV TJ株病毒DNA的左右同源重組臂L 和R，還含有EGFP、Neo基因的完整表達盒； _6] (2)構建具有指示標記的過渡病毒；將構建的轉移載體轉染于接種PRV TJ株后的 Vero細胞，經(jīng)蝕斑篩選與純化獲得過渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo ;
[0017] (3)將具有指示標記的過渡病毒基因組酶切處理后與轉移載體pOK-LR共轉染 Vero細胞，經(jīng)蝕斑篩選獲得了缺失gl和gE基因的重組病毒rPRVTJ-delgE。
[0018] 本發(fā)明根據(jù)PRV Kaplan株（GenBank登錄號JQ809328. 1)US區(qū)基因序列，參照PRV Bartha-K61株的缺失部位設計兩對引物，其中引物對1的核苷酸序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，引物對2的核苷酸序列為SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示；本發(fā)明以PRV TJ 株病毒DNA為模板，以引物對1和2為擴增引物，分別擴增左右同源重組臂L和R，將擴增得 到的左右同源重組臂L和R克隆于p0K12載體上，獲得轉移載體pOK-LR ;再以pEGFP-Nl質(zhì) 粒為模板，用引物擴增含有EGFP、Neo基因的完整表達盒；將含有EGFP、Neo基因的完整表 達盒克隆于pOK-LR的L和R片段之間獲得轉移載體pOKLR-EGFP-Neo。
[0019] 將轉移載體pOKLR-EGFP-Neo質(zhì)粒轉染于接種PRV TJ株后的Vero細胞，經(jīng)蝕斑 篩選與純化獲得過渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo。本發(fā)明所構建的過渡病毒中引入了 Pmel和PacI兩個獨特的單一酶切位點，用這兩個酶處理過渡病毒基因組后，再與轉移載 體共轉染細胞，獲得缺失病毒。本發(fā)明構建的過渡病毒中含有EGFP基因作為指示標記基 因，在過渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo中還引入了新霉素抗性基因 Neo,結合EGFP可視 化篩選與新霉素抗性篩選，大大提高了過渡病毒的純化效率。在缺失病毒的構建過程中， 在過渡病毒rPRVTJ-de 1 gE-EGFP-Neo中引入兩個獨特的單一酶切位點Pme I和Pac I。將 rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因組用Pmel和PacI雙酶切后再與轉移載體pOK-LR共轉染細 胞，轉染后有病變但沒有熒光的細胞所占的比例約為80% (目的病毒引起的病變細胞），故 從其中篩選不表達綠色熒光的重組缺失病毒蝕斑較為容易，顯著提高了缺失病毒的篩選 與純化效率。而未經(jīng)Pmel和PacI雙酶切處理的rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因組DNA與轉 移載體pOK-LR共轉染細胞后，視野中絕大部分細胞均發(fā)綠色熒光，比例約為90 %以上，目 的病毒引起病變的細胞不到10%，使得從其中篩選重組病毒蝕斑的難度很大。提取過渡病 毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因組DNA并用Pmel和PacI限制性內(nèi)切酶進行酶切，將轉移 載體pOK-LR質(zhì)粒與酶切處理后的rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因組DNA共轉染細胞，經(jīng)蝕斑 篩選與純化獲得缺失了 gl和gE基因的缺失病毒株rPRVTJ-delgE。
[0020] 本發(fā)明還進一步提供了構建的偽狂犬病病毒變異株雙基因缺失毒株在制備防治 由PRV變異株引起的動物傳染病藥物中的應用。
[0021] 本發(fā)明構建的PRV變異株雙基因缺失毒株對豬只安全，免疫后能夠迅速產(chǎn)生PRV 特異性抗體，能夠對當前流行的PRV變異株的攻擊提供完全的免疫保護。該缺失病毒可以 用于制備防治由PRV變異株引起的動物傳染性疾病藥物，尤其用于制備防治由偽狂犬病病 毒變異株引起的偽狂犬病疫苗，有效預防偽狂犬病。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為缺失病毒株構建策略圖。
[0023] 圖2為過渡病毒、缺失病毒株和親本病毒株接種PK-15細胞后熒光及病變觀察； A1 :rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo 接種細胞后熒光觀察；A2 :rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo 接種細胞 后病變觀察；B1 :rPRVTJ-delgE接種細胞后熒光觀察；B2 :rPRVTJ-delgE接種細胞后病變 觀察；Cl :PRV TJ接種細胞后熒光觀察；C2 :PRV TJ株接種細胞后病變觀察。
[0024] 圖3為過渡病毒、缺失病毒株和親本病毒株中gE和gB基因的PCR擴增；A :gE基 因的PCR擴增；B :gB基因的PCR擴增。
[0025] 圖4為過渡病毒、缺失病毒株和親本病毒株接種細胞后gB和gE蛋白表達的檢測。
[0026] 圖5為過渡病毒、缺失病毒株和未本病毒株的一步生長曲線。
[0027] 圖6為本發(fā)明構建的雙基因缺失毒株免疫豬gB特異性抗體的檢測結果。
[0028] 圖7為本發(fā)明構建的雙基因缺失毒株免疫豬gE特異性抗體的檢測結果。

【具體實施方式】
[0029] 下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0030] 1、實驗材料
[0031] PRV變異株T J株由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所分離、鑒定、保存；PRV Bartha-K61株購自哈爾濱維科生物技術有限公司（生產(chǎn)批號2013001)。Vero細胞和PK-15 細胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室保存。P0K12載體（N 〇vagene，USA) 和pEGFP-Nl載體（Clontech，USA)用于轉移載體的構建。
[0032] 實施例1缺失病毒的構建
[0033] 1、實驗方法
[0034] 1. 1轉移載體的構建
[0035]根據(jù) PRV Kaplan 株（GenBank 登錄號 JQ809328. 1)US 區(qū)基因序列、參照 PRV Bartha-K61株的缺失部位設計兩對引物P1S/P1R和P2S/P2R (表1)。然后以PRV變異株TJ 株病毒 DNA 為模板，應用引物 P1S/P1R(SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2)和 P2S/P2R(SEQ ID No. 3 和SEQ ID No. 4)分別擴增左右同源重組臂（L和R)，然后將L、R通過EcoRI和Xbal酶切位 點克隆于P〇K12載體上，獲得轉移載體pOK-LR。再以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，應用引物P3S/ P3R(SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6)(表1)擴增含有EGFP、Neo基因的完整表達盒。然后將此 片段通過Mlul酶切位點克隆于pOK-LR的L和R片段之間獲得轉移載體pOKLR-EGFP-Neo， 具體構建策略見圖1。
[0036] 表1引物序列及擴增片段
[0037]

【權利要求】
1. 一株偽狂犬病病毒（pseudorabies virus) TJ株雙基因缺失毒株，其特征在于：缺失 了偽狂犬病病毒TJ株的gl和gE基因，所缺失的序列位于偽狂犬病病毒TJ株基因組的第 122804-125101位核苷酸，片段大小為2298bp。
2. 按照權利要求1所述的偽狂犬病病毒TJ株雙基因缺失毒株，其特征在于：其微生物 保藏編號為CGMCC. No. 8786 ;
3. -種構建權利要求1或2所述偽狂犬病病毒TJ株雙基因缺失毒株的方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 構建含有偽狂犬病病毒TJ株病毒DNA的左右同源重組臂L和R、EGFP以及Neo基 因完整表達盒的轉移載體； (2) 將構建的轉移載體轉染于接種偽狂犬病病毒TJ株后的Vero細胞，經(jīng)蝕斑篩選與純 化獲得過渡病毒； (3) 將過渡病毒基因組酶切處理后與只含有左右同源重組臂L和R的轉移載體共轉染 細胞，經(jīng)蝕斑純化，即得。
4. 按照權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的轉移載體的構建方法包括：以偽狂 犬病病毒TJ株病毒DNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物對1和SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物2為擴增引物，分別擴增左右同源重組臂L和R，將擴增得到 的左右同源重組臂L和R克隆于pOK12載體上，獲得轉移載體pOK-LR ;擴增含有EGFP、Neo 基因的完整表達盒；將含有EGFP、Neo基因的完整表達盒克隆于pOK-LR的L和R片段之間 獲得轉移載體P〇KLR-EGFP-Neo。
5. 按照權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（3)中所述的細胞是Vero細胞。
6. 按照權利要求3所述的方法，其特征在于：將過渡病毒基因組用Pmel和PacI進行 酶切處理后與轉移載體pOK-LR共轉染細胞。
7. 權利要求1或2所述的偽狂犬病病毒TJ株雙基因缺失毒株在制備防治由偽狂犬病 病毒所引起的動物傳染病藥物中的應用。
8. 按照權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的偽狂犬病病毒是偽狂犬病病毒變 異株或偽狂犬病病毒經(jīng)典強毒株。
9. 按照權利要求7所述的應用，其特征在于：所述的動物傳染病是動物偽狂犬病。
10. -種預防或治療動物偽狂犬病的疫苗組合物，其特征在于：包括預防或治療上有 效量的權利要求1或2所述的偽狂犬病病毒TJ株雙基因缺失毒株以及藥學上可接受的載 體或輔料。
【文檔編號】C12N7/04GK104059889SQ201410105058
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權日:2014年3月20日
【發(fā)明者】仇華吉, 孫元, 羅玉子, 李素, 李永鋒 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所