豬細(xì)環(huán)病毒ii型檢測(cè)的引物、探針及實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開(kāi)了一種用于豬細(xì)環(huán)病毒II型檢測(cè)的引物、探針及其實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本申請(qǐng)為豬細(xì)環(huán)病毒II型的檢測(cè)提供了一種全新的檢測(cè)引物,具有很強(qiáng)的特異性和靈敏度,能夠滿足豬細(xì)環(huán)病毒II型的日常檢驗(yàn)檢疫需求;為豬細(xì)環(huán)病毒II型的檢疫、流行病學(xué)調(diào)查,以及為生產(chǎn)中指導(dǎo)豬細(xì)環(huán)病毒II型的檢測(cè)提供了技術(shù)幫助。
【專利說(shuō)明】豬細(xì)環(huán)病毒I I型檢測(cè)的引物、探針及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)涉及分子檢測(cè)領(lǐng)域,特別是涉及一種用于豬細(xì)環(huán)病毒II型檢測(cè)的引物、探針及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]TTV是一種無(wú)包被的單股環(huán)狀負(fù)義的DNA病毒,由于最初是在肝炎患者中分離得到,猜測(cè)與肝炎有關(guān),受到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。豬源TTV的中文名字被定義為豬細(xì)環(huán)病毒(Torque Teno Sus Virus, TTSuV)0流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),TTV通過(guò)輸血、性行為、糞-口途徑等方式進(jìn)行傳播,同時(shí)血液、唾液、糞便、乳汁、膽汁均可帶毒,通過(guò)不同人群的TTV的感染率的研究結(jié)果顯示:一般人群的感染率多在10%以....t,呈無(wú)癥狀攜帶。除了人可感染TTV以外,貓、狗、豬、牛、雞、羊、老鼠等動(dòng)物也是TTV的宿主。Okamota H等根據(jù)人TTV非編碼區(qū)的DNA序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增了豬、狗和貓血清中的TTV基因片段,發(fā)現(xiàn)在這幾個(gè)不同種屬中TTV基因序列和長(zhǎng)度差異極大,核酸同源性較小,具有物種專一注。美國(guó)學(xué)者Leary等應(yīng)用巢式PCR方法從豬血清中檢測(cè)到TTV (Sd-TTV31),基因組長(zhǎng)度為2878bp。2005年,Niel C等利用多重引導(dǎo)滾環(huán)式擴(kuò)增法(Multiply primed rolling-circle amplification, RCA)檢測(cè)到豬TTV的另一種亞型:Sd-TTV2p,基因組長(zhǎng)度為2735bp,與之前發(fā)現(xiàn)的Sd-TTV31的同源性非常低,只有45.1%,于是將TTSuV分為兩種基因型,TTSuVl型以Sd_TTV31為原型,TTSuV2型以Sd-TTV2p為原型。目前,統(tǒng)一的將TTSuVl型稱為豬細(xì)環(huán)病毒I型(簡(jiǎn)寫(xiě)TTSuVI), TTSuV2型稱為豬細(xì)環(huán)病毒II型(簡(jiǎn)寫(xiě)TTSuV II)。
[0003]TTSuV和人TTV基因組結(jié)構(gòu)組成相似,由非編區(qū)(UTR)和編碼區(qū)兩部分組成,非編區(qū)由一個(gè)富含GC的區(qū)域、一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子組成,兩末端的GC區(qū)域形成具莖環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu),在病毒復(fù)制中可能有重要調(diào)控作用JTV編碼區(qū)包含3個(gè)開(kāi)放閱讀框(0RR~0RF3)、一個(gè)PolyA和一個(gè)TATA盒,變異率較高。ORFl的N端富含精氨酸(Arg)蛋白質(zhì),該蛋白旗有可能是復(fù)制相關(guān)的蛋白-Rep蛋白;()RF2編碼與復(fù)制相關(guān)的蛋白;0RF3編碼結(jié)合蛋白,分為兩段,其中隔著一個(gè)類似于真核生物編碼區(qū)中內(nèi)含子的序列。編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生3種不同的mRNA,能翻譯表達(dá)6種不同的蛋白。兩種基因型TTV編碼蛋白具有相似的序列和功能。
[0004] 國(guó)外已有許多相關(guān)報(bào)道,表明TTSuV的感染在全球分布很廣且其流行率很高。Segales等對(duì)西班牙豬場(chǎng)1985-2005年采集的162份豬血清進(jìn)行追溯性調(diào)查,結(jié)果在所有年份均檢出TTSuV病毒,TTSuVl和TTSuV2的感染率分別是33.3%(54/162)和55.6%(90/162),兩種基因型共感染率為23.5% (38/162),證實(shí)了 TTSuV的感染早在最初發(fā)現(xiàn)這病毒(Learyet al., 1999)的14年前就存在了。
[0005]近年來(lái),國(guó)內(nèi)也陸續(xù)開(kāi)展了對(duì)TTSuV感染情況的研究。這些研究顯示,TTSuV在豬群中的感染在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)非常普遍,是一個(gè)不容忽視的新病原。而目前對(duì)TTSuV的了解還非常有限,綜合國(guó)內(nèi)外檢測(cè)TTSuV的方法主要有血清免疫學(xué)法和分子生物學(xué)法,血清免疫學(xué)法有酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法,ELISA是用于疫病檢測(cè)和監(jiān)控的常用方法,但由于TTSuV具有高度基因變異性,不同基因亞型抗體間存在交叉反應(yīng),用它對(duì)基因變異進(jìn)行分析時(shí)準(zhǔn)確率較低,不能完全反映體內(nèi)基因變異情況,更重要的是ELISA法的漏檢率較高。除此之外,由于感染時(shí)間較短而尚未產(chǎn)生抗體也可造成ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性。
[0006]目前用于TTSuV檢測(cè)的分子生物學(xué)方法主要有普通PCR、套式PCR、半套式PCR和滾環(huán)擴(kuò)增等方法。常規(guī)PCR和套式PCR方法均根據(jù)目前已知的TTSuV基因序列的最保守的非編碼區(qū)來(lái)設(shè)計(jì)引物,對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)。滾環(huán)擴(kuò)增法是以任意的寡核苷酸作為引物,在恒溫下以滾環(huán)擴(kuò)增待測(cè)環(huán)狀DNA。由于血清中TTSuV病毒滴度較低,用普通PCR —輪難以擴(kuò)增出目的片段,需加大循環(huán)數(shù),但這樣會(huì)使引物非特異性結(jié)合或者聚合酶活性下降。巢氏PCR克服了單次擴(kuò)增“平臺(tái)期效應(yīng)”的限制且保證了反應(yīng)的特異性,但是需要進(jìn)行第二次PCR,引起交叉污染的幾率較大。普通PCR敏感性較差,巢氏PCR、半巢氏PCR和滾環(huán)擴(kuò)增耗時(shí)較長(zhǎng),且這些傳統(tǒng)的PCR技術(shù)只能對(duì)基因的檢測(cè)做定性分析,無(wú)法精確的定量所檢測(cè)出的基因數(shù)量,大大制約了 PCR技術(shù)的應(yīng)用。
[0007]Taqman熒光定量PCR是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)核酸檢測(cè)技術(shù),可以快速、敏感地檢測(cè)出核酸中的目的基因。采用引物和探針相結(jié)合,對(duì)基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,其特異性更強(qiáng),檢測(cè)更準(zhǔn)確。利用熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)關(guān)系來(lái)對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行定性及定量分析,敏感性極高,可以檢測(cè)到幾個(gè)拷貝/μ L的病毒核酸。在檢測(cè)過(guò)程中熒光定量PCR方法無(wú)需進(jìn)行凝膠電泳,用儀器收集熒光進(jìn)行判斷結(jié)果,避免了人為主觀因素的影響。而且與常規(guī)PCR技術(shù)相比,其檢測(cè)速度更具有優(yōu)勢(shì),可以在4-6h內(nèi)完成。而目前針對(duì)用于檢測(cè)TTSuV的高通量、快速、靈敏的Taqman突光定量PCR檢測(cè)方法的研究較少;遠(yuǎn)不能滿足檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐應(yīng)用的需求。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本申請(qǐng)的目的是提供一種全新的用于豬細(xì)環(huán)病毒II型檢測(cè)的引物、探針以及基于該引物和探針的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)以上目的,本申請(qǐng)的一方面公開(kāi)了一種用于豬細(xì)環(huán)病毒II型檢測(cè)的引物,該引物包括上游引物和下游引物,其中,上游引物含有Seq ID N0.4所示序列,下游引物含有Seq ID N0.5所示序列;
[0010]Seq ID N0.4:5,-TATCGGGCAGGCGGTAATC-3’
[0011]Seq ID N0.5:5,-TACGCTACCGTCAGCCATCTTT-3’。
[0012]本申請(qǐng)的另一面公開(kāi)了一種用于豬細(xì)環(huán)病毒II型檢測(cè)的探針,該探針含有Seq IDN0.6所示序列;
[0013]Seq ID N0.6:5,-AACCGGGCCCCCCTCGATG-3,。
[0014]優(yōu)選的,探針的5 ’端標(biāo)記有焚光報(bào)告基團(tuán),3 ’端標(biāo)記有焚光淬滅基團(tuán)。
[0015]更優(yōu)選的,探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為ffiX,熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。
[0016]本申請(qǐng)的另一面公開(kāi)了一種豬細(xì)環(huán)病毒II型的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,包括采用本申請(qǐng)的引物和探針進(jìn)行Taqman熒光定量PCR檢測(cè)。
[0017]本申請(qǐng)的再一面公開(kāi)了一種豬細(xì)環(huán)病毒II型的檢測(cè)試劑盒,該檢測(cè)試劑盒中含有本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)的引物。[0018]進(jìn)-一步的,本申請(qǐng)的檢測(cè)試劑盒中還含有本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)的探針。
[0019]本申請(qǐng)的再一面公開(kāi)了本申請(qǐng)的檢測(cè)試劑盒在豬細(xì)環(huán)病毒II型檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0020]本申請(qǐng)的再一面公開(kāi)了一種采用本申請(qǐng)的檢測(cè)試劑盒對(duì)豬細(xì)環(huán)病毒II型進(jìn)行的檢測(cè),該檢測(cè)包括但不限于,常規(guī)PCR、染料法實(shí)時(shí)熒光PCR、探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光PCR中的至少
-一種O
[0021]由于采用以上技術(shù)方案,本申請(qǐng)的有益效果在于:
[0022]本申請(qǐng)為豬細(xì)環(huán)病毒II型的檢測(cè)提供了一種全新的檢測(cè)引物,具有很強(qiáng)的特異性和靈敏度,能夠滿足豬細(xì)環(huán)病毒II型的日常檢驗(yàn)檢疫需求;為豬細(xì)環(huán)病毒II型的檢疫、流行病學(xué)調(diào)查,以及為生產(chǎn)中指導(dǎo)豬細(xì)環(huán)病毒II型的檢測(cè)提供了技術(shù)幫助。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1:是本申請(qǐng)實(shí)施例中巢式PCR電泳結(jié)果圖,其中A為樣品擴(kuò)增結(jié)果,B為克隆后的菌落PCR電泳結(jié)果;
[0024]圖2:是本申請(qǐng)實(shí)施例中提取質(zhì)粒的酶切結(jié)果圖;
[0025]圖3:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVl標(biāo)準(zhǔn)品(10 O退火溫度優(yōu)化結(jié)果;
[0026]圖4:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVl標(biāo)準(zhǔn)品10-1-10-6退火溫度優(yōu)化結(jié)果;
[0027]圖5:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVl標(biāo)準(zhǔn)品(KT1-1CT6)優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)曲線;
[0028]圖6:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2標(biāo)準(zhǔn)品(10’退火溫度優(yōu)化結(jié)果;
[0029]圖7:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2標(biāo)準(zhǔn)品(IO1-1O 6)退火溫度優(yōu)化結(jié)果;
[0030]圖8:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2標(biāo)準(zhǔn)品(I0-1-1CT6)優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)曲線;
[0031 ]圖9:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVl實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果;
[0032]圖10:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果;
[0033]圖11:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVl實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度測(cè)試結(jié)果;
[0034]圖12:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度測(cè)試結(jié)果;
[0035]圖13:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVI標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線;
[0036]圖14:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVl標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線;
[0037]圖15:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線;
[0038]圖1.6:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線;
[0039]圖17:是本申請(qǐng)實(shí)施例中雙重實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性結(jié)果;
[0040]圖18:是本申請(qǐng)實(shí)施例中雙重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)TTSuVl的靈敏度檢測(cè);
[0041]圖19:是本申請(qǐng)實(shí)施例中雙重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)TTSuV2的靈敏度檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0042]本申請(qǐng)以TTSuV不同基因型的保守序列為目的片段進(jìn)行研究,設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物及Taqman探針,最終獲得分別針對(duì)TTSuVl和TTSuV2的非編碼區(qū)(UTR)設(shè)計(jì)的特異性引物和Taqman探針,分別建立檢測(cè)TTSuVl和TTSuV2的單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。另外,考慮到臨床檢測(cè)的工作量和檢驗(yàn)檢疫業(yè)務(wù)快速準(zhǔn)確的要求,本申請(qǐng)?jiān)诮⒌膯沃貙?shí)時(shí)熒光PCR方法的基礎(chǔ)上,建立了同時(shí)檢測(cè)TTSuVl和TTSuV2雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法。
[0043]本申請(qǐng)?jiān)诂F(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究,從而猶得了一對(duì)全新的檢測(cè)引物和探針,為豬細(xì)環(huán)病毒I型和豬細(xì)環(huán)病毒II型的檢測(cè)提供了一種新的方案,從而提高了檢驗(yàn)檢疫的質(zhì)量和工作效率,對(duì)檢驗(yàn)檢疫和實(shí)踐生產(chǎn)都具有重要的意義。需要說(shuō)明的是,本申請(qǐng)的引物和探針都是針對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)而設(shè)計(jì)的,具體的是特別針對(duì)雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法而設(shè)計(jì)的;因此,本申請(qǐng)的引物和探針都具有很好的特異性;可以理解,在本申請(qǐng)的基礎(chǔ)上,完全可以單獨(dú)將本申請(qǐng)的引物直接用于常規(guī)PCR檢測(cè)或者其它基于PCR擴(kuò)增的檢測(cè);同樣的,本申請(qǐng)的探針也完全可以用于除了本申請(qǐng)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法的其它檢測(cè)中,比如基因芯片檢測(cè),或者其它基于核苷酸片段的檢測(cè)。其中,基于PCR擴(kuò)增的檢測(cè)如基因芯片的靶標(biāo)片段擴(kuò)增、克隆、測(cè)序等。
[0044]還需要說(shuō)明的是,將本申請(qǐng)的探針用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)時(shí),根據(jù)探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的原理,探針的5 ’端需要標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán),3 ’端需要標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán),可以理解,如果不考慮雙重或多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè),現(xiàn)有的熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)都可以用于本申請(qǐng)。另外,本申請(qǐng)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中,其關(guān)鍵在于采用了本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)的引物和探針,可以理解,檢測(cè)樣品可以是培養(yǎng)提純的病毒樣品、提取自疑似感染的生物的組織或分泌物的樣品或通過(guò)其它方式提取或保存的樣品。
[0045]在本申請(qǐng)的引物、探針和實(shí)時(shí)突光PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,本申請(qǐng)進(jìn)一步研究了用于檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒II型的檢測(cè)試劑盒??梢岳斫?,直接將本申請(qǐng)的引物或探針制備成干粉或者高濃度的溶液即可作為試劑盒組分保存?zhèn)溆?。另?如前面所提到的,本申請(qǐng)的引物或者探針可以單獨(dú)的用于其它的檢測(cè)使用,因此,試劑盒中同樣可以只含有引物或探針;此外,對(duì)于涉及到的常規(guī)PCR檢測(cè)或?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)等所需要的試劑,可以直接放置于本申請(qǐng)的試劑盒中,也可以在使用試劑盒時(shí),從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)相應(yīng)的試劑,在本申請(qǐng)中不做具體限定。
[0046]本申請(qǐng)中的檢測(cè)試劑盒在豬細(xì)環(huán)病毒II型檢測(cè)中的應(yīng)用,如前面所述,同樣的,該應(yīng)用也包括了目前的各種基于引物和/或探針的核酸分子檢測(cè);如常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、基因芯片、克隆、測(cè)序等等ο
[0047]還需要說(shuō)明的是,本申請(qǐng)中的染料法實(shí)時(shí)熒光PCR和探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光PCR是實(shí)時(shí)熒光PCR方法中的兩大類型;染料法實(shí)時(shí)熒光PCR如SYBR GREEN等,是利用染料與雙鏈DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的,因此可以僅用一對(duì)特異性的引物即可進(jìn)行;探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光PCR如Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR,是利用特異性探針兩端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán),在探針完整時(shí)報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,而PCR擴(kuò)增時(shí)將結(jié)合到模板上的特異性探針被酶切降解,報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi),產(chǎn)生可以被檢測(cè)的熒光信號(hào),實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。
[0048]下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例僅僅對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明,不應(yīng)理解為對(duì)本申請(qǐng)的限制。
[0049]一、試驗(yàn)材料和設(shè)備
[0050]1.工具酶和主要試劑
[0051]MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit 購(gòu)自 Roche。Premix ExTaqTM(Perfect Real Time) ,Premix Ex Taq、Ex Taq、dNTP Mixt'ure、2XGC buffer 1、DNAMarker DL2000、DNA Marker DL5000、凝膠 DNA 回收試劑盒、pMD18_T Vector、質(zhì)粒 DNA 小量純化試劑盒等購(gòu)于大連寶生物公司。Jml09大腸桿菌、IPTG、X-Gal、甘油、NaCl均為分析純,購(gòu)自上海生工。Ampicillin、CaC12購(gòu)自Sigma。瓊脂糖購(gòu)自Promega。胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉等購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技公司。膠紅購(gòu)自Biotium。
[0052]2.試驗(yàn)儀器
[0053]本實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器如表1所示。
[0054]表1實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種用于豬細(xì)環(huán)病毒I1:型檢測(cè)的引物,其特征在于:所述引物包括上游引物和下游引物,所述上游引物含有Seq ID N0.4所示序列,所述下游引物含有Seq ID N0.5所示序列;
Seq ID N0.4:5’ -TATCGGGCAGGCGGTAATC-3’
Seq ID N0.5:5’ -TACGCTACCGTCAGCCATCTTT-3’。
2.一種用于豬細(xì)環(huán)病毒II型檢測(cè)的探針,其特征在于:所述探針含有Seq ID N0.6所-小'序列;
Seq ID N0.6:5’ -AACCGGGCCCCCCTCGATG-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針,其特征在于:所述探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán),3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的探針,其特征在于:所述熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX,所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQl。
5.一種豬細(xì)環(huán)病毒I1:型的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,包括采用權(quán)利要求1所述的引物和權(quán)利要求3或4所述的探針進(jìn)行Taqman熒光定量PCR檢測(cè)。
6.一種豬細(xì)環(huán)病毒II型的檢測(cè)試劑盒,其特征在于:所述檢測(cè)試劑盒中含有權(quán)利要求1所述的引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所 述的檢測(cè)試劑盒,其特征在于:所述檢測(cè)試劑盒中還含有權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的檢測(cè)試劑盒在豬細(xì)環(huán)病毒II型檢測(cè)中的應(yīng)用。
9.一種采用權(quán)利 要求6或7所述的檢測(cè)試劑盒對(duì)豬細(xì)環(huán)病毒II型進(jìn)行的檢測(cè),所述檢測(cè)包括但不限于,常規(guī)PCR、染料法實(shí)時(shí)熒光PCR、探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光PCR中的至少一種。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103882150SQ201410105922
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】楊春華, 孫思揚(yáng), 馬欣欣, 祝建新 申請(qǐng)人:江西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心