一種玉米病原菌誘導啟動子pGRMZM2G174449的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程【
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】，提供了一個玉米病原菌誘導啟動子pGRMZM2G174449，該啟動子能夠被玉米紋枯病菌YWK-196,水稻白葉枯病病菌及細菌性條斑病病菌激活?？梢岳帽景l(fā)明啟動子構(gòu)建植物表達載體，用于通過植物基因工程技術(shù)改善植物對各種病害的抗性。【專利說明】—種玉米病原菌誘導啟動子pGRMZM2G174449【
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】[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程【
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】，提供了一個玉米病原菌誘導啟動子，該啟動子可用于通過植物基因工程技術(shù)改善植物抗病性和其他有益生產(chǎn)性狀?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]由真菌、細菌、病毒以及線蟲引起的植物疾病為作物生產(chǎn)帶來巨大影響。植物擁有兩套不同的抗性機制:一是被動防御機制，是指一些抗性相關(guān)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，如表皮和堅硬的細胞壁(BradyJD,FryS.Formationofd1-1sodityrosineandlossofisodityrosineinthecellwallsoftomatocell—suspensionculturestreatedwithfungalelicitorsorH2O2.PlantPhysioll997,115:87-92.)。另一個是主動防御，主動防御是抗性基因與病原菌識別并且互作引起的。病原物無毒基因(avr)編碼的激發(fā)子與寄主植物響應(yīng)的抗病基因(R)編碼激發(fā)子的受體分子相互作用產(chǎn)生抗病反應(yīng)。植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)一般經(jīng)歷信號識別、信號傳導、防衛(wèi)基因表達三個環(huán)節(jié)。主動防御中所有類型的抗病機制都要依靠防衛(wèi)基因表達，抵抗的有效性取決于基因表達的時空特性。正是由于防衛(wèi)基因的時空表達特性，其啟動子往往具有某些特殊的順式作用元件，人們可以利用防衛(wèi)基因、尤其是其順式元件為基因工程改良提供有利的工具。植物中絕大部分抗病基因都編碼具有核苷酸結(jié)合位點以及亮氨酸重復(fù)的蛋白(NBS-LRR),(McHaleL,TanX,KoehlP,MichelmoreRff.PlantNBS-LRRproteins!adaptableguards.GenomeBiol2006,7:212.)。但是對于這類基因的啟動子研究還比較少。[0003]植物基因啟動子是重要的順式作用元件，是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)的DNA序列，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。從1983年第一株轉(zhuǎn)基因植物問世以來，啟動子一直是基因工程的研究熱點，選擇合適并有效表達的啟動子將為基因工程的研究奠定堅實的基礎(chǔ)。組織特異啟動子可以使外源基因的表達只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)特性；誘導型啟動子可以使外源基因?qū)δ承┬盘柈a(chǎn)生響應(yīng)，只在特殊信號刺激下表達。這些啟動子的最大優(yōu)點是:它克服了組成型啟動子啟動的外源基因在受體植物中非特異性的持續(xù)、高效表達所造成的浪費，并且滿足某些需要外源基因特異表達的需求。組織特異性或誘導表達啟動子一直以來都是植物基因工程研究的重點和難點。[0004]目前，已經(jīng)找到一些組織特異性或誘導表達啟動子，并發(fā)現(xiàn)其上存在的相應(yīng)的順式因子，為后來的啟動子研究奠定了基礎(chǔ)。煙草的Sar8.2b基因受水楊酸(SA)誘導，在其啟動子上發(fā)現(xiàn)了幾個順式作用因子，包括as-Ι因子、GT21和Dof結(jié)合序列。SA誘導Sar8.2b基因表達可能存在于-728至_927bp和-197至_351bp的區(qū)域的順式因子中(SongF，GoodmanRM.CloningandidentificationofthepromoterofthetobaccoSar8.2bgene,ageneinvolvedinsystemicacquiredresistance.Gene2002,290:115-124.X玉米鹿糖合成酶I只在韌皮部細胞中表達(YangNS,RussellD.Maizesucrosesynthase-promoterdirectsphloemcellspecificexpressionofgusgeneintransgenictobaccoplants.ProcNatlAcadScil990,87:4144-4148.)。PsGNS2啟動子只在種子中特異表達(BuchnerP，RochatCjWuillemeS，BoutinJP.Characterizationofatissue-specificanddevelopmentalIyregulatedbeta-1,3-glucanasegeneinpea(Pisumsativum).PlantMolBiol2002，49:171-186.)。[0005]玉米是最重要的糧食作物之一，玉米紋枯病是由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)引起的真菌性病害，是我國玉米產(chǎn)區(qū)的主要病害之一。玉米抗病基因的克隆以及啟動子的分離可以使我們更好地了解寄主與病原菌的互作并為基因工程改良奠定基礎(chǔ)。因此如何利用玉米抗病基因的克隆以及啟動子的分離獲得抗病植株成為亟待解決的問題之一?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一個玉米病原菌誘導啟動子，該啟動子能夠被水稻白葉枯病病菌黃單胞菌PX099，水稻細菌性條斑病病菌RS105以及玉米紋枯病菌YWK-196所激活。通過對該啟動子進行截短，確定了_574bp至_550bp和_490bp至-478bp為病原誘導關(guān)鍵區(qū)域，可以利用本發(fā)明啟動子構(gòu)建成各種植物表達載體，用于通過植物基因工程技術(shù)改善植物品質(zhì)和其他有益生產(chǎn)性狀。[0007]發(fā)明人首先提供了一個玉米病原菌誘導啟動子，命名為pGRMZM2G174449，該啟動子基因序列中含有如序列表SEQIDN0.1所不的DNA序列。[0008]該啟動子來源于玉米B73(Zeamays),是下述核苷酸序列之一:[0009]序列表中SEQIDN0.1所示的DNA序列或部分DNA序列。[0010]序列表中的SEQIDN0.1由2000個堿基組成，自5端第1955位堿基為轉(zhuǎn)錄起始位點，記為+1。[0011]其中TATA框位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-30至-24位堿基，而CAAT框位于-53至-50位堿基，這些元件在轉(zhuǎn)錄中是基本啟動子元件。[0012]自5端第-915位，-702位，-643位，-500位，-261位，-65位堿基為黃化誘導元件ACGTATERD1;自5,端第-1010位，-357位堿基為胚和胚乳特異表達元件CANBNNAPA；自5'端第-798位堿基為熱激蛋白基因表達元件CCAATB0X1;自5,端第-1659位，-1459位，-574位，-292位，-210位堿基為銅離子誘導表達元件CUREC0RECR;自5,端第-1185位，-926位堿基為DNA結(jié)合蛋白基因表達元件D0FC0REZM;自5,端第-1357位，-1327位，-1268位，-932位，-722位，-613位，-582位，-544位，-349位，-271位，-39位堿基為貯藏蛋白基因表達元件EB0XBNNAPA；自5端第-1022位，-700位，-236位堿基為增強子元件EECCRCAH1;自5,端第-1302位，-1044位，-660位，-206位堿基為光誘導元件GATAB0X；自5'端第-180位堿基為病原菌和鹽離子誘導表達元件GT-1；自5端第-1129位，-343位堿基為GA誘導元件PYRMIDINEB0X0SRAMY1A。GRMZM2G174449啟動子pGRMZM2G174449的序列分析結(jié)果表明GRMZM2G174449基因在水稻抗性和脅迫誘導過程中受復(fù)雜因素的調(diào)控。[0013]同時通過截短驗證,確定了病原誘導相關(guān)區(qū)段位于_574bp至_549bp和_490bp至-478bp，在確定了上述的病原誘導關(guān)鍵區(qū)域后，可以方便的與其他抗病相關(guān)基因通過基因工程改造來改善植物抗病性。[0014]除此之外，本發(fā)明的發(fā)明還提供了含有PGRMZM2G174449的重組載體，并命名為pC1391::pGRMZM2G174449。[0015]綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人在國際上首次提供了一個玉米病原菌誘導啟動子PGRMZM2G174449，水稻轉(zhuǎn)基因證明發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株受到黃單胞菌PX099，水稻細菌性條斑病菌RS105以及玉米紋枯病菌YWK-196誘導后⑶S活性有顯著上升，說明pGRMZM2G174449含有相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)因子。PGRMZM2G174449在模式植物中的表達特征表明其是一個病原相關(guān)的啟動子。PGRMZM2G174449的功能研究可為揭示GRMZM2G174449的表達調(diào)控機理以及具體功能打下基礎(chǔ)，還可應(yīng)用于玉米抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中?！緦＠綀D】【附圖說明】[0016]圖1為本發(fā)明所述啟動子轉(zhuǎn)化水稻中花植株受到黃單胞菌PX099、細菌性條斑病菌RS105誘導后GUS染色觀察結(jié)果灰度圖，[0017]其中H2O為對照，接種24h后進行染色及定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種8h后⑶S活性有明顯提高，隨后逐漸降低，說明該啟動子受到上述病原細菌的誘導；[0018]圖2為圖1中誘導后的⑶S定量檢測結(jié)果不意圖；[0019]圖3為本發(fā)明所述啟動子轉(zhuǎn)化水稻中花植株受到玉米紋枯病菌YWK-196誘導后GUS染色觀察結(jié)果灰度圖及GUS定量檢測結(jié)果；[0020]不接菌CK為對照，接種24h后進行⑶S染色及定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種8h后⑶S活性達到峰值，隨后逐漸降低，說明該啟動子受到上述病原真菌的誘導；[0021]圖4為圖3中誘導后的⑶S定量檢測結(jié)果示意圖；[0022]圖5為本發(fā)明所述不同截短啟動子在本生煙上瞬時表達后受到玉米紋枯病菌YWK-196誘導后GUS定量檢測結(jié)果示意圖；[0023]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種24h后進行⑶S定量檢測，在截去_694bp至_454bp和_454bp至_274bp這兩個區(qū)段后，⑶S活性明顯減弱，說明與病原誘導相關(guān)的元件存在于這兩個區(qū)段；[0024]圖6為本發(fā)明所述不同截短啟動子在本生煙上瞬時表達后受到玉米紋枯病菌YWK-196誘導后GUS定量檢測結(jié)果示意圖；[0025]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種24h后進行⑶S定量檢測，在截去_574bp至_454bp這個區(qū)段后，GUS活性明顯減弱，說明與病原誘導相關(guān)的元件存在于這個區(qū)段；[0026]圖7為本發(fā)明所述不同截短啟動子在本生煙上瞬時表達后受到玉米紋枯病菌YWK-196誘導后GFP熒光觀察結(jié)果灰度圖；[0027]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種24h后進行突光觀察,_574bp至_550bp和_490bp至_478bp能夠檢測到報告基因表達，其他區(qū)段沒有表達，說明與病原誘導相關(guān)元件位于_574bp至-550bp和_490bp至_478bp這兩個區(qū)域。【具體實施方式】[0028]以下實施例中進一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；[0029]實施例1玉米GRMZM2G174449基因啟動子pGRMZM2G174449序列分析[0030]首先，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中GRMZM2G174449基因序列信息，確定其起始密碼子ATG上游2000bp的序列為其啟動子，其核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。[0031]用PLACE(HigoK,UgawaY,IwamotoMjKorenagaT.Plantcis-actingregulatoryDNA_elements(PLACE).NuclAcidsResl999，27:297-300.)軟件對玉米GRMZM2G174449的啟動子核苷酸序列(序列表中的SEQIDN0.1)進行序列分析。[0032]用上述軟件對GRMZM2G174449基因啟動子pGRMZM2G174449中的順式作用元件進行搜索、預(yù)測，結(jié)果該啟動子中含有眾多與已知真核生物的順式元件的同源序列。其中，將GRMZM2G174449cDNA序列的第一個堿基定義為轉(zhuǎn)錄起始位點(記為+1)，即序列表中SEQIDN0.1自5端的第1955位堿基，其中TATA框位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-30至-24位堿基，而CAAT框位于-53至-50位堿基，這些元件在轉(zhuǎn)錄中是基本啟動子元件。自5端第-915位，-702位，-643位，-500位，-261位，-65位堿基為黃化誘導元件ACGTATERD1(SimpsonSDjNakashimaK，NarusakaY，SekiMjShinozakiK，Yamaguch1-ShinozakiK.Twodifferentnovelcis-actingelementsoferdl，aclpAhomologousArabidopsisgenefunctionininductionbydehydration-stressanddark-1nducedsenescence.PlantJ2003，33:259-270.);自5,端第-1010位，-357位堿基為胚和胚乳特異表達元件CANBNNAPA(EllerstromM，StalbergK,EzcurraI，RaskL.Functionaldissectionofanapingenepromoter:1dentificationofpromoterelementsrequiredforembryoandendosperm-specifictranscription.PlantMolBioll996，32:1019-1027.);自5,端第-798位堿基為熱激蛋白基因表達元件CCAATB0X1(RiepingM,SchofflF.Synergisticeffectofupstreamsequences,CCAATboxelements，andHSEsequencesforenhancedexpressionofchimaericheatshockgenesintransgenictobacc0.MolGenGenetl992，231:226-232.);自5,端第-1659位，-1459位，-574位，-292位，-210位減基為銅離子誘導表達兀件CUREC0RECR(QuinnJMjMerchantS.Twocopper-responsiveelementsassociatedwiththechlamydomonasCyc6genefunctionastargetsfortranscriptionalactivators.PlantCelll995,7:623-628.)；自5'端第-1185位，-926位堿基為DNA結(jié)合蛋白基因表達元件D0FC0REZM(YanagisawaS.DoflandDof2transcriptionfactorsareassociatedwithexpressionofmultiplegenesinvolvedincarbonmetabolisminmaize.PlantJ2000，21:281-288.);自5'端第-1357位，-1327位，-1268位，-932位，-722位，-613位，-582位，-544位，-349位，-271位，-39位減基為肥!藏蛋白基因表達兀件EBOXBNNAPA(StalbergK,EllerstomMjEzcurraI,AblovS，RaskL.DisruptionofanoverlappingE-box/ABREmotifabolishedhightranscriptionofthenapAstorage-proteinpromoterintransgenicBrassicanapusseeds.Plantal996，199:515-519.);自5端第-1022位，-700位，-236位堿基為增強子兀件EECCRCAH1(YoshiokaS，TaniguchiF，MiuraK，InoueT，YamanoTjFukuzawaH.ThenovelMybtranscriptionfactorLCRlregulatestheC02_responsivegeneCahljencodingaperiplasmiccarbonicanhydraseinChlamydomonasreinhardti1.PlantCell2004，16:1466-1477.);自5,端第-1302位，-1044位，-660位，-206位堿基為光誘導兀件GATAB0X(GilmartinPM,SarokinL，MemelinkJjChuaNH.Molecularlightswitchesforplantgenes.PlantCelll990，2:369-378.);自5'端第_180位減基為病原菌和鹽離子誘導表達兀件GT-1(ParkHC,KimML,KangYH,JeonJM,YooJH,KimMC,ParkCY,JeongJC,MoonBC,LeeJH,YoonHW,LeeSH,ChungWS,LimCO,LeeSY,HongJC,ChoMJ.Pathogen-andNaCl—inducedexpressionoftheSCaM~4promoterismediatedinpartbyaGT-1boxthatinteractswithaGT—l—liketranscriptionfactor.PlantPhysiol2004,135:2150-2161.);自5[0033]端第-1129位，-343位堿基為GA誘導元件PYRMIDINEB0X0SRAMY1A(MenaM,CejudoFJ,Isabel-LamonedaI,CarboneroP.ArolefortheDOFtranscriptionfactorBPBFintheregulationofgibbere11in-responsivegenesinbarleyaleurone.PlantPhysiol2002,130:111-119.)。[0034]GRMZM2G174449啟動子pGRMZM2Gl74449的序列分析結(jié)果表明GRMZM2G315431基因在水稻抗性和脅迫誘導過程中受復(fù)雜因素的調(diào)控。[0035]表1GRMZM2G174449啟動子序列中的調(diào)控元件分析[0036]【權(quán)利要求】1.一種玉米病原誘導啟動子PGRMZM2G174449，其特征在于:其基因序列如SEQIDN0.1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于:該啟動子可以被玉米紋枯病菌或水稻白葉枯病病菌或水稻細菌性條斑病病菌激活。3.權(quán)利要求1所述的啟動子在抗紋枯病、水稻白葉枯病和水稻細菌性條斑病抗性改良中的應(yīng)用。【文檔編號】C12N15/113GK103937795SQ201410106255【公開日】2014年7月23日申請日期:2014年3月20日優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日【發(fā)明者】儲昭輝,丁新華,李寧申請人:山東農(nóng)業(yè)大學