一種北極海洋細(xì)菌與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種北極海洋細(xì)菌與應(yīng)用，該菌株于2013年9月26日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，菌種保藏號(hào)：CCTCC?M2013437。該菌株可以大量分泌北極海洋細(xì)菌胞外多糖。該多糖具有良好的流變學(xué)性質(zhì)，吸濕、保濕和清除有機(jī)自由基，羥自由基、氧自由基的活性，安全無(wú)毒、無(wú)刺激性等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種北極海洋細(xì)菌與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種北極海洋細(xì)菌與應(yīng)用，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】[0002]微生物胞外多糖是微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外形成與菌體分離的可溶性多糖及多糖復(fù)合物。微生物胞外多糖種類繁多，主要由D-葡萄糖、D-半乳糖和D-甘露糖等單糖組成。它們具有植物多糖不具備的優(yōu)良性質(zhì):生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、地域和病蟲(chóng)害條件限制，具有較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和廣闊的發(fā)展前景。微生物多糖在工業(yè)生產(chǎn)與生活的許多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如作為微生物絮凝劑、微生物采油中的生物化學(xué)調(diào)剖劑、食品添加劑、保鮮劑、抗癌醫(yī)藥品、包裝材料、化妝品等。尤其在化妝品領(lǐng)域，多糖作為人體皮膚真皮層重要組成成分，在皮膚新陳代謝過(guò)程中具有突出調(diào)節(jié)作用。多糖的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)為其在化妝品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，將各種多糖應(yīng)用于化妝品中，能產(chǎn)生保濕、穩(wěn)定、改善膚色、抗氧化和抗菌、保護(hù)血管、促進(jìn)上皮纖維的細(xì)胞增殖和美化皮膚等功能，其中在保濕和抗氧化作用上顯得尤為重要。在保濕方面，保濕作用一直是護(hù)膚化妝品最主要的研究課題之一。當(dāng)皮膚組織細(xì)胞和細(xì)胞間的水分含量減少時(shí)，細(xì)胞排列緊密，膠原蛋白失水硬化，皮膚就會(huì)顯得干燥、失去彈性、起皺、老化。多糖的糖分子鏈相互交織成網(wǎng)狀保持了一定的水分，且多糖分子中極性基團(tuán)可與水分子形成氫鍵而結(jié)合大量的水分，這便為皮膚提供了水分來(lái)源。多糖還有具有良好的成膜性能，可在皮膚表面形成一層均勻的薄膜，減少皮膚表面的水分蒸發(fā)，保存皮膚自身的水分。在抗氧化方面，根據(jù)自由基理論，過(guò)氧化作用是造成人體皮膚衰老的根本原因。多糖能夠捕獲或淬滅脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的自由基，起到抗氧化的作用。
[0003]但是，當(dāng)前只有黃原膠、結(jié)冷膠等很少種類的微生物多糖被應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。因此，有必要篩選、分離新的多糖產(chǎn)生菌，并對(duì)它們所產(chǎn)多糖的結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)特性進(jìn)行深入探究，以進(jìn)一步拓展它們的應(yīng)用領(lǐng)域。近幾年，隨著對(duì)微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖產(chǎn)量的年增長(zhǎng)量在10%以上，而一些新型多糖年增長(zhǎng)量在30%以上，現(xiàn)在世界上每年多糖總需求量在100萬(wàn)噸以上，總價(jià)值50-100億美元。因此，多糖的生產(chǎn)具有巨大的市場(chǎng)價(jià)值。
[0004]海洋微生物因其獨(dú)特的生活環(huán)境，分泌的胞外多糖具有特殊結(jié)構(gòu)，預(yù)示著可能在生物【技術(shù)領(lǐng)域】中將有新的潛在用途。雖然海洋微生物分泌的胞外多糖國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有一些研究，但總體來(lái)看開(kāi)發(fā)利用程度仍然很低。北極獨(dú)特的地理和氣候條件，形成了一個(gè)低溫、干燥、強(qiáng)輻射的極端環(huán)境，而在北極海洋中生存著大量可產(chǎn)胞外多糖的微生物菌群。生存于北極海洋這個(gè)極端環(huán)境中的微生物所產(chǎn)的胞外多糖更是具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)與物理化學(xué)性質(zhì)，使其在制藥、化妝品、食品添加劑等方面具有廣闊的市場(chǎng)前景。因此制備北極海洋微生物所產(chǎn)胞外多糖，并研究其結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，對(duì)于開(kāi)發(fā)和利用北極海洋微生物胞外多糖的應(yīng)用潛力具有非常重要的意義，也是開(kāi)辟和利用北極海洋自然資源的迫切需要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種北極海洋細(xì)菌與應(yīng)用，該北極海洋細(xì)菌能夠產(chǎn)生具有新穎結(jié)構(gòu)、良好流變學(xué)性質(zhì)、安全無(wú)毒的胞外多糖。
[0006]一株北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株，該菌株于2013年9月21日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，菌種保藏號(hào):CCTCC M2013437。
[0007]提取該北極海洋細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行菌種鑒定。將其基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，與北極海洋細(xì)菌相似性較高的菌株有Polaribacter sejongensisK0PRI21160T (相似度:99.13%)，Polaribacter butkevichii KMM3938T (相似度:98.67%)和Polaribacter irgensii23_PT (相似度:97.43%)。因此，北極海洋細(xì)菌屬于極桿菌屬(Polaribacter)。
[0008]上述北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株在制備北極海洋細(xì)菌胞外多糖中的應(yīng)用。
[0009]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述應(yīng)用，步驟如下:
[0010](I)將活化后的北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中，在15~20°C條件下震蕩培養(yǎng)I~2天，然后按2~3% (v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10~15°C、溶解氧飽和度高于30%、培養(yǎng)過(guò)程中pH控制在7.5~8.0的條件下，培養(yǎng)6~9天，在培養(yǎng)期間補(bǔ)加工業(yè)葡萄糖溶液，制得發(fā)酵液；
[0011](2)向步驟(1)制得的發(fā)酵液中加入1.5~3倍體積的無(wú)水乙醇，經(jīng)醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌，經(jīng)干燥后，溶于水中配制濃度為0.02~0.03g/mL的溶液；然后，加入復(fù)合蛋白酶使溶液中復(fù)合蛋白酶的濃度為10~15U/mL，在45~50°C、120~150rpm的條件下，酶解5~6h ;再加入1.5~3倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌，經(jīng)干燥，制得北極海洋細(xì)菌胞外多糖粗品；
[0012](3)將步驟(2)制得的北極海洋細(xì)菌胞外多糖粗品溶于蒸餾水中，制得濃度為
0.5~2mg/mL的溶液，然后經(jīng)離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析純化，干燥，制得北極海洋細(xì)菌胞外多糖。
[0013]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中活化后的北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.)SMl 127菌株是將北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.) SMl 127菌株在溫度為15~20°C條件下，在固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)2~3天后制得的。
[0014]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，上述固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份:
[0015]蛋白胨0.8~1.0份，酵母粉0.5~0.75份、瓊脂1.0~1.5份，人工海水100份，pH 為 7.5 ~8.0。
[0016]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的液體種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量份:
[0017]蛋白胨0.8~1.0份，酵母粉0.5~0.75份，人工海水100份，pH為7.5~8.0。
[0018]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量份:
[0019]蛋白胨0.943份，酵母粉0.5份，工業(yè)葡萄糖3.65份，人工海水100份，pH為7.5。
[0020]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的工業(yè)葡萄糖溶液為由人工海水和工業(yè)葡萄糖配制的濃度625g/L的溶液。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的補(bǔ)加工業(yè)葡萄糖溶液的次數(shù)為三次，補(bǔ)加時(shí)間為培養(yǎng)的第3天、第4天和第5天，補(bǔ)加的體積分別為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的4%、4%和2%。
[0022]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的復(fù)合蛋白酶購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司。添加復(fù)合蛋白酶的目的是分解溶液中的蛋白質(zhì)，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇合適的市售產(chǎn)品。
[0023]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)和步驟(3)中的醇沉，溫度為3~6°C，時(shí)間為20 ~40min。
[0024]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)和步驟(3)中的干燥為真空凍干，溫度為-50 ~-60 0C ο
[0025]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中的離子交換層析次數(shù)為一次，層析柱規(guī)格:16_X 250mm,凝膠類型:DEAE-Sepharose Fast Flow, O ~0.7M NaCl 溶液梯度洗脫,流速36mL/h。
[0026]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中凝膠過(guò)濾層析次數(shù)為二次，層析柱規(guī)格:16mmX950mm,凝膠類型:Sepharose4B,以蒸懼水洗脫,流速15mL/h。
[0027]上述制備方法制得的北極海洋細(xì)菌胞外多糖，其特征在于，分子量為220kDa ；
[0028]上述制備方法制得的北極海洋細(xì)菌胞外多糖，其特征在于，其組分如下，均為摩爾百分比:
[0029]N-乙酰己糖胺28%、甘露糖23.4%、葡萄糖醛酸21.4%、半乳糖17.4%、海藻糖7.4%、葡萄糖1.6%、鼠李糖0.8% ；
[0030]上述制備方法制得的北極海洋細(xì)菌胞外多糖，其特征在于，糖苷鍵連接方式如下，均為摩爾百分比:
[0031]4-連接的葡萄糖醛酸殘基13.2%、2_連接的半乳糖殘基13.0%、末端半乳糖殘基
11.5%、4_連接的葡萄糖殘基10.2%、末端海藻糖殘基9.2%、2，3-連接的甘露糖殘基8.5%、4-連接的海藻糖殘基7.9%、3-連接的半乳糖殘基7.9%、4_連接的N-乙酰己糖胺殘基6.5%、末端甘露糖殘基5.6%、末端N-乙酰己糖胺殘基2.9%、3_連接的甘露糖殘基1.8%、末端葡萄糖殘基1.0%、4，6-連接的甘露糖殘基0.6%、2_連接的鼠李糖殘基0.2%。
[0032]有益效果
[0033]1、本發(fā)明首次以北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.) SMl 127為菌株發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖，建立該菌株合成分泌的胞外多糖的優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)工藝，通過(guò)本發(fā)明的生產(chǎn)工藝獲得的北極海洋細(xì)菌SM1127發(fā)酵液中，胞外多糖含量為17.84±0.22g/L。本發(fā)明的北極海洋細(xì)菌屬于極桿菌屬(Polaribacter),已報(bào)道的對(duì)極桿菌屬的細(xì)菌的研究很少,其中產(chǎn)胞外多糖的細(xì)菌更少，目前還未有報(bào)道研究極桿菌屬細(xì)菌的產(chǎn)胞外多糖量，因此本發(fā)明的北極海洋細(xì)菌在極桿菌屬中產(chǎn)糖量最高，而且遠(yuǎn)高于其它屬的海洋細(xì)菌及現(xiàn)有發(fā)酵方法獲得的多糖產(chǎn)量；
[0034]2、通過(guò)本方法制得的胞外多糖具有與其它多糖不同的結(jié)構(gòu)，分析其糖基組成和糖苷鍵連接方式，可得多糖由N-乙酰己糖胺(28%)、甘露糖(23.4%)、葡萄糖醛酸(21.4%)和半乳糖(17.4%)組成，還含有部分海藻糖(7.4%)，少量的葡萄糖(1.6%)和鼠李糖(0.8%);其糖苷鍵連接方式呈現(xiàn)多樣化，且各連接方式所占比例分布較為平均，包括4-連接的葡萄糖醛酸殘基(13.2%)，2-連接的半乳糖殘基(13.0%)，末端半乳糖殘基(11.5%)，4-連接的葡萄糖殘基(10.2%)等等，且分子量大小為220kDa，屬于一種新穎的胞外多糖；[0035]3、通過(guò)本方法制得的胞外多糖具有良好的粘彈性、剪切稀化性和觸變性等流變學(xué)性質(zhì)，并具有良好的溫度穩(wěn)定性、PH穩(wěn)定性和鹽穩(wěn)定性，在化妝品、石油開(kāi)采等工業(yè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力；
[0036]4、通過(guò)本方法制得的胞外多糖在小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為無(wú)毒，在兔子皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為無(wú)刺激性，屬于安全性產(chǎn)品，可安全用于化妝品、藥品、食品等領(lǐng)域；
[0037]5、通過(guò)本方法制得的胞外多糖，具有良好的吸濕、保濕效果，在相對(duì)濕度為43%和81%的條件下，吸濕率分別為10.0 ± 0.5%和22.1 ± 0.6% ;在干硅膠環(huán)境中放置72h后，胞外多糖保濕率為75.79±2.5%。已報(bào)道的多糖中，保濕性比較高的有假單胞菌屬的(Pseudomonas f luorescens)PGM37產(chǎn)的胞外多糖、裂裙多糖(PSG)和綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)多糖。其中，(Pseudomonas fluorescens) PGM37產(chǎn)的胞外多糖和綠色巴夫藻(Pavlova viridis)多糖的保濕性低于透明質(zhì)酸，裂褶多糖保濕性低于甘油，而本方法制得的胞外多糖在相同的檢測(cè)方法和條件下保濕性高于透明質(zhì)酸和甘油，是目前發(fā)現(xiàn)的保濕效果最好的多糖。而且，具有吸濕、保濕性的北極海洋細(xì)菌胞外多糖的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本發(fā)明制備的多糖純品可作為吸濕、保濕劑應(yīng)用于化妝品中，在化妝品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前
旦
牙、；
[0038]6、通過(guò)本方法制得的胞外多糖具有良好的清除自由基的能力，在濃度為10.0mg/HiL的條件下，對(duì)有機(jī)自由基1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH.)、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別達(dá)到55.40±3%、52.1 + 2.1%和28.2±3%。具有抗氧化活性的北極海洋細(xì)菌胞外多糖的研究還未 見(jiàn)報(bào)道，本發(fā)明制備的多糖純品在醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1、發(fā)酵時(shí)間與北極海洋細(xì)菌胞外多糖產(chǎn)量的曲線圖；
[0040]圖2、北極海洋細(xì)菌胞外多糖的陰離子交換層析洗脫曲線圖；
[0041]圖3、北極海洋細(xì)菌胞外多糖的凝膠過(guò)濾層析洗脫曲線圖；
[0042]圖4、北極海洋細(xì)菌胞外多糖的GC/MS糖基組成圖；
[0043]圖5、北極海洋細(xì)菌胞外多糖的GC/MS糖苷鍵連接方式圖；
[0044]圖6、不同濃度的北極海洋細(xì)菌胞外多糖溶液的粘度變化曲線圖；
[0045]圖7、不同濃度的北極海洋細(xì)菌胞外多糖溶液在不同的剪切速率下的粘度變化曲線圖；
[0046]圖8、不同濃度的北極海洋細(xì)菌胞外多糖溶液在不同的溫度下的粘度變化曲線圖；
[0047]圖9、北極海洋細(xì)菌胞外多糖溶液在不同的pH下的粘度變化曲線圖；
[0048]圖10、北極海洋細(xì)菌胞外多糖溶液在不同的鹽及鹽濃度下的粘度變化曲線圖；
[0049]圖11、北極海洋細(xì)菌胞外多糖溶液的觸變性曲線圖；
[0050]圖12、北極海洋細(xì)菌胞外多糖的急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)中KM小鼠的體重變化曲線圖；
[0051]圖13、北極海洋細(xì)菌胞外多糖的急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)中KM小鼠的組織切片圖；
[0052]其中:圖Al和圖A2為心臟組織的切片圖(200 X )，圖BI和圖B2為腎臟組織的切片圖(200X )，圖Cl和圖C2為肝臟組織的切片圖(200X )、圖Dl和圖D2為脾臟組織的切片圖(400X )，圖Al，BI，Cl，Dl為對(duì)照組，圖A2，B2，C2，D2為實(shí)驗(yàn)組；
[0053]圖14、北極海洋細(xì)菌胞外多糖、透明質(zhì)酸、殼聚糖、海藻酸鈉和甘油的吸濕率曲線圖；
[0054]其中:圖A為在相對(duì)濕度43%條件下的吸濕率曲線圖，圖B為在相對(duì)濕度81%條件下的吸濕率曲線圖；
[0055]圖15、北極海洋細(xì)菌胞外多糖、透明質(zhì)酸、殼聚糖、海藻酸鈉和甘油保濕率的曲線圖。
[0056]圖16、北極海洋細(xì)菌胞外多糖、透明質(zhì)酸和維生素C對(duì)有機(jī)自由基DPPH.的清除作用的曲線圖；
[0057]圖17、北極海洋細(xì)菌胞外多糖、透明質(zhì)酸和維生素C對(duì)羥自由基的清除作用的曲線圖；[0058]圖18、北極海洋細(xì)菌胞外多糖、透明質(zhì)酸和維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0059]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
[0060]實(shí)施例中所述人工海水由購(gòu)自美國(guó)Sigma公司的海鹽按照產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)配制成鹽濃度為3wt%的人工海水；
[0061]復(fù)合蛋白酶購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司；
[0062]實(shí)施例中所述固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份:
[0063]蛋白胨1份，酵母粉0.5份、1.5份瓊脂，人工海水100份，pH為7.5~8.0 ;
[0064]液體種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量份:
[0065]蛋白胨1份，酵母粉0.5份，人工海水100份，pH為7.5~8.0 ;
[0066]發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量份:
[0067]蛋白胨0.943份，酵母粉0.5份，工業(yè)葡萄糖3.65份，人工海水100份，pH為7.5 ;
[0068]實(shí)施例1
[0069]一株北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株，該菌株于2013年9月21日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，菌種保藏號(hào):CCTCC M2013437。
[0070]提取該北極海洋細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行菌種鑒定。將其基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，與北極海洋細(xì)菌相似性較高的菌株有Polaribacter sejongensisK0PRI21160T (相似度:99.13%)，Polaribacter butkevichii KMM3938T (相似度:98.67%)和Polaribacter irgensii23_PT (相似度:97.43%)。因此，北極海洋細(xì)菌屬于極桿菌屬(Polaribacter)。
[0071]實(shí)施例2
[0072]實(shí)施例1所述北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sejongensis sp.) SMl 127菌株在制備北極海洋細(xì)菌胞外多糖中的應(yīng)用，步驟如下:[0073](I)將北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sejongensis sp.)SM1127菌株劃線接種于固體培養(yǎng)基中，在20°C條件下活化培養(yǎng)2天，然后接種于IOOmL液體種子培養(yǎng)基中，在20°C、200rpm的條件下震蕩培養(yǎng)I天，然后按2% (v/v)的接種量接種于5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，在
11.3°C、溶解氧飽和度30~100%的條件下，連續(xù)培養(yǎng)8天，培養(yǎng)過(guò)程中控制pH為7.5，并在培養(yǎng)的第3天、第4天和第5天分別補(bǔ)加由工業(yè)葡萄糖和人工海水配制的濃度為625g/L的工業(yè)葡萄糖溶液200mL、200mL和IOOmL,制得發(fā)酵液；
[0074](2)向步驟(1)制得發(fā)酵液中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，在4°C條件下醇沉30min，8000rpm離心10min，取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、-53°C真空凍干72h ;凍干的多糖溶于水中，配成濃度為0.02g/mL的溶液；加入復(fù)合蛋白酶使溶液中復(fù)合蛋白酶的濃度為12U/mL，在50°C>120rpm的條件下，酶解5h ;再加入2倍體積的無(wú)水乙醇，在4?條件下醇沉30min,8000rpm離心10min，取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、_53°C真空凍干72h，制得北極海洋細(xì)菌胞外多糖粗品；
[0075](3)將步驟(2)制備的北極細(xì)菌胞外多糖粗品用蒸餾水溶解，配成濃度為lmg/mL的溶液，上清液加入DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱(柱型16mmX250mm),蒸餾水沖洗，O~0.7M NaCl溶液梯度洗脫，流速36mL/h ;用自動(dòng)分部收集器收集液體，每管3mL，苯酚一硫酸法測(cè)定每管溶液的總糖含量，收集含有多糖的洗脫液，透析，-53°C真空凍干;
[0076]然后溶解于蒸懼水中，配成濃度為20mg/mL的溶液,用Sepharose4B凝膠柱(柱型16mmX950mm)層析，以蒸懼水洗脫，流速15mL/h,洗脫液以每管5mL收集,苯酹-硫酸法檢測(cè)每管溶液的總糖含量，收集有糖的溶液，透析，_53°C真空凍干；重復(fù)Sephar0Se4B凝膠柱層析的操作一次，制得北極海洋細(xì)菌胞外多糖。
[0077]結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過(guò)陰離子交換后，得到2個(gè)洗脫峰，對(duì)第二個(gè)峰的多糖進(jìn)行收集，經(jīng)過(guò)兩次凝膠過(guò)濾層析，得到圖3所示的對(duì)稱單峰，對(duì)此峰的多糖進(jìn)行收集，得到北極海洋細(xì)菌胞外多糖的純品。
[0078]實(shí)施例3
[0079]實(shí)施例1所述北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.) SMl 127菌株在制備北極海洋細(xì)菌胞外多糖中的應(yīng)用，步驟如下:
[0080](I)將北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株劃線接種于固體培養(yǎng)基中，在15°C條件下活化培養(yǎng)3天，然后接種于IOOmL液體種子培養(yǎng)基中，在15°C、200rpm的條件下震蕩培養(yǎng)2天，然后按3% (v/v)的接種量接種于5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，在15°C、溶解氧飽和度60~80%的條件下，連續(xù)培養(yǎng)6天，培養(yǎng)過(guò)程中控制pH為8.0，并在培養(yǎng)的第3天、第4天和第5天分別補(bǔ)加由工業(yè)葡萄糖和人工海水配制的濃度為625g/L的工業(yè)葡萄糖溶液200mL、200mL和IOOmL,制得發(fā)酵液；
[0081] (2)向步驟(1)制得發(fā)酵液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇，在6°C條件下醇沉40min，8000rpm離心10min，取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、-60°C真空凍干72h ;凍干的多糖溶于水中，配成濃度為0.03g/mL的溶液；加入復(fù)合蛋白酶使溶液中復(fù)合蛋白酶的濃度為15U/mL，在45°C、150rpm的條件下，酶解6h ;再加入3倍體積的無(wú)水乙醇,在6°C條件下醇沉40min,8000rpm離心10min，取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌、_60°C真空凍干72h，制得北極海洋細(xì)菌胞外多糖粗品；[0082](3)將步驟(2)制備的北極細(xì)菌胞外多糖粗品用蒸餾水溶解，配成濃度為2mg/mL的溶液，上清液加入DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱(柱型16mmX250mm),蒸餾水沖洗，O~0.7M NaCl溶液梯度洗脫，流速36mL/h ;用自動(dòng)分部收集器收集液體，每管3mL，苯酚一硫酸法測(cè)定每管溶液的總糖含量，收集含有多糖的洗脫液，透析，-60°C真空凍干;
[0083]然后溶解于蒸懼水中，配成濃度為20mg/mL的溶液,用Sepharose4B凝膠柱(柱型16mmX950mm)層析，以蒸懼水洗脫，流速15mL/h,洗脫液以每管5mL收集,苯酹-硫酸法檢測(cè)每管溶液的總糖含量，收集有糖的溶液，透析，_60°C真空凍干；重復(fù)Sephar0Se4B凝膠柱層析的操作一次，制得北極海洋細(xì)菌胞外多糖。
[0084]實(shí)施例4
[0085]北極海洋細(xì)菌胞外多糖的糖基組成和糖苷鍵鏈接方式分析，具體方法如下:
[0086]取實(shí)施例1或?qū)嵤├?制得的北極海洋細(xì)菌胞外多糖500 μ g與20 μ g的肌糖混合，溶于400yL的2M三氟乙酸中，120°C水解Ih后，凍干；加入含有IM HCl的甲醇溶液中，80°C處理16h ;然后在甲醇中用吡啶和乙酸酐重新對(duì)多糖樣品進(jìn)行N-乙酰化；然后用Tr1-sil (購(gòu)自美國(guó)Pierce公司)在80°C處理0.5h，再用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)分析其糖基組成，其中氣相色譜(7890A，購(gòu)自美國(guó)Agilent公司)連接到質(zhì)量選擇檢測(cè)器(5975C，購(gòu)自美國(guó)Agilent公司)，分離毛細(xì)管用EC-1石英毛細(xì)管(30mX0.25mm，購(gòu)自美國(guó)Supelco 公司)；
[0087]取實(shí)施例2或?qū)嵤├?制得的北極海洋細(xì)菌胞外多糖2mg加入200 μ L 二甲基亞砜中，并用通入氮?dú)饬骰旌?h，然后加入CH3I混合，過(guò)夜；然后通過(guò)一個(gè)C18的層析柱，凍干；然后在四氫呋喃溶液中用重鋰分解，中和電荷，脫水；在干的二甲亞砜中用NaOH和CH3I做甲基化處理，2M三氟乙酸121°C處理2h水解，用NaBD4還原并用乙酸酐/三氟乙酸乙?；?。生成的部分甲基化的糖醛醋酸鹽用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)分析其糖苷鍵連接方式，其中氣相色譜(7890A,購(gòu)自美國(guó)Hewlett Packard公司)連接到質(zhì)量選擇檢測(cè)器(5975C，購(gòu)自美國(guó)Hewlett Packard公司)，分離毛細(xì)管用2380石英毛細(xì)管(30mX0.25mm,購(gòu)自美國(guó)Supelco公司)；
[0088]取實(shí)施例2或?qū)嵤├?制得的北極海洋細(xì)菌胞外多糖100 μ g溶于蒸餾水中，同分子量分別為1189kDa，759kDa，511kDa，167kDa的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖進(jìn)行TSK Gel G5000PW的尺寸排阻色譜層析(柱型7.5mmX300mm,購(gòu)自日本Tosoh Biosciences公司)，以ρΗ5.5的50mM醋酸銨溶液洗脫，以ELS檢測(cè)器(購(gòu)自美國(guó)Agilent公司)檢測(cè)洗脫液成分，根據(jù)多糖樣品的出峰時(shí)間來(lái)分析其分子量大小。
[0089]經(jīng)GC/MS分析后，根據(jù)多糖的糖基組成圖譜(圖4)和糖苷鍵連接方式圖譜(圖5)，得到多糖的糖基組成(表1)和糖苷鍵連接方式(表2)；
[0090]表1
[0091]
【權(quán)利要求】
1.一株北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株，該菌株于2013年9月21日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，菌種保藏號(hào):CCTCCM2013437。
2.權(quán)利要求1所述北極海洋細(xì)菌(Polaribactersp.)SMl 127菌株在制備北極海洋細(xì)菌胞外多糖中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng) 用，其特征在于，步驟如下: (1)將活化后的北極海洋細(xì)菌(Polaribactersp.)SM1127菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中，在15~20°C條件下震蕩培養(yǎng)I~2天，然后按2~3% (體積百分比)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10~15°C、溶解氧飽和度高于30%、培養(yǎng)過(guò)程中pH控制在7.5~8.0的條件下，培養(yǎng)6~9天，在培養(yǎng)期間補(bǔ)加工業(yè)葡萄糖溶液，制得發(fā)酵液； (2)向步驟(1)制得的發(fā)酵液中加入1.5~3倍體積的無(wú)水乙醇，經(jīng)醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌，經(jīng)干燥后，溶于水中配制濃度為0.02~0.03g/mL的溶液；然后，加入復(fù)合蛋白酶使溶液中復(fù)合蛋白酶的濃度為10~15U/mL，在45~50°C、120~150rpm的條件下，酶解5~6h ;再加入1.5~3倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，分離取沉淀，無(wú)水乙醇洗滌，經(jīng)干燥，制得北極海洋細(xì)菌胞外多糖粗品； (3)將步驟(2)制得的北極海洋細(xì)菌胞外多糖粗品溶于蒸餾水中，制得濃度為0.5~2mg/mL的溶液，然后經(jīng)離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析純化，干燥，制得北極海洋細(xì)菌胞外多糖。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)中活化后的北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.)SM1127 菌株是將北極海洋細(xì)菌(Polaribacter sp.)SM1127 菌株在溫度為15~20°C條件下，在固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)2~3天后制得的。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份: 蛋白胨0.8~1.0份，酵母粉0.5~0.75份、瓊脂1.0~1.5份，人工海水100份，pH為 7.5 ~8.0。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)中的液體種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量份: 蛋白胨0.8~1.0份，酵母粉0.5~0.75份，人工海水100份，pH為7.5~8.0 ; 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量份: 蛋白胨0.943份，酵母粉0.5份，工業(yè)葡萄糖3.65份，人工海水100份，pH為7.5 ; 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的工業(yè)葡萄糖溶液為由人工海水和工業(yè)葡萄糖配制的濃度625g/L的溶液。
7.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)中的補(bǔ)加工業(yè)葡萄糖溶液的次數(shù)為三次，補(bǔ)加時(shí)間為培養(yǎng)的第3天、第4天和第5天，補(bǔ)加的體積分別為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的 4%、4% 和 2% ο
8.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(2)和步驟(3)中的醇沉，溫度為3~6°C，時(shí)間為20~40min ； 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)和步驟(3)中的干燥為真空凍干，溫度為-50 ~-60 °C ； 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中的離子交換層析次數(shù)為一次，層析柱規(guī)格:16mmX 250mm,凝膠類型:DEAE-Sepharose Fast Flow, 0 ~0.7M NaCl 溶液梯度洗脫，流速 36mL/h ； 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中凝膠過(guò)濾層析次數(shù)為二次，層析柱規(guī)格:16_X950mm,凝膠類型:Sepharose4B,以蒸懼水洗脫,流速15mL/h。
9.由權(quán)利要求3制備的北極海洋細(xì)菌胞外多糖，其特征在于，分子量為220kDa，其組分如下，均為摩爾百分比: N-乙酰己糖胺28%、甘露糖23.4%、葡萄糖醛酸21.4%、半乳糖17.4%、海藻糖7.4%、葡萄糖1.6%、鼠李糖0.8%。
10.如權(quán)利要求9所述的北極海洋細(xì)菌胞外多糖，其特征在于，糖苷鍵連接方式如下，均為摩爾百分比: 4-連接的葡萄糖醛酸殘基13.2%、2_連接的半乳糖殘基13.0%、末端半乳糖殘基11.5%、4_連接的葡萄糖殘基.10.2 %、末端海藻糖殘基9.2%、2，3-連接的甘露糖殘基.8.5%,4-連接的海藻糖殘基7.9%、3-連接的半乳糖殘基7.9%、4-連接的N-乙酰己糖胺殘基6.5%、末端甘露糖殘基5.6%、末端N-乙酰己糖胺殘基2.9%>3-連接的甘露糖殘基.1.8%、末端葡萄糖殘基1.0%A, 6-連接的甘露糖殘基0.6%、2_連接的。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103937707SQ201410108720
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】張玉忠, 孫美玲, 陳秀蘭, 石梅, 張熙穎, 宋曉妍, 解彬彬, 蘇海楠, 秦啟龍, 周百成 申請(qǐng)人:山東大學(xué)