黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記及其專用引物和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記及其專用引物和應(yīng)用。該分子標(biāo)記，是用以下引物對(duì)自黃瓜總DNA中擴(kuò)增出來的核苷酸序列之一：序列表中SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2、序列表中SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4。上述分子標(biāo)記可鑒定目的基因黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的存在，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗病植株的間接選擇，由于不受其他基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，可用于早代選擇，縮短育種年限，提高育種效率。
【專利說明】黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記及其專用引物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的分子標(biāo)記，特別涉及與黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4連鎖的分子標(biāo)記及其在黃瓜種質(zhì)資源選擇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黃瓜(Cucumis Sativus.L)在世界上廣泛栽培，中國(guó)是世界上黃瓜栽培面積最大、
總產(chǎn)量最高的國(guó)家。
[0003]黃瓜枯萎病(Fusarium Wilt)，又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，由尖孢鐮刀菌黃瓜?；?Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen.)侵染所致，是一種由土壤傳染，從根或根頸部侵入，在維管束內(nèi)寄生的系統(tǒng)性病害(導(dǎo)管型枯萎病)，是黃瓜生產(chǎn)上較難防治的三大病害之一，是目前世界各地黃瓜，特別是溫室和其他保護(hù)地黃瓜的主要土傳病害，一般年份可使黃瓜產(chǎn)量損失25%-35%，嚴(yán)重發(fā)病時(shí)可使黃瓜絕產(chǎn)?？菸〔捎没瘜W(xué)防治效果不理想，不僅使生產(chǎn)投入增加且會(huì)造成環(huán)境安全隱患，倒茬嫁接雖常用于防控但增添技術(shù)困難和勞動(dòng)成本。因此選育抗病品種是解決枯萎病危害的最佳途徑。
[0004]黃瓜枯萎病抗病基因影響黃瓜對(duì)枯萎病的抗性，它的研究將會(huì)推動(dòng)抗病育種進(jìn)程。用與目的性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇在黃瓜遺傳育種中十分有效，分子標(biāo)記是在DNA水平上對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，具有高效、快速、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點(diǎn)，可在苗期進(jìn)行選擇，加快育種進(jìn)程。因此，開發(fā)用于輔助鑒定黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的`目的在于提供一種黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記及其專用引物和應(yīng)用。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0007]—種黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記，是用以下引物自黃瓜總DNA中擴(kuò)增出來的核苷酸序列之一:序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2、序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4。
[0008]獲得上述黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記的引物如下:1)獲得黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記FWSNPl的引物為序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2 ;2)獲得黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記FWSNP2的引物為序列表中SEQ ID NO: 3和SEQID N0:4。
[0009]利用上述引物對(duì)，通過常規(guī)PCR法可得到上述分子標(biāo)記。
[0010]本發(fā)明涉及的與黃瓜抗枯萎病共分離的dCAPs標(biāo)記FWSNP1，是利用抗/感遺傳群體(母本:WF2757，抗枯萎?。桓副?津研二號(hào)，感枯萎病)進(jìn)行精細(xì)定位和克隆獲得的。通過利用90個(gè)RIL-F8株系，130株的F2:3群體對(duì)枯萎病抗病基因Foc_4進(jìn)行初步定位，然后利用2000株的F2群體對(duì)Foc-4進(jìn)行精細(xì)定位到25kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間內(nèi)含2個(gè)基因，分別是TIR NB-ARC抗病基因和bHLH96-like轉(zhuǎn)錄因子，其中TIR NB-ARC基因經(jīng)過驗(yàn)證分析，被證實(shí)為枯萎病抗病基因Foc-4的重要候選基因。通過對(duì)比研究Foc-4基因在抗/感黃瓜材料中的序列差異，發(fā)現(xiàn)一個(gè) SNP 位點(diǎn)，依據(jù) http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html,在線設(shè)計(jì)軟件，開發(fā)設(shè)計(jì)了與抗/感枯萎病緊密連鎖的dCAPs分子標(biāo)記FWSNP1。同時(shí)利用FffSNPl標(biāo)記分析2000多株遺傳群體材料，結(jié)合田間枯萎病接種鑒定研究，發(fā)現(xiàn)FWSNPl標(biāo)記與抗感枯萎病緊密連鎖，達(dá)到共分離。
[0011]本發(fā)明涉及的另一個(gè)黃瓜抗枯萎病SNP2關(guān)鍵位點(diǎn)，其在抗病基因Foc-4中導(dǎo)致了氨基酸編碼的變化。該SNP位點(diǎn)是通過對(duì)不同遺傳背景的黃瓜枯萎病抗感材料進(jìn)行基因組重測(cè)序獲得的,通過對(duì)多個(gè)黃瓜抗感材料進(jìn)行重測(cè)序,利用BWA-Samtools (v0.1.12a,mpileup按照默認(rèn)參數(shù))軟件分析Foc_4基因在不同材料中的SNP位點(diǎn)，結(jié)合黃瓜基因組9930-V2和基因組注釋，發(fā)現(xiàn)Foc-4基因的915位存在單堿基差異SNP2位點(diǎn)(由A到C)，導(dǎo)致了 Foc-4基因中編碼氨基酸的差異(從Ile到Leu)。并利用該SNP2位點(diǎn)設(shè)計(jì)標(biāo)記，獲得FWSNP2分子標(biāo)記，通過分析上述黃瓜材料的基因型，結(jié)合田間枯萎病接種鑒定材料抗感病表型，發(fā)現(xiàn)FWSNP2標(biāo)記分析的基因型與抗感表型一致，證明FWSNP2可作為枯萎病緊密連鎖分子標(biāo)記，篩選黃瓜材料。
[0012]上述分子標(biāo)記或引物在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應(yīng)用。
[0013]在上述應(yīng)用中，優(yōu)選地，所述分子標(biāo)記FWSNPl在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應(yīng)用的具體方法為:以待測(cè)黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQ ID NO:1和序列表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸組成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用SalI內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物酶切，如果得到164bp的酶切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為抗病材料；如果得到134bp的酶切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為感病材料；更優(yōu)選地，所述待測(cè)黃瓜材料為WF2757、M21或者COUNTYFAIR Fl，或者以WF2757、M21和/或COUNTY FAIR Fl作為親本得到的子代；
[0014]在上述應(yīng)用中，優(yōu)選地，所述分子標(biāo)記FWSNP2在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應(yīng)用的具體方法為:以待測(cè)黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQ ID NO: 3和序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸組成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用MaeII內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物酶切，如果得到165bp的酶切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為抗病材料；如果得到135bp的酶切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為感病材料；更優(yōu)選地，所述待測(cè)黃瓜材料為VICTORY或者DIHUANGGUA,或者以VICTORY和/或者DI HUANGGUA作為親本得到的子代。
[0015]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0016]本發(fā)明的dCAPs標(biāo)記FWSNPl和FWSNP2與黃瓜枯萎病抗病存在緊密連鎖關(guān)系(共分離)，可鑒定目的基因黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的存在，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗病植株的間接選擇，由于不受其他基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，可用于早代選擇，縮短育種年限，提高育種效率，為進(jìn)行黃瓜枯萎病抗病育種提供技術(shù)支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4定位連鎖圖譜，其中左圖黃瓜枯萎病基因初定位不意圖，中圖為枯委病抗病基因精細(xì)定位不意圖，右圖為25kb區(qū)間范圍內(nèi)基因分布情況及基因注釋；[0018]圖2是Foc-4基因FWSNPl分子標(biāo)記在某一群體中酶切驗(yàn)證結(jié)果示意圖；
[0019]圖3是Foc-4基因FWSNP2分子標(biāo)記在某一群體中酶切驗(yàn)證結(jié)果示意圖；
[0020]圖4是Foc-4基因FWSNPl分子標(biāo)記在另一群體中的酶切鑒定結(jié)果示意圖；
[0021]圖5是Foc-4基因FWSNP2分子標(biāo)記在另一群體中的酶切結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于此。
[0023]實(shí)施例1黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的獲得
[0024]一、黃瓜枯萎病生理小種4的抗病基因Foc-4初步定位和精細(xì)定位
[0025]具體的定位方法包括以下步驟:
[0026]A、黃瓜枯萎病抗病基因定位研究親本及遺傳群體:
[0027]分別選擇WF2757 (父本)和津研二號(hào)(母本)為抗感親本，構(gòu)建90個(gè)RIL-F8株系，130株的F2:3群體和超過2000株的F2大群體。其中，父本W(wǎng)F2757和母本津研二號(hào)購(gòu)自北京市農(nóng)作物種質(zhì)資源庫(kù)。
[0028]B、黃瓜枯萎病抗病基因定位研究病情指數(shù)調(diào)查:
[0029]將親本及各群體的種子用紗布包裹，溫湯浸種，28°C恒溫催芽后播于50孔穴盤中，在空調(diào)溫室育苗，育苗基質(zhì)為滅菌的珍珠巖或營(yíng)養(yǎng)土。
[0030]供試菌種黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum Owen.)生理小種4號(hào)是根據(jù)黃仲生等的中國(guó)黃瓜枯萎病菌生理小種鑒定及防治文獻(xiàn)(中國(guó)黃瓜枯萎病菌生理小種鑒定及防治，華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1994，9 (4):81-86)中記載的方法分離獲得的。采用翁祖信等(黃瓜枯萎病抗病性鑒定方法研究一胚根接種法，中國(guó)蔬菜，1985年02期)的方法制備黃瓜枯萎病菌液，血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度。采用浸根接種法:當(dāng)黃瓜幼苗子葉展平時(shí)，拔出幼苗，用水洗凈根部，在I X IO6~5 X IO6個(gè)孢子/mL的接種液中浸根，然后栽入裝有滅菌營(yíng)養(yǎng)土的塑料營(yíng)養(yǎng)缽(規(guī)格6.5cmX 6.5cm)中，在溫室中培養(yǎng)。白天維持在24~28°C，夜間在16~20°C。3次重復(fù)，每次重復(fù)30株。
[0031]按上述方法接種后7~IOd進(jìn)行病情調(diào)查。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為:0級(jí):無癥狀；1級(jí):I片子葉黃化；2級(jí):2片子葉黃化或萎蔫；3級(jí):1片真葉輕度萎蔫；4級(jí):1~2片真葉明顯萎蔫；5級(jí):全株嚴(yán)重萎蔫或枯死。其中2以下為抗病，3以上為感病類型。
[0032]對(duì)親本及各群體的病情進(jìn)行精確統(tǒng)計(jì)。
[0033]C、黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的初步定位:
[0034]利用 Cavagnaro 等(Genome-wide characterization of simple sequencerepeats in cucumber, BMC Genomics, 2010)發(fā)表的黃瓜高密度遺傳圖引物信息,結(jié)合90個(gè)RIL-F8株系和130株的F2:3群體病情指數(shù)的精確統(tǒng)計(jì)，對(duì)親本和RIL群體進(jìn)行分子標(biāo)記分析，編碼采集親本及RILs群體各單株基因型數(shù)據(jù)。母本基因型記為A，父本的基因型記為B，F(xiàn)1雜合基因型記為H，模糊或缺失數(shù)據(jù)記為U。用x2test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比例適合性檢驗(yàn)分析，采用JoinMap4.0軟件(Staml993 ；Van 0oijen2001)構(gòu)建連鎖圖譜(參見圖1)，設(shè)置軟件LOD閥值為4.0以及選取Kosambi公式(Kosambi 1944)，將黃瓜抗枯萎病基因初步定位在2號(hào)染色體的分子標(biāo)記UW017820 和UW084909之間的160kb區(qū)間內(nèi)(參見圖1)，根據(jù)Li等(RNA-Seq improves annotation of protein-coding genes in the cucumber genome, BMCgenomics, 2011)對(duì)黃瓜基因組的注釋并通過Softberry在線軟件進(jìn)行預(yù)測(cè),該區(qū)間存在一個(gè)由多個(gè)NBS-LRR抗病基因組成的NBS-LRR串聯(lián)抗病基因(NBS-LRR為抗病基因保守結(jié)構(gòu)域)，難以預(yù)測(cè)和選擇候選基因，所以需要進(jìn)一步擴(kuò)大群體進(jìn)行精細(xì)定位研究。
[0035]D、黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的精細(xì)定位:
[0036]經(jīng)過構(gòu)建超過2000株的F2大群體繼續(xù)對(duì)抗枯萎病基因進(jìn)行精細(xì)定位，同時(shí),本實(shí)驗(yàn)室對(duì)所用抗感親本進(jìn)行了基因組重測(cè)序，經(jīng)過生物信息比對(duì)分析，在雙親間開發(fā)了 79560個(gè)Indel和108727個(gè)SNP分子標(biāo)記，在初定位區(qū)間的160kb范圍內(nèi)選擇設(shè)計(jì)了 14對(duì)Indel分子標(biāo)記(參見表1)進(jìn)行群體分析，經(jīng)過驗(yàn)證后利用這14對(duì)Indel標(biāo)記對(duì)抗枯萎病基因進(jìn)行了精細(xì)定位研究，其中引物的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，同樣利用JoinMap4.0軟件進(jìn)行遺傳連鎖作圖分析，最終在2000株的F2大群體將抗枯萎病基因精細(xì)定位到分子標(biāo)記UW017805和Indel2027634的25kb的范圍內(nèi)，在精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)近2300株的試驗(yàn)材料中存在I個(gè)交換單株。
[0037]采用上述14對(duì)Indel分子標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位時(shí)的各PCR反應(yīng)體系(10 μ L)如下:25ng 模板DNA，0.5μΜ上游引物，0.5μΜ 下游引物，0.2mM 的 dNTP mix ；0.5U Taq DNA 聚合酶，IXPCR Buffer (Fermentas) 2 μ L，ddH20 補(bǔ)足到 10 μ L。
[0038]PCR 反應(yīng)程序?yàn)?階段 1:95 V 預(yù)變性 3min ;階段 2:94 V 30s, 60 V lmin，72°C lmin，退火溫度每個(gè)循環(huán)降1°C，共8個(gè)循環(huán)；階段3 -MV 30s, 53°C 30s, 72°C lmin,共32個(gè)循環(huán)；階段4:72 °C延伸5min ;階段5:4 °C保存；其中，PCR儀為購(gòu)自Appl iedBiosystems 公司的 Veriti96well Thermal Cycler。
[0039]表1用于精細(xì)定位的14對(duì)Indel分子標(biāo)記引物信息
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記，是用以下引物自黃瓜總DNA中擴(kuò)增出來的核苷酸序列之一:序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2、序列表中SEQ ID N0:3和SEQID N0:4。
2.獲得權(quán)利要求1所述黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記的引物如下:1)獲得黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記FWSNPl的引物為序列表中SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2 ；2)獲得黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標(biāo)記FWSNP2的引物為序列表中SEQ IDNO:3 和 SEQ ID NO:4。
3.權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記或權(quán)利要求2所述引物在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述分子標(biāo)記FWSNPl在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應(yīng)用的具體方法為:以待測(cè)黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQID NO:1和序列表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸組成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用SalI內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物酶切，如果得到164bp的酶切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為抗病材料；如果得到134bp的酶切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為感病材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述待測(cè)黃瓜材料為WF2757、M21或者COUNTY FAIR F1，或者以WF2757、M21和/或COUNTY FAIR Fl作為親本得到的子代。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述分子標(biāo)記FWSNP2在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應(yīng)用的具體方法為:以待測(cè)黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQID N0:3和序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸組成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用MaeII內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn) 物酶切，如果得到165bp的酶切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為抗病材料；如果得到135bp的酶切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為感病材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所 述的的應(yīng)用，其特征在于，所述待測(cè)黃瓜材料為VICTORY或者DIHUANGGUA,或者以VICTORY和/或者DI HUANGGUA作為親本得到的子代。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882017SQ201410115373
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】溫常龍, 毛愛軍, 董從娟, 張海英, 王永勤, 王永健, 于拴倉(cāng), 許勇 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院