一種贛州慢生根瘤菌及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種贛州慢生根瘤菌及其用途。贛州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium?ganzhouense?sp.nov.）RITF806于2014年2月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M2014044。本發(fā)明是從黑木相思根瘤中分離篩選出的贛州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium?ganzhouense?sp.nov.），該類菌株能與黑木相思（Acacia?melanoxylon）、網(wǎng)脈相思（Acacia?aneura）和灰木相思（Acacia?implexa）等結(jié)瘤共生，具有強(qiáng)的抗逆性，在固氮微生物菌劑和生物有機(jī)肥生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種贛州慢生根瘤菌及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種贛州慢生根瘤菌及其用途。
【背景技術(shù)】:
[0002]大氣中含有78%的氮?dú)猓瑒?dòng)植物不能直接利用，自然界只有部分原核微生物具有直接利用大氣中氮?dú)獾哪芰Γ瑢⑵溥€原成氨，這就是固氮作用。世界上的人口、資源、環(huán)境已成為當(dāng)今全球性的問題，被稱為“綠色革命”的生物固氮日益受到重視，尤其在林業(yè)上的應(yīng)用。由于林業(yè)具有生產(chǎn)周期長，立地條件復(fù)雜等特點(diǎn)，使林業(yè)的施肥并不像農(nóng)業(yè)那樣的方便、有效。因此，生物固氮成為林木所需氮素的重要來源。
[0003]一些發(fā)達(dá)國家的林業(yè)生產(chǎn)中，相當(dāng)程度上依賴生物固氮的貢獻(xiàn)，重視固氮微生物資源的開發(fā)與利用。由于物價(jià)的上漲、保護(hù)環(huán)境意識(shí)的提高，生物制劑以其物美價(jià)廉、環(huán)保而獨(dú)受青睞。世界上許多國家都把研究和開發(fā)微生物肥料及制品作為一項(xiàng)長遠(yuǎn)的計(jì)劃。
[0004]相思樹種(Acacia)是我國引種的重要速生樹種，它不僅速生而且適應(yīng)性廣，耐干旱痔薄，速生豐產(chǎn)，能產(chǎn)生根瘤，有固氮作用，具有良好的改良土壤性能，從其引進(jìn)試種到目前的規(guī)?；N植，已在林業(yè)產(chǎn)業(yè)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)中發(fā)揮了重大作用。針對(duì)研究的進(jìn)展和林業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用需要，選擇合適的根瘤菌微生物肥料，減少化學(xué)肥料的施放，可實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益及生態(tài)效能的雙贏，并能帶動(dòng)林業(yè)技術(shù)進(jìn)步。
[0005]菌種是微生物肥料生產(chǎn)應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前限制我國微生物肥料行業(yè)發(fā)展的瓶頸是優(yōu)良菌株的選育問題。林 業(yè)生產(chǎn)迫切需求固氮能力強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)的微生物肥料生產(chǎn)用菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006]本發(fā)明的目的是提供一種高效固氮結(jié)瘤的，能與黑木相思、網(wǎng)脈相思和灰木相思共生結(jié)瘤的新菌種一籍州慢生根瘤菌(Bradyrhizobium ganzhouense sp.nov.) RITF806,該菌于2014年2月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2014044o
[0007]本發(fā)明還提供了籍州慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumganzhouense sp.nov.)RITF806在制備固氮微生物菌劑和生物有機(jī)肥中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明是從黑木相思根瘤中分離篩選出的贛州慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumganzhouense sp.nov.)，該類菌株能與黑木相思(Acacia melanoxylon)、網(wǎng)脈相思(Acaciaaneura)和灰木相思(Acacia implexa)等結(jié)瘤共生,具有強(qiáng)的抗逆性,在固氮微生物菌劑和生物有機(jī)肥生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0009]本發(fā)明的籍州慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumganzhouense)RITF806 于 2014 年 2月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2014044。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0010]圖1是贛州慢生根瘤菌的16S rRNA與參比菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹[0011]圖2是采用最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，其是以贛州慢生根瘤菌和慢生根瘤菌屬內(nèi)較相近種群的持家基因recA(355nt)，glnll(497nt)和atpD(391nt)的序列拼接構(gòu)建的。
[0012]圖3是慢生根瘤菌屬代表菌株極性酯的組成，1:贛州慢生根瘤菌RITF806菌株；4:Bradyrhizobium huanghuaihaiense CCBAU23303T 菌株
[0013]圖4是黑木相思幼苗接種贛州慢生根瘤菌RITF806 ；
[0014]圖5是贛州慢生根瘤菌RITF806的透射電鏡照片。
【具體實(shí)施方式】:
[0015]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0016]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0017]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]YMA 培養(yǎng)基:甘露醇 10.0g，谷氨酸鈉 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4.7Η200.2g，NaCl0.01g，酵母粉0.5g，瓊脂粉17g，蒸餾水1000mL, ρΗ7.0。滅菌備用。
[0019]Jensen’ s 無氮營養(yǎng)液:K2HP040.05g, NaCl0.05g, MgSO4.7Η200.05g, CaHPO40.25g,FeCl30.05g, ImL 微量元素溶液(Η3Β032.86g/L, MnSO4.Η202.08g/L, ZnSO4.7Η200.022g/L,CuSO4.7Η200.08g/L , NaMoO40.llg/L)，蒸餾水 1000mL0 滅菌備用。
[0020]實(shí)施例1:贛州慢生根瘤菌RITF806、RITF807、RITF211的分離與鑒定
[0021]一、根瘤菌的分離
[0022]菌株分離自江西省贛州12年生黑木相思的根瘤。根瘤用自來水沖洗干凈表面泥沙，于95%酒精浸泡15-30秒后，放入0.1%升汞溶液中表面消毒3-5分鐘，無菌水沖洗7-8次。將經(jīng)表面消毒后的根瘤放在兩片無菌載玻片之間，用力擠壓使根瘤破碎，用無菌接種針沾取根瘤液在YMA平板上劃線，28~30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，挑取典型菌落純化及鑒定。由此純化得到根瘤菌RITF806、RITF807和RITF211。
[0023]二、根瘤菌的鑒定
[0024]從以下幾個(gè)方面鑒定根瘤菌RITF806、RITF807和RITF211:
[0025]1、形態(tài)學(xué)鑒定
[0026]將上述步驟一分離并純化的根瘤菌RITF806、RITF807及RITF211培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，且菌落大小穩(wěn)定時(shí)，進(jìn)行單菌落狀態(tài)描述，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、濕潤度、菌落表面狀態(tài)、菌落邊緣狀態(tài)。
[0027]對(duì)于處于對(duì)數(shù)生長期的所述根瘤菌，經(jīng)涂片染色后采用光學(xué)顯微鏡觀察菌體的形態(tài)。
[0028]結(jié)果表明，上述步驟一分離純化的3株根瘤菌RITF806、RITF807及RITF211為革蘭氏陰性菌，菌落圓形凸起，乳白色，半透明，表面光滑，邊緣整齊；菌體桿狀，1.29~
3.32X0.50~0.60 μ m，無芽孢。其透射電鏡照片如圖5所示。
[0029]2、生理生化特征分析
[0030]參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè).北京:科學(xué)出版社，2011.)和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第三版).北京:高等教育出版社，1999)測定上述根瘤菌的生理生化特征。[0031]所述根瘤菌的生理生化特征測定結(jié)果如下:
[0032]根瘤菌RITF211、RITF806、RITF807的菌落黏稠，邊緣整齊；在BTB培養(yǎng)基上產(chǎn)堿；與石蕊牛奶反應(yīng)產(chǎn)堿；菌株能利用吐溫80、D-果糖、a -D-葡萄糖、D-甘露醇、β -甲基-D-葡萄糖苷、松二糖、甲基丙酮酸、檸檬酸、D-半乳糖醛酸、D，L-乳酸作為唯一碳源；能在葡糖醛酰胺、羥基-L-脯氨酸作為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長；能在以下抗生素濃度(μ g/ml)的培養(yǎng)基上生長:氨芐青霉素5~300、氯霉素5~300、紅霉素5~100、硫酸新霉素5~300、鹽酸四環(huán)素5 ;能在含有1%以下染料的YMA培養(yǎng)基上生長:鹽酸吖啶、脫氧膽酸鈉、剛果紅、藻紅、溴百里酚藍(lán)、龍膽紫、中性紅、亞硝酸鈉；過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原反應(yīng)陽性；L-苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、3-酮基乳糖試驗(yàn)、耐爾藍(lán)還原反應(yīng)、亞甲藍(lán)還原反應(yīng)陰性；不能在肉湯培養(yǎng)基上生長。
[0033]3、16S rRNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析
[0034]常規(guī)方法培養(yǎng)根瘤菌RITF806、RITF807和RITF211，提取菌株的總DNA作為基因擴(kuò)增模板，以細(xì)菌 16S rRNA 通用引物，27F:5’ — AGAGTTTGATCCTGGCTCAG — 3M492R:5’ —TACGGTTACCTTGTTACGACTT 一 3’進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系采用上海生物工程有限公司PCR擴(kuò)增試劑盒。反應(yīng)程序?yàn)?95°C變性Imin,56.7V lmin、72°C延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán)。DNA測序由英濰捷基(上海)生物技術(shù)公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAMAN軟件完成，序列比對(duì)通過美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫在線完成。
[0035]根瘤菌RITF806 (SEQ ID N0.1)、RITF807 (SEQ ID N0.2)和 RITF211 (SEQ IDN0.3)的 16S rRNA序列分別如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。用 16S rRNA基因的鄰接法建樹(1250nt)的系 統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),顯示了 Bradyrhizobium ganzhouensesp.nov.RITF806和其他慢生根瘤菌種群之間的親屬關(guān)系。根瘤菌RITF806、RITF807、RITF211菌株的3個(gè)蛋白質(zhì)編碼持家基因recA、glnll、atpD系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。根瘤菌RITF806、RITF807、RITF211菌株與其它慢生根瘤菌之間的16S rRNA和3個(gè)蛋白質(zhì)編碼持家基因的相似性范圍見表1。
[0036]表1Bradyrhizobium ganzhouense種內(nèi)菌株以及與其它慢生根瘤菌之間的16SRNA和3個(gè)蛋白質(zhì)編碼持家基因的相似性
[0037]
【權(quán)利要求】
1.章夤州慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumganzhouense sp.ηον.) RITF806，其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2014044o
2.權(quán)利要求1所述的籍州慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumganzhouense sp.nov.)RITF806在制備固氮微 生物菌劑或生物有機(jī)肥中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103981122SQ201410117198
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】康麗華, 陸俊錕, 竇雅靜, 朱亞杰, 王勝坤, 隋新華 申請(qǐng)人:中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所