優(yōu)化nadph消耗性生物合成途徑的微生物菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及優(yōu)化的微生物菌株，用于具有NADPH消耗性生物合成途徑的分子的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)。本發(fā)明的菌株可以用于NADPH消耗性生物轉(zhuǎn)化方法。所述菌株的特征在于一種或多種NADPH氧化活性受到限制。
【專利說明】優(yōu)化NADPH消耗性生物合成途徑的微生物菌株
[0001]本申請是申請?zhí)枮?00480031980.6的中國專利申請的分案申請，原申請是國際申請PCT/FR2004/002848的中國國家階段申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]NADP (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)以它的還原形式NADPH參與細(xì)胞內(nèi)涉及具有脫氫酶和還原酶活性的酶的氧化還原反應(yīng)。
[0003]本發(fā)明涉及優(yōu)化的微生物菌株，以便通過生物轉(zhuǎn)化以NADPH消耗生物合成途徑生產(chǎn)物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的菌株可用于NADPH消耗生物轉(zhuǎn)化工藝。根據(jù)本發(fā)明定義的菌株可以是原核的或者真核的。優(yōu)選的實施方案中，原核菌株是大腸桿菌菌株。進(jìn)一步的實施方案中，真核菌株是酵母菌株，具體而言是釀酒酵母。
[0004]本發(fā)明還涉及通過使根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株的生長在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中而進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化來制備物質(zhì)的方法，優(yōu)化的菌株也包含對制備這種物質(zhì)必需的遺傳元件?！颈尘凹夹g(shù)】
[0005]生物轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)發(fā)展到可以大量而低成本地生產(chǎn)所需物質(zhì)，同時可以有效的使用工業(yè)和農(nóng)業(yè)上的副產(chǎn)品。
[0006]下面是用活體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化生成所需物質(zhì)的兩種主要方法:
[0007]I)發(fā)酵，微生物通過發(fā)酵從簡單碳源產(chǎn)生一種物質(zhì)(例如，W00102547，描述了谷氨酸棒桿菌在葡萄糖存在下發(fā)酵生成賴氨酸)。
[0008]2)微生物通過生物轉(zhuǎn)換將給定共底物轉(zhuǎn)換成感興趣物質(zhì)(例如，W00012745，描述了 R-哌啶衍生物的生成，和W00068397，描述了塔格糖的生成)。共底物不被同化，區(qū)別于用于單獨生成生物轉(zhuǎn)換必需的生物物質(zhì)和NADPH的碳源。
[0009]生物轉(zhuǎn)化方法的改進(jìn)涉及各種因素，如溫度、氧化、培養(yǎng)基成分、恢復(fù)方法等等。也可以修飾微生物以增加感興趣物質(zhì)的生成和/或排出。
[0010]發(fā)酵方法中，例如可以通過改變基因調(diào)控或通過修飾基因以改變參與的酶的特征，或者通過優(yōu)化輔因子的再生來改進(jìn)生物合成途徑。
[0011 ] 生物轉(zhuǎn)換方法中重點放在減少副產(chǎn)物的形成和優(yōu)化參與生物轉(zhuǎn)換步驟的輔因子的再生上。
[0012]在參與生物轉(zhuǎn)化的輔因子中，NADPH對下列物質(zhì)的生成尤其重要，氨基酸(例如精氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸)、維生素(例如泛酸鹽、維生素K1、生育酚)、芳香物(例如W09401564)、多元醇(例如木糖醇)、多胺(例如亞精胺)、羥基酯(例如4-氯-3-羥基丁酸乙酯)和其它高附加值的物質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明涉及利用具有NADPH消耗性生物合成途徑生產(chǎn)物質(zhì)的優(yōu)化微生物菌株。
[0014]不去嘗試優(yōu)化每個生物轉(zhuǎn)化中微生物的NADPH/NADP+比率，
【發(fā)明者】選擇產(chǎn)生改進(jìn)的微生物，以獲得不同的NADPH/NADP+比率，改進(jìn)的微生物隨后用于進(jìn)行NADPH消耗性生物轉(zhuǎn)化。
[0015]根據(jù)本發(fā)明，微生物菌株是表示同物種的一系列微生物，包括該物種的至少一種微生物。因而所描述的菌株的特征適用于該種類的所有微生物。同樣地，所描述的任何一個微生物菌株的特征也適用于整個微生物系列。
[0016]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的微生物包括細(xì)菌、酵母和絲狀霉菌，具體而言細(xì)菌和酵母屬于下列物種:曲霉屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、埃希氏菌屬、葡萄糖桿菌屬、青霉菌屬、畢赤酵母屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、酵母菌屬、鏈霉菌屬、黃單胞菌屬、假絲酵母屬物種。
[0017]下面描述了大腸桿菌和釀酒酵母的NADPH/NADP+比率優(yōu)化原則。同一原則同樣適用于所有在有氧條件下生長的微生物。
[0018]NADPH/NADP+比率優(yōu)化的原則在于限制參與NADPH氧化的酶活性，和/或促進(jìn)還原NADP+的酶活性。參與NADPH氧化的酶活性被還原反應(yīng)限制，具體而言，通過將那些活性，尤其是如醌氧化還原酶和/或可溶性轉(zhuǎn)氫酶的活性滅活而限制。通過調(diào)整經(jīng)過磷酸戊糖循環(huán)的碳流量和/或改進(jìn) 至少一種酶的輔因子專一性增強利于NADP+還原的酶活性，從而使其對NADP的利用優(yōu)先于其慣用輔因子NAD。
[0019]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株通過分子生物學(xué)方法獲得。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道用于改變微生物遺傳特性的方案。這些方法都有據(jù)可查，并且是技術(shù)人員容易操作的(Sambrook et al.,1989Molecular cloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold SpringHarbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.)。
[0020]用于限制酶活性的方法包括用適當(dāng)?shù)姆椒ǜ淖儽磉_(dá)它的基因，例如通過引起相關(guān)基因的編碼部分的突變，或者改變啟動子區(qū)域，具體而言就是用一個減少基因表達(dá)的序列來替換它。
[0021]用于滅活酶的方法包括用適當(dāng)?shù)姆绞綔缁钕嚓P(guān)基因表達(dá)的產(chǎn)物，或者抑制相關(guān)基因的表達(dá)，或者刪除至少相關(guān)基因的一部分以阻止其表達(dá)(例如，刪除其表達(dá)所必需的部分或全部啟動子區(qū)域)，或者導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物失去它的功能(例如，刪除相關(guān)基因的編碼部分)。
[0022]優(yōu)選地，刪除基因包括去除那個基因，而且如果需要，選擇一個便于鑒別的標(biāo)記基因代替它，分離和提純根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株。
[0023]大腸桿菌基因的滅活優(yōu)選通過同源重組實現(xiàn)(Datsenko K.A., WannerB.L.(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:6640-6645)。方案的原理簡要敘述如下:將線性片段導(dǎo)入細(xì)胞，所述線性片段在活體內(nèi)獲得，包括兩個旁側(cè)基因區(qū)域和定位于這兩個區(qū)域之間的至少一個選擇基因(通常是抗生素抗性基因)。這個片段因此含有滅活基因。隨后通過在選擇性培養(yǎng)基上鋪板來選擇發(fā)生了重組事件并整合有導(dǎo)入片段的細(xì)胞。然后選擇經(jīng)歷了雙重重組事件的細(xì)胞，該細(xì)胞中滅活基因替代了野生基因。為了加速雙重重組的檢出，這個方案可以用陽性和陰性選擇系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)。
[0024]釀酒酵母基因的滅活也是優(yōu)選通過同源重組進(jìn)行(Baudin et al., Nucl.AcidsRes.21,3329-3330,1993 ；ffach et al., YeastlO,1793-1808,1994 ；Brachmann et al.,Yeast.14:115-32,1998)。
[0025]促進(jìn)酶活性的方法包括通過適當(dāng)?shù)姆绞椒€(wěn)定相關(guān)基因表達(dá)的產(chǎn)物，例如通過減小它對變構(gòu)效應(yīng)物的靈敏性，或者通過增強基因的表達(dá)以增加產(chǎn)生的酶量。
[0026]基因的超表達(dá)可以通過在原位用強啟動子或誘導(dǎo)型啟動子替換基因的啟動子來實現(xiàn)。作為替代方案，將復(fù)制的質(zhì)粒(單拷貝或多拷貝)導(dǎo)入細(xì)胞，其中超表達(dá)的基因由適當(dāng)?shù)膯幼涌刂?。在大腸桿菌修飾的情況下，例如，可以用啟動子Plac-o、Ptrc-o和ptac_o三種刪除了乳糖操縱子(IacO)而構(gòu)成的強細(xì)菌啟動子。在釀酒酵母修飾的情況下，例如，可以用啟動子 PPgk、Padhl、Pgal1、Pgal 10。
[0027]本方法可用于改變酶的輔因子專一性，以使它對NADP的利用優(yōu)先于NAD，包括改變使那種酶表達(dá)的基因序列(Bocanegra, J.A.Scrutton, N.S.；Perham, R.N.(1993)Creation of an NADP—dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex byprotein engineering.Biochemistry32:2737-2740)。
[0028]根據(jù)發(fā)明優(yōu)化的菌株，即有增強的NADP+還原能力的菌株，通過一種或多種NADPH氧化酶活性的衰減或失活來表現(xiàn)其特征，NADPH氧化酶活性具體而言是醌氧化還原酶和/或可溶性轉(zhuǎn)氫酶的活性。
[0029]下面列出了一些NADPH氧化酶活性和基因的非限制性的實例:
[0030]
【權(quán)利要求】
1.生長于有氧條件下的大腸桿菌菌株，其特征在于，通過刪除以下基因的組使得其一種或多種NADPH氧化活性受到限制并且還進(jìn)行了促進(jìn)一種或多種其NADP+-還原酶活性的修飾: #udhA、qor 和 pgi ;或者
?udhA、qor、pfkA 和 pfkB。
【文檔編號】C12R1/19GK103952335SQ201410119033
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2003年11月6日
【發(fā)明者】格旺埃勒·貝斯泰爾－科爾, 塞德里克·布瓦薩爾, 米歇爾·沙托, 邦雅曼·岡薩雷斯, 菲利普·蘇卡耶, 雷納·菲格, 奧利維耶·津克 申請人:代謝探索者公司