一種利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)dha的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，其包括，利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺菌種子液的步驟；將裂殖壺菌接種到葡萄糖單一碳源或葡萄糖和甘油混合碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中的步驟；以及，當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖剩余量為原葡萄糖總量的1%～5%時，補(bǔ)加甘油或葡萄糖和甘油混合碳源的步驟。本發(fā)明所示的葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法具有的有益效果是：既吸收了葡萄糖單一碳源發(fā)酵時菌體生長速度快、總脂含量高的優(yōu)點，又具有甘油單一碳源發(fā)酵時DHA含量高的特征；提高了底物利用率，提高了DHA發(fā)酵水平，同時保證了較高的藻油品質(zhì)，十分有利于促進(jìn)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
【專利說明】一種利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]二十二碳六烯酸(22:6n-3) (DHA)是一種重要的ω-3系列多不飽和脂肪酸(co-3polyunsaturated fatty acids),具有促進(jìn)嬰幼兒智力和視力發(fā)育、預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗炎、增強(qiáng)免疫力等功效。深海魚油是ω-3多不飽和脂肪酸的傳統(tǒng)主要來源，但是存在著諸多問題，例如品質(zhì)不穩(wěn)定、外源性污染、氣味不良、純化成本高等，魚油中含有的EPA和膽固醇也使其不適于添加入孕嬰食品中。相反,微生物油脂(single cell oils,SCO)不但容易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，同時還克服了傳統(tǒng)魚油普遍存在受地域和氣候條件制約的問題，應(yīng)用前景廣闊。
[0003]裂殖壺菌(Schizochytrium)屬于破囊壺菌科的一類海洋微藻,是目前工業(yè)化生產(chǎn)DHA的理想物種之一。裂殖壺菌胞內(nèi)可積累大量脂肪，且70%以甘油三酯形式存在，其中DHA可以占到總脂肪酸的35~45%。同時，裂殖壺菌油脂還含有許多生理活性物質(zhì)，如色素(β-胡蘿卜素、葉黃素、 蝦青素等)、角鯊烯和甾醇等。Schizochytrium藻油的安全性已得到美國FDA認(rèn)可，2012年3月我國衛(wèi)生部出臺了《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB14880—2012,批準(zhǔn)Schizochytrium藻油DHA可用于嬰幼兒配方食品。
[0004]裂殖壺菌屬于異養(yǎng)型微生物，葡萄糖、果糖和甘油是裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的良好碳源，其中葡萄糖為最適碳源。傳統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)藻油DHA主要應(yīng)用葡萄糖，但是生產(chǎn)I噸DHA油脂大約需要消耗5噸葡萄糖，這種轉(zhuǎn)化是低效率的，加之生產(chǎn)過程中需輸入大量能量，設(shè)備投資與維護(hù)費用不菲，使得當(dāng)前藻油DHA的生產(chǎn)成本非常高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。
[0006]鑒于上述和/或現(xiàn)有利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法中存在的問題，提出了本發(fā)明。
[0007]因此，本發(fā)明的目的是提供一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，提高藻油DHA的發(fā)酵水平和底物利用率，從而降低生產(chǎn)成本。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案:一種利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，包括，利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺菌種子液的步驟；將裂殖壺菌接種到葡萄糖單一碳源或葡萄糖和甘油混合碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中的步驟；以及，當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖剩余量為原葡萄糖總量的1%~5%時，補(bǔ)加甘油或葡萄糖和甘油混合碳源的步驟。[0009]作為本發(fā)明所述利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法的一種優(yōu)選方案，其中:所述種子培養(yǎng)基包括葡萄糖、酵母膏、谷氨酸鈉、Na2SO4, KH2PO4, K2HPO4, K2SO4,MgSO4.TH2O^VB1, VB6, VB120
[0010]作為本發(fā)明所述利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法的一種優(yōu)選方案，其中:所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖、酵母膏、谷氨酸鈉、Na2SO4, KH2PO4, K2HPO4, K2SO4,MgSO4.TH2O^VB1, VB6, VB120
[0011]作為本發(fā)明所述利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法的一種優(yōu)選方案，其中:所述利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺菌種子液的步驟是將裂殖壺菌以5-10%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為20-30°C，pH值為4-8，轉(zhuǎn)速為180_220rpm，振蕩培養(yǎng)時間為4-6天。
[0012]本發(fā)明所示的葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法具有的有益效果是:既吸收了葡萄糖單一碳源發(fā)酵時菌體生長速度快、總脂含量高的優(yōu)點，又具有甘油單一碳源發(fā)酵時DHA含量高的特征；提高了底物利用率，提高了 DHA發(fā)酵水平，同時保證了較高的藻油品質(zhì)，十分有利于促進(jìn)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明中葡萄糖或甘油單一碳源發(fā)酵時裂殖壺菌生長情況示意圖；
[0014]圖2是本發(fā)明中葡萄糖或甘油單一碳源發(fā)酵時裂殖壺菌總脂積累情況示意圖；
[0015]圖3是本發(fā)明中葡萄糖或甘油單一碳源發(fā)酵時裂殖壺菌DHA含量變化示意圖；
[0016]圖4是本發(fā)明中葡萄糖或甘油單一碳源發(fā)酵時碳源消耗曲線示意圖；
[0017]圖5是本發(fā)明中實施例F組DHA含量變化情況示意圖。
【具體實施方式】
[0018]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】做詳細(xì)的說明。
[0019]在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。
[0020]其次，此處所稱的“ 一個實施例”或“實施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個實現(xiàn)方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個實施例中”并非均指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。
[0021]實施例1:利用葡萄糖或甘油單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)DHA
[0022]裂殖壺菌種子培養(yǎng)基:葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、谷氨酸鈉5g/L、Na2S0415g/L、KH2P043g/L、K2HP042g/L、MgS04 *7H203g/L,K2SO4IgZL^VB10.005g/L、VB60.002g/L、VB120.005g/L0
[0023]裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖(或甘油)100g/L、酵母膏10g/L、谷氨酸鈉15g/L、Na2S0415g/L、KH2P043g/L、K2HP042g/L、MgSO4.TH2CBgZUK2SO4IgZUVB10.008g/L、VB60.002g/UVB120.008g/L。
[0024] 種子培養(yǎng)兩代，每代在裝液量50mL/250mL三角瓶中進(jìn)行，接種量8% (V/V)，25°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)48h。第二代種子按8% (V/V)的接種量接入裝液量50mL/250mL三角瓶中，發(fā)酵條件為25°C、200rpm。
[0025]實驗結(jié)果如圖1、圖2、圖3和圖4所示:
[0026]結(jié)果表明: [0027]100g/L葡萄糖單一碳源發(fā)酵，4天達(dá)最大生物量39.27g/L，總脂占干重66.58%，DHA占總脂肪酸41.23%，DHA產(chǎn)量10.78g/L ； 100g/L甘油單一碳源發(fā)酵，6天達(dá)最大生物量36.34g/L，總脂占干重 62.40%, DHA 占總脂肪酸 47.37%，DHA 產(chǎn)量 10.74g/L。
[0028]葡萄糖為碳源菌體生長速度快、總脂含量高；甘油有助于DHA的積累，獲得藻油品質(zhì)較好。
[0029]實施例2:葡萄糖和甘油混合碳源進(jìn)料發(fā)酵生產(chǎn)DHA
[0030]裂殖壺菌種子培養(yǎng)基如實施例1所述。
[0031]裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源為50g/L葡萄糖和50g/L甘油，其余組成如實施例1所述。
[0032]裂殖壺菌培養(yǎng)方法如實施例1所述。
[0033]結(jié)果表明:以1:1混合碳源一次進(jìn)料，發(fā)酵時間為5天，生物量可達(dá)42.12g/L，即底物利用率有所提高，總脂占干菌含量61.84%，DHA占總脂肪酸45.67%，所得DHA產(chǎn)量為
11.90g/L,比單一碳源發(fā)酵增加了約10%。
[0034]實施例3:葡萄糖進(jìn)料甘油補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)DHA
[0035]裂殖壺菌種子培養(yǎng)基如實施例1所述。
[0036]裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，除碳源外其余組成如實施例1所述。
[0037]裂殖壺菌培養(yǎng)方法如實施例1所述。
[0038]本實施例進(jìn)行4組發(fā)酵實驗，前兩者是在殘?zhí)橇吭?0%~70%時補(bǔ)加甘油，后兩者是在葡萄糖殘?zhí)橇吭?%~5%時補(bǔ)加甘油:
[0039]實驗序號A以50g/L葡萄糖為初始碳源，當(dāng)殘?zhí)橇吭?0%時，補(bǔ)加50g/L甘油。
[0040]實驗序號B以75g/L葡萄糖為初始碳源，當(dāng)殘?zhí)橇吭?0%時，補(bǔ)加25g/L甘油。
[0041]實驗序號C以25g/L葡萄糖為初始碳源，當(dāng)殘?zhí)橇吭贗~5%時，補(bǔ)加75g/L甘油。
[0042]實驗序號D以75g/L葡萄糖為初始碳源，當(dāng)殘?zhí)橇吭贗~5%時，補(bǔ)加25g/L甘油。
[0043]實驗結(jié)果如表1所示:
[0044]表1葡萄糖進(jìn)料甘油補(bǔ)料發(fā)酵參數(shù)
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于:包括， 利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺菌種子液的步驟； 將裂殖壺菌接種到葡萄糖單一碳源或葡萄糖和甘油混合碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中的步驟；以及， 當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖剩余量為原葡萄糖總量的1%~5%時，補(bǔ)加甘油或葡萄糖和甘油混合碳源的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基包括葡萄糖、酵母膏、谷氨酸鈉、Na2SO4, KH2PO4, K2HPO4, K2SO4, MgSO4.7H20、VB1JB6JB12q
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖、酵母膏、谷氨酸鈉、Na2SO4, KH2PO4, K2HPO4, K2SO4, MgSO4.7H20、VB1JB6JB12q
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用混合碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于:所述利用種子 培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺菌種子液的步驟是將裂殖壺菌以5-10%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為20-30°C，pH值為4-8，轉(zhuǎn)速為180_220rpm，振蕩培養(yǎng)時間為4-6天。
【文檔編號】C12R1/645GK103937843SQ201410119673
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】常明, 李婧, 劉睿杰, 王興國, 金青哲, 黃健花, 鄒孝強(qiáng), 王小三, 劉元法 申請人:江南大學(xué)