一種適用于培養(yǎng)γδT細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種適用于培養(yǎng)γδT細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份I、γδT細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II以及水組成，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的適用于培養(yǎng)γδT細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)γδT細(xì)胞，能夠得到數(shù)量更多，純度更高且殺傷效果更好的γδT細(xì)胞。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）避免了由γδT在細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用的動物血清中動物成分對接受細(xì)胞治療患者帶來的風(fēng)險(xiǎn)以及動物血清中不確定的成分對細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果造成的不確定影響；2）大大提高了γδT細(xì)胞得率；3）增加了γδT細(xì)胞培養(yǎng)的終密度，從而降低了細(xì)胞培養(yǎng)的成本。
【專利說明】—種適用于培養(yǎng)Y ST細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種適用于培養(yǎng)Y δ T細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]Y δ T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)于上個世紀(jì)80年代中期，主要有兩種亞型:νr9/νδ2以及V5 I, r δ T在外周血T淋巴細(xì)胞中僅占0.5%~5%，其中大于90%的為Vy 9/νδ 2細(xì)胞。V51主要分布在上皮組織中，如腸道，脾臟，皮膚、小腸、食道、肺和生殖器官等。
[0003]r δ T細(xì)胞具有在體內(nèi)快速反應(yīng)的特性。在受到刺激時，會先于α β-T細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子，如IFN-Y和TNF-α ;對腫瘤細(xì)胞有高殺傷性，能夠通過細(xì)胞膜表面分子NKG2D識別腫瘤細(xì)胞表面的MICA/Β以及DNAM-1等膜蛋白從而啟動多種殺傷腫瘤細(xì)胞方式，如釋放穿孔素，顆粒酶，F(xiàn)asL，Trail等方式；r δ T細(xì)胞還能夠激活NK細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞毒作用；可以與DC細(xì)胞互刺激成熟；此外，r δ T細(xì)胞還具有APC細(xì)胞抗原提呈的功能，激活α β-Τ細(xì)胞的免疫效應(yīng)。Bouet-Toussaint等人抽取了 6例結(jié)直腸癌和4例肝癌患者外周血進(jìn)行Y δ T細(xì)胞的體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌和肝癌患者自體的腫瘤細(xì)胞能夠被各自相應(yīng)培養(yǎng)的V Y 9/V δ 2細(xì)胞裂解，而自體的正常組織細(xì)胞對V Y 9/V δ 2細(xì)胞裂解作用并不敏感，該結(jié)果提示體外擴(kuò)增的Y δ T細(xì)胞回輸治療肝癌似是一種行之有效的方法。
[0004]目前在臨床上，Yδ T細(xì)胞一般用于治療各種腫瘤，對呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及部分血液惡性疾病療效好。Y S T細(xì)胞與NK細(xì)胞形成互補(bǔ)，能殺傷對NK細(xì)胞不敏感的靶細(xì)胞，從而與NK細(xì)胞共同筑成機(jī)體抵抗腫瘤的天然基本防線。而臨床上獲得r δ T細(xì)胞的方法一般從外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)過程中一般需要加入動物血清來提高細(xì)胞培養(yǎng)的效果，動物血清能夠提供細(xì)胞生長所需的基本營養(yǎng)物質(zhì):氨基酸、維生素、無機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，還可以提供激素和各種生長因子:胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素(氫化可的松、地塞米松)、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。動物血清中這些物質(zhì)的存在為臨床上獲得安全有效的細(xì)胞產(chǎn)品提供了堅(jiān)強(qiáng)的保證。然而，由于動物血清中含有動物成分，若其用于臨床細(xì)胞治療體系中，可能會導(dǎo)致一些潛在的風(fēng)險(xiǎn)，這主要是由于動物血清成分復(fù)雜，雖含許多對細(xì)胞有利成分，但也有諸多不利細(xì)胞生長的因素存在:1)動物血清含一些對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)(如精胺、亞精胺)形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺、補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等都會影響細(xì)胞生長，甚至造成細(xì)胞死亡；2)動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致；3)取材中可能帶入支原體、病毒，對細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不可靠性；4)大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構(gòu)成動物細(xì)胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種適用于培養(yǎng)Y δ T細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，所含成分均為化學(xué)限定成分，不含任何動物血清成分，從而避免了使用動物血清可能導(dǎo)致的安全性的問題，且成本較低。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種適用于培養(yǎng)Y δ T細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份1、Y δ T細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II以及水組成，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份I是由以下濃度的組分組成的:
[0008]無水氯化|丐28 ~33.82mg/L, D-泛酸|丐 2.24 ~3.19mg/L, L-酪氨酸 4 ~5.9mg/L,L-蛋氨酸3~5mg/L, L-纟顏氨酸6~13.7mg/L, L-苯丙氨酸4~7mg/L, D-葡萄糖1789~1802mg/L,鹽酸批卩多醇(維生素B6)0.055~0.066mg/L,次黃嘌呤3~5mg/L, L-絲氨酸7~15mg/L,氯化鈉 7200 ~7599mg/L,核黃素 0.022 ~0.048mg/L,亞油酸 0.077 ~0.094mg/L, L-蘇氨酸10~13.9mg/L,磷酸氫二鈉120~149mg/L,胸苷0.22~0.39mg/L,硫辛酸0.12~0.29mg/L，L-天門冬酰胺7~18.01mg/L，L-精氨酸鹽酸鹽198~213mg/L，L-天門冬氨酸6~19.3mg/L，l，4 一丁二胺二鹽酸鹽0.11~0.19mg/L, L-半胱氨酸鹽酸鹽22~39.12mg/L, L-谷氨酰胺 113 ~149mg/L, L-谷氨酸 2 ~17.7mg/L,丙酮酸鈉 100 ~IlOmg/L,維生素B120.312~0.657mg/L,甘氨酸6~8mg/L, L-亮氨酸11~13.4mg/L,維生素H0.004~(λ 008mg/L, L-賴氨酸鹽酸鹽34~39.5mg/L, L-組氨酸鹽酸鹽9~25mg/L，L-脯氨酸25~34.5mg/L ;如表1所不。
[0009]所述Υ δ T細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II是由以下濃度的組分組成的:
[0010]轉(zhuǎn)鐵蛋白20~100mg/L，TCRy δ單抗20~50mg/L，神經(jīng)生長因子I~10mg/L，IL-450~100mg/L，成纖維素細(xì)胞生長因子I~10`0mg/L，胰島素生長因子50~200mg/L，IL-1250~500mg/L，帕米磷酸二鈉150~`500mg/L。如表2所示。本發(fā)明所用的神經(jīng)生長因子、成纖維素細(xì)胞生長因子、胰島素生長因子、IL-4、IL-12均采購自R&D公司，TCRy δ單抗采購自浙江瑞順生物技術(shù)公司，帕米磷酸二鈉采購自深圳海王藥業(yè)。
[0011]表1
【權(quán)利要求】
1.一種適用于培養(yǎng)Y S T細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:由基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份1、Y ST細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II以及水組成，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份I是由以下濃度的組分組成的: 無水氯化鈣28~33.82mg/L, D-泛酸鈣2.24~3.19mg/L, L-酪氨酸4~5.9mg/L,L-蛋氨酸3~5mg/L, L-纟顏氨酸6~13.7mg/L, L-苯丙氨酸4~7mg/L, D-葡萄糖1789~1802mg/L,鹽酸批卩多醇(維生素B6)0.055~0.066mg/L,次黃嘌呤3~5mg/L, L-絲氨酸7~15mg/L,氯化鈉 7200 ~7599mg/L,核黃素 0.022 ~0.048mg/L,亞油酸 0.077 ~0.094mg/L, L-蘇氨酸10~13.9mg/L,磷酸氫二鈉120~149mg/L,胸苷0.22~0.39mg/L,硫辛酸0.12~0.29mg/L, L-天門冬酰胺7~18.01mg/L, L-精氨酸鹽酸鹽198~213mg/L, L-天門冬氨酸6~19.3mg/L，4 一丁二胺二鹽酸鹽0.11~0.19mg/L, L-半胱氨酸鹽酸鹽22~39.12mg/L, L-谷氨酰胺 113 ~149mg/L, L-谷氨酸 2 ~17.7mg/L,丙酮酸鈉 100 ~IlOmg/L,維生素B120.312~0.657mg/L,甘氨酸6~8mg/L, L-亮氨酸11~13.4mg/L,維生素H0.004~(λ 008mg/L, L-賴氨酸鹽酸鹽34~39.5mg/L, L-組氨酸鹽酸鹽9~25mg/L，L-脯氨酸 25 ~34.5mg/L ； 所述Y δ T細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II是由以下濃度的組分組成的: 轉(zhuǎn)鐵蛋白20~100mg/L，TCRy δ單抗20~50mg/L，神經(jīng)生長因子I~10mg/L，IL-450~100mg/L，成纖維素細(xì)胞生長因子I~100mg/L，帕米磷酸二鈉150~500mg/L，胰島素生長因子 50 ~200mg/L，1L-1250 ~500mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于培養(yǎng)YS T細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份I是由以下濃度的組分組成的:無水氯化鈣29mg/L，D-泛酸鈣2.5mg/L,L-酪氨酸4.5mg/L, L-蛋氨酸4mg/L, L-繳氨酸13.5mg/L, L-苯丙氨酸6mg/L, D-葡萄糖1800mg/L,鹽酸批卩多醇0.055mg/L,次黃嘌呤5mg/L, L-絲氨酸8mg/L,氯化鈉7500mg/L,核黃素 0.028mg/L,亞油酸 0.079mg/L, L-蘇氨酸 13mg/L,磷酸氫二鈉 135mg/L,胸苷 0.25mg/L,硫辛酸0.19mg/L, L-天門冬酰胺14.4mg/L, L-精氨酸鹽酸鹽200mg/L, L-天門冬氨酸13.5mg/L，l，4 一丁二胺二鹽酸鹽0.18mg/L, L-半胱氨酸鹽酸鹽29mg/L，L-谷氨酰胺124mg/L, L-谷氨酸 13.9mg/L,丙酮酸鈉 105mg/L,維生素 B120.35mg/L,甘氨酸 7mg/L, L-亮氨酸13.4mg/L,維生素H0.005mg/L, L-賴氨酸鹽酸鹽37.5mg/L, L-組氨酸鹽酸鹽14mg/L,L-脯氨酸 25.6mg/L ； 所述Y δ T細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II是由以下濃度的組分組成的: 轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/L, TCR y δ單抗50mg/L,神經(jīng)生長因子10mg/L, IL_4100mg/L,成纖維素細(xì)胞生長因子50mg/L，帕米磷酸二鈉250mg/L，胰島素生長因子100mg/L，IL-12 250mg/L。
3.權(quán)利要求1或2所述的適用于培養(yǎng)yδ T細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于:步驟如下: (1)取組份I的各原料，混合混勻，在60°C真空下干燥15小時，備用；取組份II的各原料，在30°C真空下干燥18小時，混合混勻，備用； (2)將上述干燥后的組份I和組份II混合，針磨3個小時，過30目篩，得固態(tài)粉末，加水，混勻，0.2μπι濾膜過濾，即得適用于培養(yǎng)y δΤ細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，針磨生產(chǎn)過程中，溫度控制在20~25°C，濕度控制在15~20%，N2氣體壓力控制在150~300psi。
【文檔編號】C12N5/0783GK103834615SQ201410120087
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】葉永清 申請人:葉永清