無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白，是具有如序列2所示的蛋白序列，同時(shí)，還提供了該蛋白的編碼基因及制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明以無(wú)乳鏈球菌為研究對(duì)象，從無(wú)乳鏈球菌DNA中克隆到BibA基因，完成了該基因序列的克隆及測(cè)序，并對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)與免疫保護(hù)性的研究，獲得特異性高、有免疫保護(hù)力的疫苗研制候選抗原，為無(wú)乳鏈球菌病的預(yù)防奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于克隆到了無(wú)乳鏈球菌BibA基因，構(gòu)建了BibA重組表達(dá)質(zhì)粒，獲得了BibA重組蛋白，經(jīng)westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示BibA重組蛋白具有較好的反應(yīng)原性，動(dòng)物（小鼠）實(shí)驗(yàn)證明該重組蛋白具有一定的保護(hù)性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中的無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]無(wú)乳鏈球菌是一種人畜共患病原菌，可感染人、奶牛、兔、羅非魚(yú)、牛蛙等多種脊椎動(dòng)物，人體醫(yī)學(xué)上將無(wú)乳鏈球菌稱(chēng)為B群鏈球菌(GBS)。GBS能使帶菌孕婦引發(fā)早產(chǎn)、晚期流產(chǎn)、胎兒發(fā)育不良、胎膜早破、子宮內(nèi)膜炎、泌尿道感染等；無(wú)乳鏈球菌在奶牛上可引起奶牛的急性、亞急性和慢性乳房炎。
[0003]目前無(wú)乳鏈球菌可分為10個(gè)血清型，臨床研究表明，該菌存在耐藥性逐年增強(qiáng)的趨勢(shì)，所以疫苗預(yù)防該病成為科研工作者的首要目標(biāo)。但目前研制無(wú)乳鏈球菌常規(guī)疫苗存在許多技術(shù)難點(diǎn):1)無(wú)乳鏈球菌菌體滅活疫苗免疫保護(hù)效果有差異；2)血清型眾多，不同血清型菌株之間交叉保護(hù)性差；3)目前已知的保護(hù)性抗原較少。因此，篩選和獲得無(wú)乳鏈球菌的候選免疫蛋白成為研制奶牛乳房炎高效疫苗的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。目前尚無(wú)關(guān)于無(wú)乳鏈球菌BibA蛋白用于疫苗候選蛋白的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了可作為無(wú)乳鏈球菌基因工程疫苗候選蛋白的無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白，具有如序列2所不的蛋白序列。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上述無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白的編碼基因。
[0007]進(jìn)一步的，上述的無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白的編碼基因，是如下a)或b)的基因:
a)其核苷酸序列是序列表中的序列I;
b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白的DNA分子。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的，是提供了含有上述無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白的編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，所述重組表達(dá)質(zhì)粒為pCold? I DNA-BibA0
[0009]本發(fā)明的第四個(gè)目的，是提供了含有上述重組表達(dá)質(zhì)粒的工程菌，所述工程菌為pCold? 1-BibA/BL21(DE3)。
[0010]上述一種無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白的制備方法，包括有以下步驟:
O獲得如上所述的無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白的編碼基因；
2)將步驟I)得到的無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白克隆入表達(dá)載體pCold?I DNA中，得到pCold? 1-BibA重組質(zhì)粒；
3)將步驟2)得到的pCold?1-BibA重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞疋coli BL21-DE3 ；
4)誘導(dǎo)表達(dá)得到無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白。[0011]本發(fā)明的第五個(gè)目的，是提供了上述無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白作為基因工程疫苗研制過(guò)程中的候選蛋白的應(yīng)用。
[0012]具體操作步驟為:
(1)設(shè)計(jì)引物:
設(shè)計(jì)的BibA基因的表達(dá)引物對(duì)為:
上游引物 BibAl: 5’ -CGCGGA7TCTCGGATTCAATTCCTCAT-3’ (斜體下劃線為漢.Η I 酶切位點(diǎn))，
下游引物 BibA2: 5’ -CGGMTTCTGCATAATATCCAGGTGTAGGC-S'(斜體下劃線為 &oR I酶切位點(diǎn))；
(2)BibA基因的擴(kuò)增與獲得:
以提取的無(wú)乳鏈球菌基因組DNA為模板進(jìn)行BibA基因的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 50.0μ L:DNA 模板 6.0μ L，上下游引物各 1.0μ L , Premix Ex Taq 25.0 μ L，ddH2017.0μ L ;PCR 反應(yīng)條件為:95°C 預(yù)變性 5 min、95°C 變性 I min、64°C 復(fù)性 I min、72°C 延伸 Imin,反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min ；
(3)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:將目的基因以“T-A”連接的原理克隆入載體T-VectorPMD20，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，并進(jìn)行陽(yáng)性重組質(zhì)粒雙酶切和測(cè)序鑒定，將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD20-T-BibA和表達(dá)載體pCold? I DNA用漢.Η I和&oR I分別雙酶切，純化酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶4°C過(guò)夜連接，將連接物轉(zhuǎn)化入疋co/i BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，挑取單個(gè)菌落，接種于含6mL LB/AMP液體培養(yǎng)基的IOmL離心管中，37°C振蕩200rpm/min培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒，經(jīng)I和&oR I雙酶切和測(cè)序鑒定為陽(yáng)性的為陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒pCold? 1-BibA ；
(4)重組表達(dá)質(zhì)粒pCoId?1-BibA在宿主細(xì)胞萬(wàn).coli BL21(DE3)中的表達(dá):
取pCold? 1-BibA/BL21(DE3)工程菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培養(yǎng)至OD6qci 達(dá)到 0.5 時(shí)，分別加入 IPTG 至終濃度為 0.2m mol/L、0.4m mol/L、0.6m mol/L、0.8mmol/L及1.0m mol/L，在其它條件不變的前提下，分別在16°C、28°C、32°C、37°C和42°C等不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)；同樣以 IPTG 終濃度為 0.2m mol/L、0.4m mol/L、0.6m mol/L、0.8m mol/L及1.0m mol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；收集誘導(dǎo)后I h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h及過(guò)夜表達(dá)菌液，最后通過(guò)SDS-PAG E鑒定表達(dá)產(chǎn)物，來(lái)確定該重組蛋白的最佳表達(dá)條件與表達(dá)產(chǎn)物的可溶性；
(5)Western blot 方法檢測(cè):
根據(jù)上述(4)確定的最佳誘導(dǎo)條件，將不含陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒的萬(wàn)BL21(DE3)菌體蛋白和含有陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒pCold? 1-BibA的工程菌pCold? 1-BibA/BL21(DE3)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用小鼠抗6個(gè)組氨酸單抗作為一抗、辣根過(guò)氧化物酶羊抗小鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western blot分析；
(6)重組蛋白的純化與復(fù)性:
根據(jù)上述(4)確定的最佳表達(dá)條件，誘導(dǎo)表達(dá)IL含陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒pCold? 1- BibA的工程菌菌液，4°C 5000 g離心10min，棄上清，沉淀用細(xì)胞裂解液重懸，超聲破碎后，4°C，13000g離心10min，收集沉淀。采用包涵體純化試劑盒純化重組BibA蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE分析。將純化的蛋白溶液加入透析袋中，透析袋在放入10倍體積的5mol/L尿素中4°C透析6_8h，換用2.5mol/L尿素4°C透析6-8h，再用PBS在4°C透析過(guò)夜，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度；
(7)對(duì)BibA進(jìn)行免疫效果的初步研究:
將60只健康昆明小鼠隨機(jī)分為3組，分別為BibA重組蛋白免疫組(20只)、佐劑對(duì)照組(20只)和感染對(duì)照組(20只);BibA重組蛋白免疫組的處理方式為:BibA重組蛋白和弗氏完全佐劑按I: I乳化后，每只小鼠免疫注射0.2mL,然后用BibA重組蛋白和弗氏不完全佐劑按1:1乳化后，在首次免疫7d和14d后每只小鼠再各免疫注射0.2 mL ;佐劑對(duì)照組的處理方式為:用PBS代替抗原與弗氏佐劑乳化進(jìn)行免疫注射，免疫方法和免疫劑量與BibA重組蛋白免疫組類(lèi)似；感染對(duì)照組用PBS代替免疫原進(jìn)行免疫注射；各組均進(jìn)行3次免疫注射，每周I次，第3次免疫后I周攻擊感染，每只小鼠經(jīng)腹腔注射無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行感染，觀察小鼠發(fā)病情況，并計(jì)算保護(hù)率。
[0013]本發(fā)明的有益效果為:
本發(fā)明以無(wú)乳鏈球菌為研究對(duì)象，從無(wú)乳鏈球菌DNA中克隆到BibA基因，完成了該基因的克隆及測(cè)序，并對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)與免疫保護(hù)性的研究，獲得特異性高、有免疫保護(hù)力的疫苗研制候選抗原，為無(wú)乳鏈球菌病的預(yù)防奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于克隆到了無(wú)乳鏈球菌BibA基因，構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pCold? 1-BibA在宿主細(xì)胞疋coli BL21-DE3中誘導(dǎo)表達(dá)成功，western blot檢測(cè)結(jié)果顯示BibA重組蛋白具有較好的反應(yīng)原性,動(dòng)物(小鼠)實(shí)驗(yàn)證明該重組蛋白具有一定的保護(hù)性。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)原理為:
設(shè)計(jì)能擴(kuò)增出無(wú)乳鏈球菌BibA基因的引物，預(yù)期擴(kuò)增片段為1185bp，而且上下游引物分別帶有及I和I酶切位點(diǎn)；以提取的無(wú)乳鏈球菌基因組DNA為模板進(jìn)行BibA基因的PCR擴(kuò)增，將目的基因以“T-A”連接的原理克隆入載體T-Vector pMD20,形成重組質(zhì)粒pMD20-T-BibA ;用 I 和&oR I 分別雙酶切 pMD20_T/BibA 和表達(dá)載體 pCold? I DNA,將BibA基因亞克隆入pCold? I DNA載體，形成重組表達(dá)質(zhì)粒pCo Id? 1-BibA0重組表達(dá)質(zhì)粒pCold? 1-BibA轉(zhuǎn)化入疋coli BL21(DE3)中獲得重組工程菌，接種LB液體培養(yǎng)基，于37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到0.5時(shí)，分別加入IPTG至終濃度為0.4m mol/L, 37 °C振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)?？梢?jiàn)約在40ku處出現(xiàn)I條新的蛋白帶，與理論預(yù)測(cè)值相符。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為無(wú)乳鏈球菌BibA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0016]其中，泳道M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);泳道1:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0017]圖2為克隆載體T-Vector pMD20示意圖。
[0018]圖3為克隆載體T-Vector pMD20克隆位點(diǎn)示意圖。
[0019]圖4為陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pMD20-T_BibA的鑒定結(jié)果。
[0020]其中，泳道M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);泳道1:T_Vector pMD20空載體；泳道2-3:陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD20-BibA的雙酶切鑒定結(jié)果。
[0021]圖5為表達(dá)載體pCold? I DNA結(jié)構(gòu)圖譜。
[0022]圖6為表達(dá)載體pCo Id? I DNA目的基因插入位點(diǎn)不意圖。[0023]其中方框部分為目的基因BibA插入位點(diǎn)。
[0024]圖7為陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒pCold?- BibA的鑒定結(jié)果。
[0025]其中，泳道M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);泳道1-2:陽(yáng)性重組質(zhì)粒pCold? 1-BibA的雙酶切鑒定j}dt3:pColdTM I DNA空載體。
[0026]圖8為重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物定性分析的SDS-PAGE電泳結(jié)果。
[0027]其中，泳道M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1:不含陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒pCold? 1- BibA的菌體蛋白；泳道2-6:含陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒pCold? 1- BibA且IPTG終濃度分別為0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8m mol/L 及 1.0m mol/L 誘導(dǎo) 4h 的菌體蛋白。
[0028]圖9為重組蛋白的Western blot分析結(jié)果。
[0029]其中，泳道M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1:不含陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒pCold? 1- BibA的菌體蛋白；泳道2:含陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒pCold? 1- BibA的菌體蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0030]實(shí)施例1:
試劑來(lái)源:
T-Vector pMD20:TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，商品號(hào)3270。
[0031]pCold? I DNA =TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，商品號(hào)3361。
[0032]1、引物設(shè)計(jì):
設(shè)計(jì)一對(duì)引物，為了方便下一步進(jìn)行亞克隆，故上下游的5’端分別引入限制性酶切位
占.上游引物為:5’ -CGC^H^TCGGATTCAATTCCTCAT-3’(斜體下劃線為BawR I酶切位點(diǎn))；
下游引物為:5’ -CGGMTTCTGCATAATATCCAGGTGTAGGC-S'(斜體下劃線為 &oR I 酶切位點(diǎn))，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。
[0033]2、BibA基因的擴(kuò)增與獲得:
用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取無(wú)乳鏈球菌分離株的基因組DNA，以此為模板進(jìn)行BibA基因的PCR擴(kuò)增；反應(yīng)體系為50.0μ L:DNA模板6.0 μ L，上下游引物各1.0 μ L，PremixEx Taq 25.0μ L,ddH20 17.0 μ L ;PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性 5 min;95°C變性 I min,64°C復(fù)性I min、72°C延伸I min反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min ;PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的片段，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。
[0034]3、BibA基因克隆載體的制備:
PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，用TaKaRa膠回收試劑盒回收目的基因片段，按載體T-Vector pMD20說(shuō)明書(shū)將目的基因的PCR產(chǎn)物與T-Vector pMD20載體連接，克隆載體T-Vector pMD20示意圖如圖2所示，克隆載體T-Vector pMD20克隆位點(diǎn)示意圖如圖3所示，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入疋coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，接種于含有氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑選白色菌落，接種到含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行及I和&oR I雙酶切鑒定，篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD20-T-BibA，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pMD20-T-BibA的鑒定結(jié)果如圖4所示，并由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。[0035]4、BibA基因表達(dá)載體的亞克隆:
將測(cè)序正確的pMD20-T-BibA和表達(dá)載體pCold? I DNA分別用漢.Η I和&oR I進(jìn)行雙酶切，再分別回收BibA基因片段及pCold? I DNA線性載體，然后用T4 DNA連接酶4°C過(guò)夜連接，表達(dá)載體pCo Id? I DNA結(jié)構(gòu)圖譜如圖5所示，表達(dá)載體pCo Id? I DNA目的基因插入位點(diǎn)示意圖如圖6所示。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入萬(wàn).co7iBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，挑取單個(gè)菌落，接種于含6mL LB/AMP液體培養(yǎng)基的IOmL離心管中，37°C振蕩200rpm/min培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒，經(jīng)漢I和I雙酶切和測(cè)序鑒定為陽(yáng)性的為陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒pCold? 1-BibA，陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒pCold? 1-BibA的鑒定結(jié)果如圖7所
/Jn ο
[0036]5、重組表達(dá)質(zhì)粒pCo Id? 1-BibA在厶co7iBL21 (DE3)中的表達(dá):
取pCold? 1-BibA/BL21(DE3)重組工程菌接種LB液體培養(yǎng)基，于37°C振蕩培養(yǎng)至OD6qci 達(dá)到 0.5 時(shí)，分別加入 IPTG 至終濃度為 0.2m mol/L,0.4m mol/L,0.6m mol/L,0.8mmol/L及1.0m mol/L，在其它條件不變的前提下，分別在16°C、28°C、32°C、37°C和42°C等不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)；同樣以 IPTG終濃度為 0.2m mol/L、0.4m mol/L、0.6m mol/L、0.8m mol/L及1.0m mol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；收集誘導(dǎo)后I h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h及過(guò)夜表達(dá)菌液,最后通過(guò)SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物，來(lái)確定該重組蛋白的最佳表達(dá)條件與表達(dá)產(chǎn)物的可溶性，重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物定性分析的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖8所示，由試驗(yàn)結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件是=IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.4m mol/L, 37°C振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，且表達(dá)產(chǎn)物以包涵體為主。
[0037]6> Western blot 方法檢測(cè):
根據(jù)上述確定的最佳誘導(dǎo)條件，將不含陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒萬(wàn).COli^ll (DE3)的菌體蛋白和含有陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒pCo Id? 1- BibA的工程菌pCold? 1-BibA/BL21(DE3)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用小鼠抗6個(gè)組氨酸單抗作為一抗、辣根過(guò)氧化物酶羊抗小鼠IgG為二抗,進(jìn)行Western blot分析,重組蛋白的Western blot分析結(jié)果如圖9所
/Jn ο
[0038]7、重組蛋白的純化與復(fù)性:
根據(jù)上述確定的最佳表達(dá)條件，誘導(dǎo)表達(dá)IL pCold? 1- BibA/BL21(DE3)工程菌菌液，4°C 5000 g離心10min，棄上清，沉淀用細(xì)胞裂解液重懸，超聲破碎后，4°C，13000g離心IOmin,收集沉淀。采用包涵體純化試劑盒純化重組BibA蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE分析，將純化的蛋白溶液加入透析袋中，透析袋在放入10倍體積的5mol/L尿素中4°C透析6-8h，換用
2.5mol/L尿素4°C透析6-8h，再用PBS在4°C透析過(guò)夜，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。試驗(yàn)結(jié)果顯示純化復(fù)性的蛋白濃度為120μ g/mL。
[0039]8、對(duì)BibA進(jìn)行免疫診斷的初步研究:
將60只健康昆明小鼠隨機(jī)分為3組，分別為BibA重組蛋白免疫組(20只)、佐劑對(duì)照組(20只)和感染對(duì)照組(20只)。BibA重組蛋白免疫組的處理方式為:BibA重組蛋白(120μ g/mL)和弗氏完全佐劑按1:1乳化后，每只小鼠免疫注射0.2mL,然后用BibA重組蛋白(120 μ g/mL)和弗氏不完全佐劑按1:1乳化后，在首次免疫7d和14d后每只小鼠再各免疫注射0.2 mL。佐劑對(duì)照組的處理方式為:與用PBS代替抗原與弗氏佐劑乳化進(jìn)行免疫注射，免疫方法和免疫劑量與BibA重組蛋白免疫組類(lèi)似。感染對(duì)照組用PBS代替免疫原進(jìn)行免疫注射。各組均進(jìn)行3次免疫注射，每周I次，第3次免疫后I周攻擊感染，每只小鼠經(jīng)腹腔注射無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行感染，觀察小鼠發(fā)病情況，計(jì)算保護(hù)率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)佐劑對(duì)照組和感染對(duì)照組的小鼠在無(wú)乳鏈球菌感染24h內(nèi)出現(xiàn)精神不振、蜷縮發(fā)抖等癥狀，48h內(nèi)全部死亡。而免疫對(duì)照組在無(wú)乳鏈球菌感染后也一度出現(xiàn)精神不振、蜷縮發(fā)抖等癥狀，但比其它兩組臨床癥狀輕微，72h內(nèi)共死亡8只，其余全部存活，而且精神狀態(tài)慢慢恢復(fù)，保護(hù)率為60%。
[0040]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則 之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白，其特征在于，具有如序列2所示的蛋白序列。
2.無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白的編碼基因，其特征在于:是如下a)或b)的基因: a)其核苷酸序列是序列表中的序列I; b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白的編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，所述重組表達(dá)質(zhì)粒為pCold? 1-BibA0
5.含有權(quán)利要求4所述重組表達(dá)質(zhì)粒的工程菌，所述工程菌為pCold?1-BibA/BL21(DE3)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)乳鏈球菌BibA重組蛋白作為基因工程疫苗研制過(guò)程中的候選蛋白的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103910786SQ201410121035
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】王旭榮, 李建喜, 楊志強(qiáng), 王學(xué)智, 常瑞祥, 王磊, 張景艷, 秦哲, 孔曉軍, 孟嘉仁 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所