瓜類細(xì)菌性果斑病菌lamp檢測引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及瓜類細(xì)菌性果斑病菌LAMP檢測引物，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本研究根據(jù)瓜類細(xì)菌性果斑病菌菌株AAC00-1的全基因組序列信息，在Aave_4063和Aave_4064基因序列設(shè)計(jì)了1套果斑菌LAMP檢測的特異性引物，基于該引物建立的LAMP檢測方法具有強(qiáng)特異性和高靈敏度，低成本、快速易于操作等特點(diǎn)。
【專利說明】瓜類細(xì)菌性果斑病菌LAMP檢測引物
(—)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉瓜類細(xì)菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)LAMP引物及檢測方法,屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]瓜類細(xì)菌性果斑病(Bacterial fruit blotch, BFB)是西甜瓜等葫蘆科作物上重要的細(xì)菌病害，由西瓜曬酸菌(Acidovorax citrulli)引起。該病為典型的種傳病害(Schaad N W，1978)，發(fā)病后侵染葉片、果實(shí)和種子，嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量，對瓜類生產(chǎn)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了極大的威脅(Richard Latin, 1995 ；ffalcott R R，2003)，上世紀(jì)90年代在我國首次報(bào)道，隨后在新疆、海南、內(nèi)蒙古、寧夏、北京、河北、山東、吉林、福建、湖南等地發(fā)生，并呈上升趨勢，造成大田西瓜和甜瓜減產(chǎn)甚至絕收，給西甜瓜生產(chǎn)帶來巨大損失(蔡學(xué)清等，2005 ;薛莉等，2009 ;任小平等，2010 ;胡俊等，2006 ;趙廷昌等，2001 ;金巖等，2004)。因此建立西瓜噬酸菌的快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測技術(shù)是防止該病害發(fā)生的重要舉措。
[0003]有關(guān)西瓜噬酸菌國內(nèi)外已有多篇PCR特異性檢測的研究報(bào)道(Minsavage G V etal, 1995 ；Walcott et al,2000 ；Schaad N W et al,2003 ；Song W Y et al,2003 ；Bahar etal，2008)，但均存在諸如靈敏度不高或特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn)。目前，一種最新的檢測技術(shù)開始被廣泛應(yīng)用一環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是由NOTOMI等于2000年報(bào)道的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，它針對目的基因其特點(diǎn)是針對靶序列的6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)兩對引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件下(65°C左右)保溫30~60min，即可實(shí)現(xiàn)核酸的大量擴(kuò)增，并且伴有肉眼可見的副產(chǎn)物白色焦磷酸酶沉淀產(chǎn)生(Notomi et al，2000)。此方法的產(chǎn)生后，已被廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌等領(lǐng)域的檢測中(Endo et al, 2004 ；0kafuji et al, 2005) ?
[0004]本實(shí)驗(yàn)基于LAMP技術(shù)建立了瓜類細(xì)菌性果斑病菌的檢測體系，并對市售的瓜種子進(jìn)行了檢測。
[0005]參考文獻(xiàn)
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(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]技術(shù)問題
[0024]發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中瓜類細(xì)菌性果斑病的LAMP檢測方法，意在避免常規(guī)檢測方法如PCR等方法易受檢測樣品中雜質(zhì)干擾、以及假陽性的現(xiàn)象。LAMP技術(shù)可對瓜類細(xì)菌性果斑病進(jìn)行有效檢測，且存在特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)。
[0025]技術(shù)方案
[0026]本研究的技術(shù)路線如下所示:
[0027]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測瓜類細(xì)菌性果斑病菌的LAMP引物AC-F3，Ac_B3，Ac_FIP，和Ac_BIP，其特征在于，所述引物Ac-F3，Ac-B3，Ac-FIP JPAc-BIP的序列為: Ac-F3:5’ -ACCTGCTTCCGTTCTTCATG-3’
Ac-B3:5， -GTCAGGAGGGTGAGTAGCA-3，
Ac-FIP:5’ -TCACGCACTGCACGCCTTCC-CCCTCCTGCCCATGCT-3’
Ac-BIP:5’ -CAGGCGATCGAAGGCCGCT-TGGGGCGACAGATGGTG-3’。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103866029SQ201410122468
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】趙玉強(qiáng), 朱建華, 朱恩, 羅金燕, 陳磊, 姚紅梅, 余慧, 胡白石 申請人:上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心