可穩(wěn)定表達人tmprss2蛋白的單細胞自懸浮生長mdck細胞株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可穩(wěn)定表達人TMPRSS2蛋白的單細胞自懸浮生長的MDCK細胞株，構(gòu)建方法以及其在培養(yǎng)禽流感病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開了一種可穩(wěn)定表達人TMPRSS2蛋白的單細胞自懸浮生長MDCK細胞株，命名為MDCK-Sus-TMPRSS2，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其細胞株的保藏號為：CGMCCNo.8851。同時本發(fā)明提供了這一細胞株的構(gòu)建方法，以及其在禽流感病毒增殖培養(yǎng)中的應(yīng)用方式。從而實現(xiàn)了禽流感病毒增殖培養(yǎng)中無需添加TPCK處理的胰蛋白酶，從而有效解決了外源蛋白酶對宿主細胞生長的不可逆影響，顯著提高了禽流感病毒的增殖效率。
【專利說明】可穩(wěn)定表達人TMPRSS2蛋白的單細胞自懸浮生長MDCK細胞株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種單細胞自懸浮生長MDCK細胞株及其應(yīng)用，特別涉及一種可穩(wěn)定表達人TMPRSS2蛋白的單細胞自懸浮生長的MDCK細胞株，構(gòu)建方法以及其在培養(yǎng)禽流感病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]目前采用連續(xù)傳代細胞系替代SPF雞胚在生物反應(yīng)器中進行禽流感病毒的大規(guī)模增殖制備是科研單位或獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)競相開展的研究熱點。
[0005]禽流感病毒粒子表面的HA蛋白與宿主細胞上病毒受體結(jié)合的先決條件是HA蛋白在其堿性氨基酸(Lys或Arg)位點進行有效裂解，形成HAl蛋白和HA2蛋白，這二者之間由二硫鍵連接。HAl蛋白負責識別宿主細胞膜上的糖鏈受體，HA2蛋白的N端有一段融合肽負責病毒囊膜與宿主細胞膜的融合，在H+攻擊下由病毒的M2蛋白形成離子通道幫助病毒遺傳物質(zhì)向胞內(nèi)釋放，繼而進入細胞核完成逆轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯表達等后續(xù)過程。禽流感病毒能夠在SPF雞胚中增殖的一個重要原因就是雞胚尿囊液中含有大量的蛋白酶，能夠?qū)Σ《玖Ｗ颖砻娴腍A蛋白進行裂解。而流感病毒在體外培養(yǎng)的動物細胞，如MDCK細胞、Vero細胞中增殖一般都需要在病毒增殖過程中添加經(jīng)TPCK處理的胰蛋白酶。這種蛋白酶弱化了胰凝乳蛋白酶的活性，而增強了對堿性氨基酸(如Arg、lys)位點的裂解能力，從而能夠保證禽流感病毒HA蛋白的正確裂解。
[0006]但是外源蛋白酶的添加對宿主細胞的生長狀態(tài)造成的影響是不可逆的，特別是種毒連續(xù)傳代后的蛋白酶積累對宿主細胞生理狀態(tài)影響極為嚴重，進而影響禽流感病毒的增殖效率。
[0007]發(fā)明目的
本發(fā)明公開了一種可穩(wěn)定表達人TMPRSS2蛋白的單細胞自懸浮生長MDCK細胞株及其構(gòu)建方法，以及這一細胞株在禽流感病毒增殖培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明具體公開了以下技術(shù)方案:
本發(fā)明公開了一種可穩(wěn)定表達人TMPRSS2蛋白的單細胞自懸浮生長MDCK細胞株，命名為MDCK-Sus-TMPRSS2，分類命名為重組MDCK_Sus_TMPRSS2細胞，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。其細胞株的保藏號為=CGMCC N0.8851。保藏日期為2014年3月6日。
[0009]這里TMPRSS2 是指 II 型跨膜型絲氨酸蛋白酶(type II transmembrane proteaseserines, TMPRSS2)是新近發(fā)現(xiàn)的一類特殊蛋白酶,該蛋白從N端往C端依次是胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(cyt0.D)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)、主干區(qū)(低密度脂蛋白A類受體區(qū)LDLRA、富含半胱氨酸的清道夫受體區(qū)SRCR、原結(jié)構(gòu)域Pro)、消化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain)。其中跨膜區(qū)結(jié)合于細胞膜上，主干區(qū)和消化結(jié)構(gòu)域則表達定位于細胞膜的外側(cè)，具有蛋白消化酶解的功能。其蛋白的基因序列如SEQ ID N0.1所不。
[0010]同時，本發(fā)明還進一步公開所述MDCK-SUS-TMPRSS2為適應(yīng)于全懸浮生長的細胞株。這一技術(shù)特征主要是區(qū)別于傳統(tǒng)的貼壁生長的MDCK細胞。
[0011]同時，在本申請中，我們還進一步公開了單細胞自懸浮生長MDCK細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟:
1)單細胞懸浮生長MDCK細胞的懸浮轉(zhuǎn)染過程
接種初始細胞密度為5X105cells/ml的MDCK-Sus細胞系于50mlTPP培養(yǎng)管中，懸浮培養(yǎng)過夜后用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前將懸浮培養(yǎng)用培養(yǎng)基更換為Opt1-MEM培養(yǎng)基孵育10分鐘；
以IOml細胞懸液為一個轉(zhuǎn)染單位，將lOOulPEI試劑加入至Iml的Opt1-MEM中混勻，將10~200ug pIRES-TMPRSS2質(zhì)粒載體加入至Iml的Opt1-MEM中混勻，分別在室溫下孵育5分鐘；
孵育完成后將上述兩個混合液采用逐滴加入的方式混勻，在室溫下孵育15分鐘，形成PE1-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物；
采用逐滴加入的方式將PE1-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入至10倍體積的MDCK-Sus細胞懸液中，邊滴入邊振蕩混勻，于室溫中孵育15分鐘，每間隔3分鐘混勻一次；
孵育結(jié)束后，將孵育后的混合物放置于搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速55~120rpm ；
8小時后，以1000rpm離心10分鐘，將含有剩余轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)上清去除；
添加MDCK-Sus細胞株的正常懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩懸浮培養(yǎng)；
2)受轉(zhuǎn)染的陽性懸浮細胞克隆的篩選
轉(zhuǎn)染后18~24小時的MDCK-Sus細胞株經(jīng)離心回收按照1:2~1:12的比例重新分散至15ml新鮮懸浮培養(yǎng)液中培養(yǎng)，370C，5%C02,轉(zhuǎn)速為100~200rpm，通過G418進行篩選，獲得能夠在G418篩選抗性中穩(wěn)定持續(xù)懸浮生長的重組MDCK-Sus-TMPRSS2細胞克隆。
[0012]具體來說，這一篩選過程為，轉(zhuǎn)染后18~24小時的MDCK-Sus細胞系經(jīng)離心回收按照1:2~1:12的比例重新分散至15ml新鮮懸浮培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37°C，5% C02，轉(zhuǎn)速為100~200rpm，懸浮培養(yǎng)液中G418的工作濃度為400ug/ml，細胞初始密度大致為3~5X105cells/mL.按照5天換一次液的頻率進行G418持續(xù)篩選，第一輪篩選時間大致為4~6周。選擇能夠在有G418篩選壓力下持續(xù)增殖的重組MDCK-Sus-TMPRSS2細胞克隆繼續(xù)懸浮培養(yǎng)傳代。該傳代操作以離心去除培養(yǎng)上清并重懸細胞沉淀來實現(xiàn)。第二輪篩選中將G418篩選工作濃度提高至600ug/ml繼續(xù)加壓篩選。最終獲得能夠在G418篩選抗性中穩(wěn)定持續(xù)懸浮生長的重組MDCK-Sus-TMPRSS2細胞克隆，并建系保藏。
[0013]同時，本發(fā)明進一步公開了一種細胞培養(yǎng)物，所述細胞培養(yǎng)物含有重組的MDCK-Sus-TMPRSS2 細胞。
[0014]進一步，我們還公開了所述單細胞自懸浮生長MDCK細胞株或含有重組的MDCK-Sus-TMPRSS2細胞的細胞培養(yǎng)物在禽流感病毒增殖培養(yǎng)中的用途。
[0015]同時，我們進一步公開了本發(fā)明中公開的細胞培養(yǎng)物不含有血清。
[0016] 更進一步地，我們還公開了所述禽流感病毒增殖培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)物中不含有TPCK處理的胰蛋白酶。
[0017]基于前述公開技術(shù)方案，本發(fā)明還進一步公開了單細胞自懸浮生長MDCK細胞株進行禽流感病毒生物反應(yīng)器大規(guī)模增殖的方法，包括以下步驟:
O將重組MDCK-SUS-TMPRSS2細胞在生物反應(yīng)器中進行分批與補料聯(lián)合式全懸浮培養(yǎng)，得到MDCK-Sus-TMPRSS2細胞培養(yǎng)液，
2)當MDCK-Sus-TMPRSS2細胞培養(yǎng)液中的細胞密度達到4X106cells/ml時，按照MOI為0.0001~I的比例接入禽流感病毒以及病毒增殖維持液；
3)病毒增殖過程中設(shè)定pH6.8~7.2，DO (溶氧)15~35%，溫度28~37°C，培養(yǎng)3天后即可收獲子代流感病毒。
[0018]進一步地，我們公開了所述病毒增殖維持液組分如下所示:
【權(quán)利要求】
1.一種可穩(wěn)定表達人TMPRSS2蛋白的單細胞自懸浮生長MDCK細胞株，命名為MDCK-Sus-TMPRSS2，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其細胞株的保藏號為:CGMCC N0.8851。
2.如權(quán)利要求1所述的單細胞自懸浮生長MDCK細胞株，其特征在于:所述MDCK-Sus-TMPRSS2為適應(yīng)于全懸浮生長的細胞株。
3.—種權(quán)利要求1或2所述的單細胞自懸浮生長MDCK細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: O單細胞懸浮生長MDCK細胞的懸浮轉(zhuǎn)染過程 接種初始細胞密度為5X 105cells/ml的MDCK-Sus細胞系于50mlTPP培養(yǎng)管中，懸浮培養(yǎng)過夜后用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前將懸浮培養(yǎng)用培養(yǎng)基更換為Opt1-MEM培養(yǎng)基孵育10分鐘； 以IOml細胞懸液為一個轉(zhuǎn)染單位，將lOOulPEI試劑加入至Iml的Opt1-MEM中混勻，將10~200ug pIRES-TMPRSS2質(zhì)粒載體加入至Iml的Opt1-MEM中混勻，分別在室溫下孵育5分鐘； 孵育完成后將上述兩個混合液采用逐滴加入的方式混勻，在室溫下孵育15分鐘，形成PE1-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物； 采用逐滴加入的方式將PE1-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入至10倍體積的MDCK-Sus細胞懸液中，邊滴入邊振蕩混勻，于室溫中孵育15分鐘，每間隔3分鐘混勻一次； 孵育結(jié)束后，將孵育后的混合物放置于搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速55~120rpm ； 8小時后，以1000rpm離心10分鐘，將含有剩余轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)上清去除； 添加MDCK-Sus細胞株的正常懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩懸浮培養(yǎng)； 2)受轉(zhuǎn)染的陽性懸浮細胞克隆的篩選 轉(zhuǎn)染后18~24小時的MDCK-Sus細胞株經(jīng)離心回收按照1:2~1:12的比例重新分散至15ml新鮮懸浮培養(yǎng)液中培養(yǎng)，370C，5%C02,轉(zhuǎn)速為100~200rpm，通過G418進行篩選，獲得能夠在G418篩選抗性中穩(wěn)定持續(xù)懸浮生長的重組MDCK-Sus-TMPRSS2細胞克隆。
4.一種細胞培養(yǎng)物，其特征是，所述細胞培養(yǎng)物含有權(quán)利要求1-3中任意一項所述的MDCK-Sus-TMPRSS2 細胞。
5.權(quán)利要求1-3中任一項所述的單細胞自懸浮生長MDCK細胞株或權(quán)利要求4中所述的細胞培養(yǎng)物在禽流感病毒增殖培養(yǎng)中的用途。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征是，所述細胞培養(yǎng)物中不含有血清。
7.如權(quán)利要求5或6所述的用途，其特征是，禽流感病毒增殖培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)物中不含有TPCK處理的胰蛋白酶。
8.一種利用權(quán)利要求廣3中任意一項所述的單細胞自懸浮生長MDCK細胞株進行禽流感病毒生物反應(yīng)器大規(guī)模增殖的方法，其特征是包括以下步驟: O將重組MDCK-Sus-TMPRSS2細胞在生物反應(yīng)器中進行分批與補料聯(lián)合式全懸浮培養(yǎng)，得到MDCK-Sus-TMPRSS2細胞培養(yǎng)液， 2)當MDCK-Sus-TMPRSS2細胞培養(yǎng)液中的細胞密度達到4X106cells/ml時，按照MOI為0.0001~I的比例接入禽流感病毒以及病毒增殖維持液； 3)病毒增殖過程中設(shè)定pH6.8~7.2，DO (溶氧)15~35%，溫度28~37°C，培養(yǎng)3天后即可收獲子代流感病毒。
9.如權(quán)利要求8所述的禽流感病毒生物反應(yīng)器大規(guī)模增殖的方法，其特征是:所述病毒增殖維持液組分如下所示。
【文檔編號】C12N5/10GK103937748SQ201410130367
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】馮磊, 吳培培, 褚軒, 王偉峰, 華濤, 陳麗, 侯繼波 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院