一種用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鑒定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鑒定方法，以待檢測(cè)的葡萄砧木的DNA為模板，對(duì)與葡萄根瘤蚜抗性相連鎖的DNA分子標(biāo)記進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果中存在與所述DNA分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的DNA條帶，則說(shuō)明對(duì)應(yīng)的葡萄砧木具有葡萄根瘤蚜抗性，若電泳結(jié)果中不存在與所述DNA分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的DNA條帶，則說(shuō)明對(duì)應(yīng)的葡萄砧木不具有葡萄根瘤蚜抗性，本發(fā)明可以快速區(qū)分葡萄砧木有無(wú)葡萄根瘤蚜抗性，解決了現(xiàn)有葡萄根瘤蚜抗性鑒定需要特定隔離條件、易受環(huán)境條件影響且需要年限較長(zhǎng)的問(wèn)題。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于葡萄育種【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及對(duì)毀滅性害蟲(chóng)葡萄根瘤蚜抗性的快速檢測(cè)。【背景技術(shù)】
[0002]葡萄根瘤蚜是葡萄的一種毀滅性蟲(chóng)害，主要通過(guò)取食根系危害葡萄，常規(guī)的植保技術(shù)難以防治。目前最有效的預(yù)防方法是采用葡萄根瘤蚜抗性砧木，進(jìn)行嫁接栽培。然而在葡萄砧木育種過(guò)程中，選育的砧木是否具有根瘤蚜抗性，需要進(jìn)行砧木對(duì)葡萄根瘤蚜抗性的鑒定，通常采用葡萄砧木根系人工接種葡萄根瘤蚜后統(tǒng)計(jì)感染形成的根瘤數(shù)量進(jìn)行鑒定，無(wú)根瘤形成或根瘤形成數(shù)量少的為具有抗性，根瘤數(shù)量多的為感性。但該抗性鑒定需要在特殊的隔離 條件下進(jìn)行以避免蟲(chóng)害擴(kuò)散，此外鑒定需要2年以上的重復(fù)試驗(yàn)鑒定，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，操作過(guò)程中的環(huán)境條件可能會(huì)影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鑒定方法。
[0004]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案。
[0005]以待檢測(cè)的葡萄砧木的DNA為模板，對(duì)與葡萄根瘤蚜抗性相連鎖的DNA分子標(biāo)記進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果中存在與所述DNA分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的DNA條帶，則說(shuō)明對(duì)應(yīng)的葡萄砧木具有葡萄根瘤蚜抗性，若電泳結(jié)果中不存在與所述DNA分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的DNA條帶，則說(shuō)明對(duì)應(yīng)的葡萄砧木不具有葡萄根瘤蚜抗性。
[0006]所述DNA分子標(biāo)記為微衛(wèi)星分子標(biāo)記。
[0007]所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增采用寡聚脫氧核苷酸序列SeqOl和Seq02作為引物對(duì)，SeqOl具有如SEQ.1D.N0.1所示的核苷酸序列，Seq02具有如SEQ.1D.N0.2所示的核苷酸序列。
[0008]所述DNA條帶的大小約為169bp。
[0009]本發(fā)明提供了一種在DNA水平上快速鑒定葡萄砧木對(duì)葡萄根瘤蚜有無(wú)抗性的方法，可以快速區(qū)分葡萄砧木有無(wú)葡萄根瘤蚜抗性，解決了現(xiàn)有葡萄根瘤蚜抗性鑒定需要特定隔離條件、易受環(huán)境條件影響且需要年限較長(zhǎng)的問(wèn)題。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為具有根瘤蚜抗性葡萄砧木和不具有根瘤蚜抗性葡萄砧木采用本方法檢測(cè)的結(jié)果圖；圖1中1、2、3泳道為已知不具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木經(jīng)檢測(cè)的結(jié)果，4、5、6泳道為已知有根瘤蚜抗性的葡萄砧木經(jīng)檢測(cè)的結(jié)果，M泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)字250、200以及150表示DNA條帶大小,單位為堿基對(duì)(base pair, bp)。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。[0012]本發(fā)明提供一種通過(guò)檢測(cè)與葡萄根瘤蚜抗性性狀基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記來(lái)判斷葡萄根瘤姆抗性是否存在的方法。本發(fā)明基于微衛(wèi)星(Simple sequencerepeat, SSR)分子標(biāo)記技術(shù)，以本發(fā)明提供的寡聚脫氧核苷酸序列SeqOl和Seq02作為SSR引物對(duì)，以待檢測(cè)的葡萄砧木的DNA為模板，對(duì)與葡萄根瘤蚜抗性相連鎖的特定DNA片段即DNA分子標(biāo)記進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增獲得產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)后，篩選出了大小約為169bp的特定DNA條帶(品種間長(zhǎng)度無(wú)差異)，與葡萄根瘤蚜抗性存在緊密連鎖關(guān)系，即具有該特定DNA條帶的待檢測(cè)葡萄砧木具有葡萄根瘤蚜抗性，無(wú)該特定條帶的待檢測(cè)葡萄砧木無(wú)葡萄根瘤蚜抗性。
[0013]本發(fā)明的具體步驟如下:
[0014](I)采用常規(guī)的CTAB法或SDS法分別提取待檢測(cè)葡萄砧木的葉片、莖段或根系部位的基因組DNA (即樣品DNA)，CTAB法提取樣品中DNA的步驟如下:①0.4g左右葉片經(jīng)液氮冷凍快速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入2mL離心管中；②立即加入65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液700 μ L以及β -巰基乙醇20 μ L，劇烈震蕩至充分混勻，置65°C水浴中保溫30min，取出后冷卻至室溫；③加等體積的氯仿/異戊醇=24:1，輕輕地顛倒混勻，于室溫下12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中；④經(jīng)過(guò)③后，向上清液中加等體積的氯仿/異戊醇=24:1，輕輕地顛倒混勻，于室溫下12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管中；?經(jīng)過(guò)④后，向上清液中加入等體積經(jīng)_20°C預(yù)冷的異丙醇，輕輕地顛倒混勻至有白色絮狀沉淀出現(xiàn)后，靜置于_2(TC 30min使沉淀生成，于4? 12000rpm離心10min,倒掉上清液,保留沉淀物(DNA);⑥加入50 0 μ L預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀物(13000rpm離心lmin)，倒掉上清液，保留沉淀，并重復(fù)本步驟一次；⑦加入500 μ L預(yù)冷的無(wú)水乙醇洗漆沉淀(13000rpm離心lmin)，倒掉上清液，沉淀靜置風(fēng)干后溶于40 μ L ddH20中4°C過(guò)夜取溶解后的樣品DNA0.5 μ L用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA濃度、純度和降解程度。經(jīng)檢測(cè)樣品DNA的0D260/280介于1.8-2.0之間、經(jīng)0.7%的瓊脂糖核酸電泳檢測(cè)DNA樣品無(wú)雜質(zhì)、無(wú)明顯降解的條件下，將各待檢測(cè)葡萄砧木樣品DNA加水稀釋至終濃度為lOOng/uL待用；
[0015](2)將按照本發(fā)明提供的寡聚脫氧核苷酸序列seqOl和seq02合成的單鏈寡聚DNA，分別加水稀釋成lOumol/L水溶液，序列分別為:
[0016]SeqO1:5 ’ -TGTTGGTGTGTGTTTGTACGTG-3，
[0017]Seq02:5，-TGTTATTGAGTTAGAATGAAGTGTTGG-3，
[0018](3)在每個(gè) 0.2mL 薄壁 PCR 管中加入:2uL2mmol/L 的 dNTP, 1.7uL25mmol/L 的MgCl2, 2ullOX taq緩沖液，步驟(2)配制的seq01、seq02溶液各2.0uL,步驟(1)配制的待測(cè)樣品DNA溶液2uL,加入Taq聚合酶I個(gè)單位,加水至總體積20ul，輕微震蕩混勻，瞬時(shí)離心；
[0019](4)把上述PCR管置于PCR儀上，執(zhí)行下述程序:94度，5分鐘；94度，60秒，55度，90秒，72度，90秒，循環(huán)35次；72度，5分鐘；程序結(jié)束；
[0020](5)把PCR管中的產(chǎn)物進(jìn)行6%的聚丙烯凝膠電泳或2.5%的瓊脂糖凝膠電泳，檢查不同待測(cè)樣品DNA PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的DNA條帶；
[0021 ] 本發(fā)明選擇了已知具有根瘤姆抗性的葡萄站木品種(包括Ric1、Boerner、V.Riparial81g等)和已知無(wú)根瘤蚜抗性的葡萄砧木品種(包括華佳8號(hào)、山葡萄、刺葡萄等)共計(jì)30余種進(jìn)行了試驗(yàn)，其中一次試驗(yàn)中(參見(jiàn)圖1 )，泳道I~3依次為華佳8號(hào)、山葡萄、刺葡萄；泳道4~6依次為Ric1、Boerner> V.Riparial81g,以上材料均米集于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃；
[0022](6)根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以確定，具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木能夠產(chǎn)生圖1中箭頭所示位置的特定大小(169bp)的DNA片段所形成的條帶，不具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木不能產(chǎn)生相應(yīng)的所示位置的特定大小DNA片段所形成的條帶；若加入了某一待檢測(cè)DNA的泳道有169bp這一特定大小的DNA條帶產(chǎn)生，則該待測(cè)樣品DNA為來(lái)源于具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木植株，若無(wú)特定大小(169bp)的DNA條帶產(chǎn)生，則該待測(cè)樣品DNA為來(lái)源于無(wú)根瘤蚜抗性的葡萄砧木植株。
[0023]采用無(wú)性繁殖的葡萄砧木可以用葉片、根系、莖段在任何季節(jié)提取DNA進(jìn)行檢測(cè)，取樣部位不影響檢測(cè)結(jié)果的一致性，取樣部位和取樣時(shí)間不影響檢測(cè)結(jié)果。
[0024]本發(fā)明可以用 于葡萄根瘤蚜抗性性狀的DNA分子標(biāo)記輔助選擇育種，用于葡萄根瘤蚜抗性育種中的抗性材料的早期選擇和非抗性材料的淘汰；同時(shí)，以該特定的DNA條帶為路標(biāo)，可以進(jìn)行葡萄根瘤蚜抗性基因的精細(xì)定位或通過(guò)染色體步移法接近葡萄根瘤蚜抗性基因，從而為葡萄根瘤蚜抗性基因的克隆打下基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鑒定方法，其特征在于:包括以下步驟: 以待檢測(cè)的葡萄砧木的DNA為模板，對(duì)與葡萄根瘤蚜抗性相連鎖的DNA分子標(biāo)記進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果中存在與所述DNA分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的DNA條帶，則說(shuō)明對(duì)應(yīng)的葡萄砧木具有葡萄根瘤蚜抗性，若電泳結(jié)果中不存在與所述DNA分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的DNA條帶，則說(shuō)明對(duì)應(yīng)的葡萄砧木不具有葡萄根瘤蚜抗性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鑒定方法，其特征在于:所述DNA分子標(biāo)記為微衛(wèi)星分子標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鑒定方法，其特征在于:所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增采用寡聚脫氧核苷酸序列SeqOl和Seq02作為引物對(duì)，SeqOl具有如SEQ.1D.N0.1所示的核苷酸序列，Seq02具有如SEQ.1D.N0.2所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鑒定方法，其特征在于:所述DNA條帶的大小為 169bp。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103937887SQ201410131800
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】張軍科, 張娟 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)