用于前列腺相關(guān)病癥的診斷、預(yù)后和治療的基于微rna的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了用于前列腺相關(guān)病癥的診斷、預(yù)后和/或治療的方法和組合物。特別地，本申請(qǐng)公開了一種方法，所述方法診斷受試者是否患有前列腺相關(guān)病癥或處于發(fā)生前列腺相關(guān)病癥的風(fēng)險(xiǎn)中，確定患有前列腺相關(guān)病癥的受試者的預(yù)后和/或治療患有前列腺相關(guān)病癥的受試者的前列腺相關(guān)病癥，所述方法包括：測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平；其中相對(duì)于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平，測(cè)試樣品中生物標(biāo)志物的水平的改變表示受試者患有所述病癥或處于發(fā)生所述病癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
【專利說(shuō)明】用于前列腺相關(guān)病癥的診斷、預(yù)后和治療的基于微RNA的
方法和組合物
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年2月27日、申請(qǐng)?zhí)枮?00980111708.1的同名申請(qǐng)的分
案申請(qǐng)。
[0002]交叉參考相關(guān)申請(qǐng)
[0003]本申請(qǐng)要求2009年2月27日提交的PCT申請(qǐng)PCT/US2009/035470 (其要求2008年2月28日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/067，518的優(yōu)先權(quán))的權(quán)益，其全部公開內(nèi)容明確地通過(guò)引用合并入本文。
[0004]關(guān)于聯(lián)邦政府支助的研究的聲明
[0005]本發(fā)明是在NIH, Nat1nal Cancer Institute, Center for Cancer Research 的內(nèi)部研究項(xiàng)目下由政府支助并且由Nat1nal Institutes of Health基金CA081534和CA128609支助進(jìn)行的。政府在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。
[0006]本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】和工業(yè)適用性
[0007]本發(fā)明總地說(shuō)來(lái)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明的某些方面包括在前列腺相關(guān)病癥的診斷、治療和預(yù)后中的應(yīng)用。
[0008]發(fā)明背景
[0009]不承認(rèn)本部分中公開的【背景技術(shù)】在法律上構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)。
[0010]來(lái)源于基因微陣列的表達(dá)特征譜已為前列腺癌的生物學(xué)提供了新的認(rèn)識(shí)。已使前列腺腫瘤中的mRNA表達(dá)模式與Gleason評(píng)分、侵襲性腫瘤亞型和疾病復(fù)發(fā)產(chǎn)生關(guān)聯(lián)(I ；2)。此外，來(lái)源于原發(fā)性腫瘤的mRNA表達(dá)特征(signature)已導(dǎo)致用于前列腺癌的早期檢測(cè)的新型候選診斷標(biāo)志物例如a-甲基?；?CoA消旋酶的發(fā)現(xiàn)(3)。此類發(fā)現(xiàn)證明，已切除的腫瘤的基因表達(dá)特征譜提供了鑒定前列腺癌的新型診斷和預(yù)后標(biāo)志物的可能。
[0011 ] 最近，已描述了稱為微RNA的新類型小RNA (4)，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和mRNA至蛋白質(zhì)的翻譯來(lái)調(diào)控mRNA功能(5 ；6)。微RNA基因表達(dá)為稱為pr1-mRNA的大前體RNA，其可編碼以多順反子排列的多個(gè)微RNA (7)。此類前體通過(guò)細(xì)胞核RNA酶III，Drosha以及細(xì)胞溶質(zhì)RNA酶III,Dicer轉(zhuǎn)變成19至25個(gè)核苷酸的成熟微RNA。這兩種酶和它們的輔因子例如DGCR8/Pasha、TRBP和EIF2C2/argonaute_2是微RNA加工活性的至關(guān)重要的組分。改變它們的表達(dá)水平可改變細(xì)胞功能和誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(8)。
[0012]已證明微RNA在癌癥中的決定性作用(9)。它們的表達(dá)在實(shí)體人腫瘤中通常發(fā)生改變(10-13)。微RNA表達(dá)特征譜還通過(guò)發(fā)育譜系和分化狀態(tài)來(lái)分類腫瘤(10; 14)。已顯示多個(gè)微RNA具有致癌性質(zhì)(15-17)，或如腫瘤抑制基因一樣起作用(18 ；19)。此類微RNA稱為onComiR(20)。它們的表達(dá)的改變與癌癥發(fā)生具有因果關(guān)聯(lián)。
[0013]盡管對(duì)治療此類疾病的療法進(jìn)行了相當(dāng)多的研究，但仍然難以有效地診斷和治療它們，并且在患者中觀察到的死亡率表明，需要改進(jìn)前列腺癌的診斷、治療和預(yù)防。
[0014]概述
[0015]在第一個(gè)廣泛的方面，本文中描述了診斷受試者是否具有前列腺相關(guān)病癥或處于發(fā)展前列腺相關(guān)病癥的風(fēng)險(xiǎn)中，確定患有前列腺相關(guān)病癥的受試者的預(yù)后和/或治療患有前列腺相關(guān)病癥的受試者的前列腺相關(guān)病癥的方法，其包括:測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平，其中相對(duì)于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平，測(cè)試樣品中生物標(biāo)志物的水平的改變表示受試者患有所述病癥或處于發(fā)展所述病癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0016]在某些實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平低于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平。
[0017]在某些實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平高于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平。
[0018]在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)生物標(biāo)志物在腫瘤組織與非腫瘤組織之間差異表達(dá)，并且為圖11-表2中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體。
[0019]在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖11-表2中所列的在前列腺腫瘤中上調(diào)的一個(gè)或多個(gè)HiiR或其功能性變體:miR-32、miR-182、miR-31、miR-26a_l/2、miR-200c、miR-375、miR-196a_l/2、miR-370、miR-425、miR-194-1/2、miR-181a_l/2、miR-34b、let_71、miR-188、miR-25、miR_106b、miR-449、miR_99b、miR-93、miR-92-1/2、miR-125a。 [0020]在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖11-表2中所列的在前列腺癌中下調(diào)的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-520h、miR-494、miR-490、miR-133a_l、miR-1-2、miR-218-2、miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR_34a、miR-487、let_7b。
[0021]在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)生物標(biāo)志物與前列腺外疾病相關(guān)，并且選自圖12-表3中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-101-l/2、miR_200a、miR_200b、miR-196a-l/2、miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186、miR-195、let_7f_2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
[0022]在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)生物標(biāo)志物顯示miR-1與前列腺腫瘤中靶基因轉(zhuǎn)錄物水平之間的負(fù)相關(guān)，并且選自圖13A-表4A中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
[0023]在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖13B-表4B中所列的一個(gè)或多個(gè) miR 或其功能性變體:miR-l、miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、miR_181a、miR-182、miR-194、miR-196a、miR-200c、miR-218-2、miR-220、miR-329、miR-338、miR_369、miR-409-3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR-520h 和 let_7i。
[0024]在某些實(shí)施方案中，所述方法包括顯示與前列腺腫瘤中miR_181a呈負(fù)相關(guān)的探針組，其中探針組包括圖14-表5中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
[0025]在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)生物標(biāo)志物是雄激素應(yīng)答生物標(biāo)志物，并且選自圖15-表6中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-338、miR-126-5p、mir-181b-l簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。
[0026]在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖16-表7中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-126、miR_146b、miR_146b、miR-181b_l、miR-181b_l、miR-181b_l、miR-181b-l、miR-181b_l、miR_181c、miR_181c、miR-219-1、miR-219-1、miR-219-1、miR-221、miR-221、miR-221、miR-221、miR-338、miR-338。
[0027]在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖23-表9中所列的在前列腺癌中在具有神經(jīng)周浸潤(rùn)(perineural invas1n)的腫瘤中上調(diào)的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-224、miR-21、miR-?Ο (a/b)、miR_125b (-1/2)、miR-30a/b/c_2/d、miR-100、miR-24(-l/2)、miR-15a_2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、miR-26a (-1/2)、miR-126、miR-145、miR-195、miR-181a-l、miR-199b、miR-151、let_7g。
[0028]在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)生物標(biāo)志物在PNT腫瘤組織與非PNT腫瘤組織之間差異表達(dá)，并且是圖24-表12中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
[0029]在某些實(shí)施方案中，所述方法包括:Dicer和DGCR8 (在前列腺腫瘤中)和/或編碼argonuate-2的EIF2C2和Dicer (在具有高Gleason評(píng)分的腫瘤中)中的一個(gè)或多個(gè)的增加的表達(dá)。
[0030]在某些實(shí)施方案中，樣品包括血液樣品。
[0031]在某些實(shí)施方案中，樣品包括血清或血漿血液樣品的一種或多種。
[0032]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)在腫瘤組織與非腫瘤組織之間差異表達(dá)的生物標(biāo)志物，并且是圖11-表2中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體。
[0033]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)選自下列的生物標(biāo)志物:圖11-表2中所列的在前列腺腫瘤中上調(diào)的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-32、miR-182、miR-31、miR-26a_l/2、miR_200c、miR-375、miR-196a_l/2、miR-370、miR-425、miR-194-1/2、miR-181a_l/2、miR_34b、let_71、miR-188、miR-25、miR_106b、miR-449、miR_99b、miR-93、miR-92-1/2、miR_125a。
[0034]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)選自下列的生物標(biāo)志物:圖11-表2中所列的在前列腺腫瘤中下調(diào)的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR_520h、miR-494、miR-490、miR-133a_l、miR-1-2、miR-218-2、miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR_34a、miR-487、let_7b。
[0035]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)與前列腺外疾病相關(guān)且選自下列的生物標(biāo)志物:圖12-表3中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-101-1/2、miR_200a、miR_200b、miR-196a_l/2、miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186、miR-195、let_7f_2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
[0036]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物，其包含圖13A-表4A中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
[0037]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物，其選自圖13B-表4B中所列的一個(gè)或多個(gè) miR 或其功能性變體miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、miR_181a、miR-182、miR-194、miR-196a、miR-200c、miR-218-2、miR-220、miR-329、miR-338、miR_369、miR-409-3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR_520h 和 let_7i。
[0038]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物，其包含在前列腺腫瘤中顯示與miR-181a呈負(fù)相關(guān)的探針組，其中所述探針組包括圖14-表5中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
[0039]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)為雄激素應(yīng)答生物標(biāo)志物并且選自下列的生物標(biāo)志物:圖15-表6中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-338、miR-126-5p、mir-181b-l 簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。[0040]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)選自下列的生物標(biāo)志物:圖16-表7中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-126、miR_146b、miR_146b、miR-181b-l、 miR-181b_l、 miR-181b_l、 miR-181b_l、 miR-181b_l、 miR_181c、 miR_181c、miR-219-1、miR-219-1、miR-219-1、miR-221、miR-221、miR-221、miR-221、miR-338、miR-338o
[0041]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)選自下列的生物標(biāo)志物:圖23-表9中所列的在前列腺癌中在具有神經(jīng)周浸潤(rùn)的腫瘤中上調(diào)的一個(gè)或多個(gè)miR 或其功能性變體:miR-224、miR-21、miR_10(a/b)、miR_125b (-1/2)、miR-30a/b/c_2/d、miR-100、miR-24(_l/2)、miR-15a_2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、miR_26a (-1/2)、miR-126、miR-145、miR-195、miR-181a-l、miR-199b、miR-151、let_7g。
[0042]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物,其包含至少一個(gè)在PNT腫瘤組織與非PNT腫瘤組織之間差異表達(dá)并且是圖24-表12中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體的生物標(biāo)志物。
[0043]在另一個(gè)方面，本文中描述了生物標(biāo)志物，其包括Dicer和DGCR8 (在前列腺腫瘤中)和/或編碼argonuate-2的EIF2C2和Dicer (在具有高Gleason評(píng)分的腫瘤中)中的一個(gè)或多個(gè)的增加的表達(dá)。
[0044]在另一個(gè)方面，本文中描述了前列腺腫瘤中獨(dú)特的微RNA表達(dá)特征，其包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)控腫瘤微RNA加工的生物標(biāo)志物的表達(dá)的改變。
[0045]在另一個(gè)方面，本文中描述了影響前列腺中靶mRNA的轉(zhuǎn)錄物豐度和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其包括使有此需要的受試者中一個(gè)或多個(gè)微RNA失調(diào)。
[0046]在某些實(shí)施方案中，所述方法括抑制癌癥相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0047]在某些實(shí)施方案中，所述方法包括改變miR-32和miR_106b中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)以抑制癌癥相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0048]在另一個(gè)方面，本文中描述了微RNA和編碼蛋白質(zhì)的RNA的大規(guī)模基因表達(dá)特征譜分析用于鑒定在人前列腺腫瘤中發(fā)生的微RNA功能的改變的用途。
[0049]在另一個(gè)方面，本文中描述了前列腺相關(guān)病癥的腫瘤基因特征，包括:下列中的一個(gè)或多個(gè):上調(diào)的 miR-32,然后 miR-182，miR-31, miR_26a，miR_200c，miR_196a ;和miR-106b-25簇；和/或下列中的一個(gè)或多個(gè):顯著下調(diào)的miR_520h，miR-494, miR-490和miR-1-133a 簇。
[0050]在另一個(gè)方面,本文中描述了以低誤差邊際(margin of error)與前列腺外疾病擴(kuò)展相關(guān)的腫瘤特征，其包括miR-ΙΟ?。
[0051]在某些實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物包括在前列腺腫瘤中增加的前列腺中的宿主基因表達(dá)。
[0052]在某些實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物包括下列中的一個(gè)或多個(gè):被上調(diào)并且其表達(dá)分別與內(nèi)含子微RNA，miR-32和miR-106b_25簇的表達(dá)相關(guān)的C9orf5和MCM7。
[0053]在另一個(gè)方面，本文中描述了 miR-106b靶向前列腺癌細(xì)胞中E2F1和/或⑶KNlA基因和/或用于抑制E2F1和/或CDKNlA基因的蛋白質(zhì)表達(dá)的用途。
[0054] 在另一個(gè)方面，本文中描述了通過(guò)改變前列腺癌細(xì)胞中miR-Ι的表達(dá)進(jìn)行的XP06和PTK9中的一個(gè)或多個(gè)的調(diào)控。[0055]在另一個(gè)方面，本文中描述了微RNA與3’ UTR序列的結(jié)合導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞中靶mRNA的降解和/或積累的用途。
[0056]在另一個(gè)方面，本文中描述了人組織中微RNA與mRNA之間的負(fù)相關(guān)和/或正相關(guān)用于預(yù)測(cè)微RNA的靶基因的用途。
[0057]在另一個(gè)方面，本文中描述了用于鑒定受微RNA調(diào)控的mRNA的方法，其包括進(jìn)行人組織中的微RNA和mRNA表達(dá)的相關(guān)分析。
[0058]在另一個(gè)方面，本文中描述了包含miR-32和miR-106b中的一個(gè)或多個(gè)的miR表達(dá)反義抑制劑。
[0059]在另一個(gè)方面，本文中描述了前列腺病癥或疾病的oncomiR生物標(biāo)志物，其包括:miR-Ι、miR-32 和 mir-106b_25 簇中的一個(gè)或多個(gè)。
[0060]在另一個(gè)方面，本文中描述了用于調(diào)控前列腺癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其包括調(diào)控前列腺癌細(xì)胞中的miR-Ι、miR-32和mir-106b_25簇中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)。
[0061]在另一個(gè)方面，本文中描述了用于抑制前列腺癌細(xì)胞中輸出蛋白-6(exportin_6)和PTK9中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)的組合物，所述組合物包含miR-Ι或其功能性變體。
[0062]在另一個(gè)方面，本文中描述了用于調(diào)控有此需要的受試者中E2F1和p21/WAFl蛋白水平的一個(gè)或多個(gè)的方法，其包括使用miR-106b或其功能性變體。
[0063]在另一個(gè)方面，本文中描述了包含反義miR_106b的組合物，其用于增加有此需要的受試者中前列腺癌細(xì)胞中P21/WAF1和/或E2F1的蛋白水平。
[0064]在某些實(shí)施方案中，所述方法包括確定患有前列腺癌的受試者的預(yù)后，其包括測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平，其中:i)生物標(biāo)志物與前列腺癌中不利的預(yù)后相關(guān)；和ii)相對(duì)于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平，前列腺測(cè)試樣品中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平的改變表示不利的預(yù)后。
[0065]在某些實(shí)施方案中，所述方法包括診斷受試者是否患有前列腺癌或處于發(fā)生前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中，包括:(1)從獲自受試者的測(cè)試樣品反轉(zhuǎn)錄RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；(2)將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供測(cè)試樣品的雜交特征譜；和(3)將測(cè)試樣品雜交特征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較，其中至少一個(gè)miRNA的信號(hào)的改變表示受試者患有前列腺癌或處于發(fā)生前列腺癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0066]在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)，至少一個(gè)miRNA的信號(hào)下調(diào)，和/或其中相對(duì)于從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)，至少一個(gè)miRNA的信號(hào)上調(diào)。
[0067]在某些實(shí)施方案中，選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的組的至少一個(gè)生物標(biāo)志物的信號(hào)的改變表示受試者患有具有不利預(yù)后的前列腺癌或處于發(fā)生所述癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0068]在另一個(gè)方面，本文中描述了治療患有前列腺癌的受試者的前列腺癌的方法，在所述前列腺癌中至少一個(gè)生物標(biāo)志物在受試者的癌細(xì)胞中相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞下調(diào)或上調(diào)，所述方法包括:(I)當(dāng)至少一個(gè)生物標(biāo)志物在癌細(xì)胞中下調(diào)時(shí)，給受試者施用有效量的至少一個(gè)分離的生物標(biāo)志物，或其分離的變體或生物學(xué)活性片段，以便受試者中癌細(xì)胞的增殖被抑制；或(2)當(dāng)至少一個(gè)生物標(biāo)志物在癌細(xì)胞中上調(diào)時(shí)，給受試者施用有效量的至少一種抑制至少一個(gè)生物標(biāo)志物的表達(dá)的化合物，以便受試者中癌細(xì)胞的增殖被抑制。[0069]在另一個(gè)方面，本文中描述了治療受試者的前列腺癌的方法，其包括:(1)測(cè)定相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的量；和(2)通過(guò):(i)如果癌細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量低于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量，給受試者施用有效量的至少一個(gè)分離的生物標(biāo)志物；或Qi)如果癌細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量高于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制至少一個(gè)生物標(biāo)志物的表達(dá)的化合物來(lái)改變前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量。
[0070]在另一個(gè)方面，本文中描述了用于治療前列腺癌的藥物組合物，其包含至少一個(gè)分離的生物標(biāo)志物和可藥用載體。
[0071]在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包括其中至少一個(gè)分離的生物標(biāo)志物相應(yīng)于相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞在前列腺癌細(xì)胞中下調(diào)的生物標(biāo)志物。
[0072]在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一個(gè)miR表達(dá)抑制劑化合物和可藥用載體。
[0073]在另一個(gè)方面，本文中描述了鑒定抗前列腺癌試劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑和測(cè)量與前列腺癌細(xì)胞中減少的表達(dá)水平相關(guān)的至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平，其中相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，細(xì)胞中生物標(biāo)志物的水平的增加表示測(cè)試試劑是抗前列腺癌試劑。
[0074]在另一個(gè)方面，本文中描述了鑒定抗前列腺癌試劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑和測(cè)量與前列腺癌 細(xì)胞中增加的表達(dá)水平相關(guān)的至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平，其中相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，細(xì)胞中生物標(biāo)志物的水平的減少表示測(cè)試試劑是抗前列腺癌試劑。
[0075]在另一個(gè)方面，本文中描述了評(píng)估療法預(yù)防、診斷和/或治療前列腺癌相關(guān)疾病的有效性的方法，其包括:i)使動(dòng)物經(jīng)歷其有效性有待評(píng)估的療法，和ii)通過(guò)估計(jì)表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物來(lái)測(cè)定測(cè)試的療法在治療或預(yù)防疾病中的有效性水平。
[0076]在某些實(shí)施方案中，候選治療劑包括:藥物組合物、營(yíng)養(yǎng)組合物(nutraceuticalcomposit1n)和順勢(shì)療法組合物中的一種或多種。
[0077]在某些實(shí)施方案中，待評(píng)估的療法用于人受試者。
[0078]在另一個(gè)方面，本文中描述了制品，其包含:至少一個(gè)結(jié)合前列腺癌相關(guān)疾病的標(biāo)志物的捕獲試劑，所述標(biāo)志物包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物。
[0079]在另一個(gè)方面，本文中描述了用于篩選治療前列腺癌相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中試劑盒包括:表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物的一個(gè)或多個(gè)試劑和表達(dá)至少一個(gè)生物標(biāo)志物的細(xì)胞。
[0080]在某些實(shí)施方案中，使用包含特異性結(jié)合至少一個(gè)生物標(biāo)志物的抗體或抗體片段的試劑檢測(cè)生物標(biāo)志物的存在。
[0081]在另一個(gè)方面，本文中描述了干擾前列腺癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的試劑用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個(gè)體中疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度，其中試劑包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物。
[0082]在另一個(gè)方面，本文中描述了治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限定有此需要的個(gè)體中前列腺癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度的方法，其包括:給個(gè)體施用干擾至少前列腺癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑，其中試劑包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物。
[0083]在另一個(gè)方面，本文中描述了干擾至少前列腺癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限定個(gè)體中前列腺癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度，其中試劑包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物。
[0084]在另一個(gè)方面，本文中描述了包含miR-Ι、miR-32和miR-106b中的一個(gè)或多個(gè)的反義抑制劑的組合物。
[0085]在另一個(gè)方面，本文中描述了治療有此需要的受試者的前列腺病癥的方法，其包括給受試者施用治療有效量的組合物。
[0086]在某些實(shí)施方案中，預(yù)防性施用組合物。
[0087]在某些實(shí)施方案中，組合物的施用延遲病癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀的發(fā)作。
[0088]在某些實(shí)施方案中，肽的施用抑制前列腺癌的發(fā)生。
[0089]在某些實(shí)施 方案中，肽的施用抑制腫瘤生長(zhǎng)。
[0090]在某些實(shí)施方案中，肽的施用抑制感染。
[0091 ] 在另一個(gè)方面，本文中描述了用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中前列腺癌的存在的方法，該方法包括:a)將懷疑包含前列腺癌的生物學(xué)樣品暴露于為此的標(biāo)志物；和《如果有的話，檢測(cè)樣品中標(biāo)志物的存在或不存在。
[0092]在某些實(shí)施方案中，標(biāo)志物包括可檢測(cè)標(biāo)記。
[0093]在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括將來(lái)自受試者的生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量與來(lái)自正常受試者的相應(yīng)生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量相比。
[0094]在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括在不同時(shí)間點(diǎn)從受試者收集多個(gè)生物學(xué)樣品和比較各生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量以確定標(biāo)志物的量在一段時(shí)間內(nèi)在受試者中是增加還是減少。
[0095]在另一個(gè)方面，本文中描述了治療受試者中的前列腺癌的方法，該方法包括:給有此需要的受試者施用治療有效量的前列腺受體激動(dòng)劑。
[0096]在某些實(shí)施方案中，受體激動(dòng)劑是:miRl、miR-21和miR_106b中的一個(gè)或多個(gè)的反義抑制劑。
[0097]在另一個(gè)方面，本文中描述了制造用于治療前列腺癌的藥物的用途，其由選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中顯示的miR、來(lái)源于其的序列、來(lái)自此類miR的互補(bǔ)序列和來(lái)源于這樣的互補(bǔ)序列的序列的核酸分子組成。
[0098]在某些實(shí)施方案中，所述用途包括其中藥物包含存在選自:表2中所列的miR、來(lái)源于此類miR的序列、此類miR的互補(bǔ)序列和來(lái)源于這樣的互補(bǔ)序列的序列的序列的核酸分子。
[0099]在另一個(gè)方面，本文中描述了鑒定誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的分化的有效治療劑或治療劑的組合的體外方法，該方法包括步驟:i)培養(yǎng)來(lái)源于前列腺腫瘤的細(xì)胞，ii)向細(xì)胞系的培養(yǎng)基中加入至少一種化合物，iii)分析步驟(i)與(ii)之間至少一個(gè)miR的表達(dá)水平的變化和iv)鑒定誘導(dǎo)步驟(i)與(ii)之間miR的表達(dá)水平的改變的化合物或化合物的組合。
[0100]在某些實(shí)施方案中，步驟(iii)包括分析至少一個(gè)miR的表達(dá)水平。
[0101]在某些實(shí)施方案中，步驟(iv)包括鑒定調(diào)控至少一個(gè)miR的表達(dá)水平的化合物或化合物的組合。
[0102]在某些實(shí)施方案中，步驟(iv)包括鑒定減少至少一個(gè)miR的表達(dá)水平的化合物或化合物的組合。
[0103]在某些實(shí)施方案中，化合物是治療癌癥的治療劑。
[0104]在另一個(gè)方面，本文中描述了用于分類來(lái)自受試者的前列腺組織的方法，其包括:a)測(cè)量測(cè)試細(xì)胞群體中選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的組的一個(gè)或多個(gè)核酸序列的表達(dá)，其中所述測(cè)試細(xì)胞群體中至少一個(gè)細(xì)胞能夠表達(dá)選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的組的一個(gè)或多個(gè)核酸序列；b)將核酸序列的表達(dá)與包含至少一個(gè)已知其前列腺癌分類的細(xì)胞的參照細(xì)胞群體中核酸序列的表達(dá)相比較；和c)如果存在，鑒定測(cè)試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體中選自所述組的一個(gè)或多個(gè)核酸序列的表達(dá)水平的差異，從而分類受試者的前列腺癌。
[0105]在某些實(shí)施方案中，與參照細(xì)胞群體相比較，測(cè)試細(xì)胞群體中核酸的表達(dá)的差異表示測(cè)試細(xì)胞群體具有與來(lái)自參照細(xì)胞群體的細(xì)胞不同的分類。
[0106]在某些實(shí)施方案中，與參照細(xì)胞群體相比較，測(cè)試細(xì)胞群體中核酸的相似表達(dá)模式表示測(cè)試細(xì)胞群體具有與來(lái)自參照細(xì)胞群體的細(xì)胞相同的分類。
[0107]在某些實(shí)施方案中，參照細(xì)胞群體是多個(gè)細(xì)胞或數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0108]在某些實(shí)施方案中，參照細(xì)胞群體選自:分類為來(lái)自正常前列腺組織的細(xì)胞群體的參照細(xì)胞群體、分類為來(lái)自良性前列腺組織的細(xì)胞群體的參照細(xì)胞群體和分類為來(lái)自惡性前列腺組織的細(xì)胞群體的參照細(xì)胞群體。
[0109]當(dāng)根據(jù)附圖進(jìn)行閱讀時(shí)，根據(jù)下列優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯然。
[0110]附圖概述
[0111]本專利或申請(qǐng)文件可包括一個(gè)或多個(gè)以彩色制成的圖和/或一個(gè)或多個(gè)照片。具有彩色附圖和/或照片的本專利或?qū)＠暾?qǐng)公開案的拷貝將應(yīng)請(qǐng)求且支付必要的費(fèi)用后由專利局(Patent Office)提供。
[0112]圖1A-1B:前列腺組織中微RNA與它們各自的靶mRNA的轉(zhuǎn)錄物豐度之間的關(guān)系的分析。顯示了 mRNA與miR-106b之間(圖1A)以及mRNA與miR_181a之間(圖1B)的Pearson相關(guān)系數(shù)的全局分布。黑色曲線顯示所有mRNA的相關(guān)系數(shù)的分布。紅色曲線只顯示為mi R-106b或miR-181a的預(yù)測(cè)的靶的mRNA的相關(guān)系數(shù)分布。紅色曲線具有表示其轉(zhuǎn)錄物水平與微RNA的轉(zhuǎn)錄物水平呈負(fù)相關(guān)的靶mRNA的富集的額外的肩(箭頭)。
[0113]圖2A-2B:miR-l和miR-106b對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制。用微RNA前體(miR-Ι和miR-106b)或反義微RNA (反義miR-Ι和反義miR_106b)或它們各自的載體對(duì)照、亂序的前體微RNA(亂序的-P)和亂序的反義微RNA(亂序的-A)轉(zhuǎn)染LNCaP和PC-3人前列腺癌細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)制備蛋白質(zhì)提取物,通過(guò)Western印跡分析檢查蛋白質(zhì)表達(dá)。上樣:50 μ g蛋白質(zhì)/泳道。
[0114]圖3A-3B:miR-106b通過(guò)3’UTR介導(dǎo)的機(jī)制抑制E2F1蛋白質(zhì)表達(dá)。[0115]圖3A:用微RNA前體(miR-106b)或反義微RNA (反義miR_106b)或它們各自的載體對(duì)照、亂序的前體微RNA (亂序的-P)和亂序的反義微RNA (亂序的-A)轉(zhuǎn)染LNCaP和PC-3人前列腺癌細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)制備蛋白質(zhì)提取物，通過(guò)Western印跡分析檢查蛋白質(zhì)表達(dá)。為了獲得相對(duì)強(qiáng)度值，將E2F1表達(dá)相對(duì)于β_肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0116]圖3Β:將包含E2F1基因中的miR-106b的野生型或突變體3’^1?靶序列的？61^3螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體與前體微RNA陰性對(duì)照或miR-106b前體共轉(zhuǎn)染入LNCaP細(xì)胞(各自n=3)。為了比較，還用不包含3’UTR的pGL3對(duì)照載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞提取物中螢光素酶的活性。在野生型E2F13’UTR存在的情況下，使用前體miR-106b的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致螢光素酶報(bào)告基因的顯著抑制(與載體對(duì)照相比較)(P=0.045，雙側(cè)t檢驗(yàn))。
[0117]圖3C-3D:miR-32通過(guò)3’UTR介導(dǎo)的機(jī)制抑制Bim蛋白的表達(dá)。
[0118]圖3C:用微RNA前體(miR-32)或反義微RNA (反義miR-32)或它們各自的載體對(duì)照、亂序的前體微RNA (亂序的-P)和亂序的反義微RNA (亂序的-A)轉(zhuǎn)染LNCaP和PC-3人前列腺癌細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)制備蛋白質(zhì)提取物，通過(guò)Western印跡分析檢查蛋白質(zhì)表達(dá)。為了獲得相對(duì)強(qiáng)度值，將Bim的表達(dá)相對(duì)于β_肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0119]圖3D:將包含BCL2L11 (Bim)基因中的miR-32的野生型或突變體3’UTR靶序列的PGL3螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體與前體微RNA陰性對(duì)照或miR-32前體共轉(zhuǎn)染入LNCaP細(xì)胞(各自n=3)。為了比較，還用不包含3’UTR的pGL3對(duì)照載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞提取物中螢光素酶的活性。在野生型BCL2L113’UTR存在的情況下，使用miR-32的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致螢光素酶報(bào)告基因的顯著抑制(與載體對(duì)照相比較)(P=0.003，雙側(cè)t檢驗(yàn))。如果報(bào)告基因構(gòu)建體包含miR的突變體3’ UTR靶序列，抑制被減弱。
[0120]圖4A-4B =DICER(圖 4A)和 DGCR8 (圖 4B)的定量 RT-PCR 表達(dá)分析。
[0121]圖5A-5D:來(lái)自前列腺癌患者的非腫瘤前列腺組織(正常)和腫瘤(腫瘤)中miR-32 (圖 5A)、miR_106b (圖1B)、miR_106a (圖 5C)和 miR-1 (圖 5D)的定量 RT-PCR 表達(dá)分析。將單個(gè)樣品的相對(duì)微RNA表達(dá)值和樣品組的平均值作圖。MiR-32、miR-106b和miR_106a在腫瘤中的表達(dá)顯著高于在非腫瘤組織中的表達(dá):P=0.037(雙側(cè)t檢驗(yàn))(對(duì)于miR-32)；P=0.009 (雙側(cè) t 檢驗(yàn))(對(duì)于 miR-106b) ；P=0.015 (雙側(cè) t 檢驗(yàn))(對(duì)于 miR_106a)。
[0122]圖6:前列腺腫瘤中XP06與miR-Ι轉(zhuǎn)錄物水平之間的關(guān)系。
[0123]圖7:miR-106b通過(guò)CDKNlA(p21/WAFl)3’UTR-介導(dǎo)的機(jī)制抑制螢光素酶報(bào)告基因的活性。
[0124]圖8A-8B:抗癌藥物處理的細(xì)胞中miR簇對(duì)胱天蛋白酶-3/胱天蛋白酶_7活化的顯著抑制。
[0125]圖9A9B:成熟miR-338和miR-221的qRT-PCR分析顯示它們的表達(dá)水平受雄激素調(diào)控。
[0126]圖10:表1:研究群體的臨床特征。
[0127]圖11:表2:在腫瘤與非腫瘤組織之間差異表達(dá)的微RNA。
[0128]圖12:表3:與前列腺外疾病相關(guān)的微RNA。
[0129]圖13A:表4A:前列腺腫瘤中miR-Ι與靶基因轉(zhuǎn)錄物水平之間的負(fù)相關(guān)。
[0130]圖13B:表4B:前列腺腫瘤的37-探針組PAM預(yù)測(cè)物。
[0131]圖14:表5:在前列腺腫瘤中與miR_181a呈負(fù)相關(guān)的miR_181a的靶基因。[0132]圖15:表6:雄激素應(yīng)答性微RNA。
[0133]圖16:表7 -M RNA的側(cè)翼序列中假定的雄激素受體結(jié)合位點(diǎn)。
[0134]圖17-17B:基于235個(gè)微RNA的表達(dá)的57個(gè)前列腺腫瘤的無(wú)監(jiān)督層次聚類分析。
[0135]圖17A:微RNA表達(dá)產(chǎn)生具有不同微RNA特征譜的兩個(gè)主要簇，簇#1包含所有非PNI腫瘤。
[0136]圖17B:根據(jù)兩個(gè)簇間的PNI狀態(tài)產(chǎn)生的腫瘤的非隨機(jī)分布(P=0.002;雙側(cè)Fisher’s精確檢驗(yàn))。
[0137]圖18:富集差異表達(dá)的基因(比較PNI腫瘤與非PNI腫瘤)的基因本體論生物過(guò)程(Gene Ontology B1logical Process)的聚類分析。聚類分析的結(jié)果顯示于熱圖中，為了進(jìn)行特定的比較例如PNI腫瘤對(duì)非PNI腫瘤(“神經(jīng)周浸潤(rùn)”)，用紅色標(biāo)示生物過(guò)程例如類花生酸代謝中差異表達(dá)的基因的富集。熱圖還顯示關(guān)于高(7-9)Gleason評(píng)分對(duì)低(5_6)Gleason評(píng)分比較(“Gleason總評(píng)分”)、pT3對(duì)pT2比較(“病理分期”)和陽(yáng)性對(duì)陰性前列腺外擴(kuò)展比較(“前列腺外擴(kuò)展”)的聚類分析。分析顯示，基因表達(dá)差異是非隨機(jī)的并且產(chǎn)生關(guān)于4個(gè)比較的頻繁受影響的生物過(guò)程的獨(dú)特模式。放大的聚類顯示，獨(dú)特地富集差異表達(dá)的基因(比較PNI腫瘤與非PNI腫瘤)的生物過(guò)程。類花生酸代謝、脂質(zhì)代謝和軸突生成也富集差異表達(dá)的基因(比較ΡΤ3與ρΤ2)。
[0138]圖19A-19D:通過(guò)免疫組織化學(xué)顯示的前列腺腫瘤中金屬硫蛋白的表達(dá)。小圖顯示腫瘤上皮中金屬硫蛋白表達(dá)的實(shí)例。相同腫瘤中，遠(yuǎn)離神經(jīng)元的癌細(xì)胞中金屬硫蛋白的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)顯著(圖19Α)，神經(jīng)周圍的癌細(xì)胞中該表達(dá)不存在(圖19Β)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞靠近神經(jīng)時(shí)，金屬硫蛋白的表達(dá)減少(圖19C，19D)。箭頭和“N”標(biāo)示褐色染色的神經(jīng)干的位置。復(fù)染:甲基綠。
[0139] 圖20A-20D:通過(guò)免疫組織化學(xué)顯示的前列腺腫瘤中柯薩奇腺病毒受體的表達(dá)。小圖顯示腫瘤上皮中受體表達(dá)的實(shí)例。在相同腫瘤中，遠(yuǎn)離神經(jīng)元的癌細(xì)胞中(圖20A)和神經(jīng)周圍的癌細(xì)胞中(圖20B)受體的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色。在神經(jīng)周圍的癌細(xì)胞中(圖20C，20D)柯薩奇腺病毒受體的表達(dá)減少。N:神經(jīng)干。復(fù)染:甲基綠。
[0140]圖21A-21D:通過(guò)原位雜交顯示的前列腺腫瘤中的miR-224。顯示了腫瘤上皮中miR-224的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的代表性實(shí)例。粒狀褐色染色顯示miR-224的存在。大多數(shù)腫瘤對(duì)于miR-224顯示微弱的標(biāo)記(圖21A)。在腫瘤的亞組中，在神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中觀察到中等至強(qiáng)的miR-224標(biāo)記(圖21B，21C，21D)。N=神經(jīng)干。復(fù)染:蘇木精。
[0141]圖22:表8:神經(jīng)周浸潤(rùn)(PNI)研究群體的臨床特征。
[0142]圖23-表9:在具有PNI的腫瘤中上調(diào)的微RNA(FDR ( 10%)。
[0143]圖24-表10:在PNI與非PNI腫瘤之間具有差異表達(dá)的編碼蛋白質(zhì)的RNA。
[0144]圖25-表11:通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行的對(duì)選擇的基因的微陣列結(jié)果的驗(yàn)證。
[0145]圖26-表12:最顯著富集差異表達(dá)的基因(比較PNI腫瘤與非PNI腫瘤)的生物過(guò)程。
[0146]發(fā)明詳述
[0147]在整個(gè)本公開內(nèi)容中，通過(guò)標(biāo)識(shí)引用來(lái)引用各種公開物、專利和公開的專利說(shuō)明書。這些公開物、專利和公開的專利說(shuō)明書的公開內(nèi)容通過(guò)引用合并入本公開內(nèi)容以更全面地描述本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)。[0148]在詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限定于特定的制劑或過(guò)程參數(shù)，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然可以變化。還應(yīng)理解，本文中使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述本發(fā)明的特定實(shí)施方案，而不期望是限定性的。
[0149]雖然在本發(fā)明的實(shí)施中可使用與本文中描述的方法和材料相似或等價(jià)的許多方法和材料，但優(yōu)選的材料和方法描述于本文中。
[0150]微RNA是調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)的小非編碼RNA。為了估計(jì)前列腺癌中微RNA的參與，我們測(cè)定60個(gè)原發(fā)性前列腺腫瘤和16個(gè)非腫瘤前列腺組織中微RNA和mRNA的基因組范圍的表達(dá)。
[0151]微RNA表達(dá)隨前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展而變化。一些此類微RNA在前列腺癌細(xì)胞中調(diào)控癌癥相關(guān)基因的表達(dá)。
[0152]如在本文中可互換使用的，“miR基因產(chǎn)物”、“微RNA”、“miR”或“miRNA”是指來(lái)自miR基因的未加工的或已加工的RNA轉(zhuǎn)錄物。
[0153]如本文中所使用的，“生物標(biāo)志物”可包括一個(gè)或多個(gè)“miR基因產(chǎn)物”、“微RNA”、“miR”或“miRNA”或編碼蛋白質(zhì)的RNA。
[0154]可通過(guò)天然加工途徑(例如使用完整的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物)或通過(guò)合成加工途徑(例如使用分離的加工酶，例如分離的Dicer、Argonaut或RNA酶III)從miR前體獲得具有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。應(yīng)理解，還可通過(guò)生物或化學(xué)合成(而不用從miR前體加工)直接產(chǎn)生具有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。當(dāng)在本文中通過(guò)名稱提及微RNA時(shí)，除非另外指出，否則所 述名稱相應(yīng)于前體和成熟形式。
[0155]本發(fā)明包括診斷受試者是否患有前列腺相關(guān)病癥或處于發(fā)生前列腺相關(guān)病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的方法。如本文中使用的，“受試者”可以是患有或懷疑患有前列腺癌的任何哺乳動(dòng)物。
[0156]mRNA分析顯示，微RNA加工的至關(guān)重要的組分和數(shù)個(gè)微RNA宿主基因例如MCM7和C9orf5在前列腺腫瘤中顯著上調(diào)。與這些發(fā)現(xiàn)一致，腫瘤以比非腫瘤前列腺顯著更高的水平表達(dá)定位至MCM7的內(nèi)含子13的miR-106b-25簇和定位至C9orf5的內(nèi)含子14的miR-32。
[0157]其他微RNA包括miR-106b_25簇同源物和miR-l_133a簇的表達(dá)水平在前列腺腫瘤中也發(fā)生改變。
[0158]在器官局限性腫瘤與具有前列腺外疾病擴(kuò)展的腫瘤之間發(fā)現(xiàn)另外的微RNA豐度的差異。
[0159]此外，我們還發(fā)現(xiàn)，微RNA的失調(diào)影響前列腺中編碼蛋白質(zhì)的靶基因的轉(zhuǎn)錄物豐度。
[0160]在細(xì)胞培養(yǎng)物中，E2F1和p21/WAFl被鑒定為miR_106b的靶，Bim為miR-32的靶，以及輸出蛋白-6和PTK9為miR-Ι的靶。
[0161]基于基因的分類器是提高疾病診斷和用于預(yù)測(cè)臨床行為的強(qiáng)有力的診斷和預(yù)后工具。我們使用PAM應(yīng)用來(lái)鑒定區(qū)分腫瘤與非腫瘤組織的微RNA特征。PAM鑒定了由7-探針組和37-探針組組成的兩個(gè)微RNA特征，其最佳地區(qū)分腫瘤與非腫瘤組織(圖13B-表4B,其中7-探針組特征用*標(biāo)示)。
[0162]7-探針組特征獲得了 16個(gè)非腫瘤組織中的14個(gè)(88%)和60個(gè)腫瘤中的49個(gè)(82%)的正確分類。該特征僅基于4個(gè)微RNA，miR-32、miR-218-2、miR-490和miR-520h的表達(dá)模式。
[0163]使用代表23個(gè)微RNA的37-探針組特征(圖11 [表5])獲得了總體預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度的進(jìn)一步提高。該特征與7-探針組特征完全重疊。通過(guò)使用37-探針組特征，PAM獲得了16個(gè)非腫瘤組織中的16個(gè)(100%)和60個(gè)腫瘤中的48個(gè)(80%)的正確分類.[0164]在下列實(shí)施例中進(jìn)一步解釋本發(fā)明，其中，除非另有說(shuō)明，所有部分和百分比以重量計(jì)并且溫度是攝氏度。應(yīng)理解，表示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的這些實(shí)施例僅通過(guò)舉例說(shuō)明的方式給出。根據(jù)上述討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的本質(zhì)特征，并且無(wú)需背離其精神和范圍，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種變化和改進(jìn)以使其適應(yīng)不同的用法和條件。本說(shuō)明書中涉及的所有公開物，包括專利和非專利文獻(xiàn)明確地通過(guò)引用并入本文。
[0165]實(shí)施例1
[0166]臨床樣品
[0167]從NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource (CPCTR)和 University ofMaryland(UMD)的病理系接收60個(gè)新鮮冷凍的前列腺腫瘤。從所有供體獲得書面知情同意。腫瘤是在前列腺切除術(shù)前未接受任何治療的切除的腺癌。由病理學(xué)家再檢查宏觀解剖的(macro-dissected)腫瘤樣品，其確認(rèn)腫瘤存在于冷凍樣品中。從16個(gè)前列腺癌患者收集周圍非腫 瘤前列腺組織。所有組織在2002至2004年收集。根據(jù)醫(yī)療記錄(CPCTR)取得或通過(guò)流行病學(xué)問(wèn)卷調(diào)查(UMD)獲得關(guān)于人種/族裔的信息。從CPCTR獲得患者的臨床病理學(xué)特征，包括前列腺切除術(shù)時(shí)的年齡、組織學(xué)、Gleason評(píng)分、病理分期、診斷時(shí)的PSA、腫瘤大小、前列腺外擴(kuò)展、邊緣受累(margin involvement)和精囊浸潤(rùn)。對(duì)于UMD病例,該信息獲自醫(yī)療和病理記錄，如果可獲得的話。研究由參與單位的制度評(píng)審委員會(huì)(institut1nalreview boards)批準(zhǔn)。
[0168]RNA 提取
[0169]按照制造商的說(shuō)明書(Invitrogen, Carlsbad, CA)使用TRIZOL試劑分離總RNA。用 Agilent2100B1analyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)確認(rèn)各樣品的 RNA 完整性。然后將各RNA樣品分成兩等分，其經(jīng)處理用于微RNA微陣列或mRNA微陣列。
[0170]基因微陣列
[0171]定制微RNA寡核苷酸芯片。如之前所述(21)進(jìn)行微RNA標(biāo)記和雜交。微RNA微陣列(Oh1 State University Comprehensive Cancer Center, Vers1n3.0)含有以一式四份點(diǎn)印的針對(duì)329個(gè)人微RNA和249個(gè)小鼠微RNA的探針。關(guān)于陣列平臺(tái)的更多信息可見于登錄號(hào)分別為A-MEXP-620和GSE8126的ArrayExpress和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0172]Affymetrix GeneChip?
[0173]按照Affymetrix標(biāo)準(zhǔn)方案(Santa Clara, CA)進(jìn)行RNA標(biāo)記和雜交。簡(jiǎn)而言之,用在5’末端具有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的寡(dT)引物逆轉(zhuǎn)錄5yg總RNA。第二鏈合成后，通過(guò)使用來(lái)自 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)的B1Array High Yield RNA TranscriptLabeling Kit T3整合生物素化的核糖核苷酸來(lái)產(chǎn)生cRNA。將標(biāo)記的cRNA片段化，然后與Affymetrix GeneChip HG-U133A2.0陣列雜交。該陣列包含代表大約13，000個(gè)人蛋白質(zhì)編碼基因的22，283個(gè)探針組。用藻紅蛋白綴合的鏈霉抗生物素蛋白(Invit1gen)顯現(xiàn)雜交信號(hào)，并且使用GeneChip Scanner30007G(Affymetrix)進(jìn)行掃描。根據(jù)關(guān)于微陣列實(shí)驗(yàn)的最小信息(Minimum Informat1n About a Microarray Experiment) (MIAME)指南，我們將額外的患者信息和微陣列數(shù)據(jù)的CEL文件保存在GEO庫(kù)(ncb1.nlm.nih.zov/aeo/)。微RNA和mRNA特征譜數(shù)據(jù)的GEO提交登錄號(hào)分別是GSE8126和GSE6956。
[0174]微陣列的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計(jì)分析
[0175]使用魯棒多芯片分析(robust multichip analysis, RMA)方法(22)標(biāo)準(zhǔn)化Affymetrix芯片。將中值-中心標(biāo)準(zhǔn)化(Median-centric normalizat1n)用于定制的微RNA寡核苷酸芯片。為了產(chǎn)生顯著差異表達(dá)的基因的清單，將所得的數(shù)據(jù)組經(jīng)歷微陣列顯著性分析(significance analysis of microarray, SAM)方法(23)。我們基于來(lái)自雙側(cè)t檢驗(yàn)的P值和期望的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)產(chǎn)生基因清單。FDR計(jì)算遵從Storey和Tibshirani描述的方法(24)。微陣列預(yù)測(cè)分析(Predict1n analysis for microarray,PAM) (25)用于將組織分類為期望的分類，例如腫瘤或非腫瘤組織。在該分析中，基于訓(xùn)練誤差率和變異系數(shù)(CV)誤差率的最佳補(bǔ)償選擇閾值δ。通過(guò)遺漏10%的樣品進(jìn)行交叉驗(yàn)證，以確定PAM中合適的閾值參數(shù)。
[0176]微RNA的靶的預(yù)測(cè)
[0177]我們使用TargetScanS(http://genes, mit.edu/tscan/taraetscanS.html)進(jìn)行微RNA的靶的預(yù)測(cè)。在我們的研究中只考慮位于3’ UTR內(nèi)并且在種間保守的微RNA的預(yù)測(cè)的結(jié)合部位。為了分析和數(shù)據(jù)輸出，將數(shù)據(jù)格式化入WholePathwayScope數(shù)據(jù)庫(kù)(26)。為了鑒定在人前列腺組織中調(diào)控它們的靶mRNA的轉(zhuǎn)錄物豐度的微RNA，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。為此，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)。利用雙側(cè)t檢驗(yàn)確定Pearson相關(guān)系數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
[0178]定量實(shí)時(shí)PCR
[0179]按照公開的方案(27)使用莖環(huán)丁壓(1蘭玨11? MicroRNA Assays試劑盒(AppliedB1systems, Foster City, CA)測(cè)量成熟微RNA的豐度。簡(jiǎn)而言之，使用來(lái)自TaqMan?MicroRNA Assays試劑盒的特異性微RNA引物和來(lái)自TaqMan? MicroRNA Reverse
Transcript1n試劑盒(Applied B1systems)的試劑，按照制造商的指導(dǎo)從1ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄 cDNA。使用 Applied B1systems Tagman2X Universal PCR Master Mix 和合適
的5X Taqman? MicroRNA Assay Mix就各目的微RNA對(duì)cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。在96孔板中，將一式三份反應(yīng)物在Applied B1systems 7500Real_Time PCR系統(tǒng)中于95°C下溫育10分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的在95°C下15秒和在60°C下I分鐘。對(duì)于各樣品，利用ABI7500Sequence Detect1n System軟件計(jì)算循環(huán)閾值(CO。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品中微RNA的濃度，然后將其相對(duì)于U6RNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0180]微RNA對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控
[0181]將LNCaP和PC3人前列腺癌細(xì)胞(ATCC，Manassas, VA)培養(yǎng)至50%匯合，然后使用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen),用10nM終濃度的微RNA前體或反義微RNA抑制劑(兩者都來(lái)自Amb1n，Austin, TX)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在48小時(shí)后，通過(guò)刮取收獲細(xì)胞，然后使用 RIPA 緩沖液(Pierce B1technology, Rockford, IL)提取蛋白質(zhì)。進(jìn)行 Bradford 測(cè)定(B1Rad Laboratories,Hercules,CA:#500-0006)以測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，將 50ug 蛋白質(zhì)裝載在凝膠上以進(jìn)行Western印跡分析。使用下列微RNA前體:前-微RNA陰性對(duì)照(AM17110);hsa-miR-l(cat#AM1710Product ID:PM10617);hsa-miR-32(cat#AM17100ProductID:PM12584);和 hsa-miR-106b (cat#AM17100Product ID:PM10067)。使用下列微 RNA 抑制劑(反義):反義微 RNA 陰性對(duì)照(AM17010) ;hsa-miR-l (cat#AM17000Product ID:AM10617);hsa-miR-32 (cat#AMI7000Product ID:AM12584);和 hsa_miR-106b (cat#AM17000ProductID:AM10067)。使用下列一抗通過(guò)Western印跡分析顯現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá):多克隆免抗輸出蛋白-6 抗體，1:200 (ProteinTech Group, Chicago, IL: 11408-1-AP);單克隆鼠抗 PTK9 抗體，1:500 (Abnova Corp.，Taipei, Taiwan: clonelE2);單克隆鼠抗 E2F1 抗體，1:200 (SantaCruz B1technology, Santa Cruz, CA: sc-251);單克隆鼠抗 p21/WAFl 抗體，1:200 (SantaCruzB1technology:sc-6246);和多克隆兔抗 BIM 抗體，1:1000 (CellSignaling/Santa Cruz B1technology: #2819)。用 AIDA B1package, 2D-光密度測(cè)定法(raytestIsotopenmessgeraete GmbH, Straubenhardt, Germany)獲得蛋白質(zhì)表達(dá)的定量。
[0182]包含E2FI和BCL2L11的3’ UTR的報(bào)告基因構(gòu)建體的螢光素酶測(cè)定
[0183]從基因組DNA(293T細(xì)胞)克隆分別包含預(yù)測(cè)的miR_106b和miR-32的靶序列的E2FI和BCL2L11 (編碼Bim)的3’UTR，然后將其在緊接螢光素酶報(bào)告基因下游的Xbal限制性位點(diǎn)克隆入PGL3螢火蟲螢光素酶對(duì)照載體(Promega，Madison, WI)。為了產(chǎn)生具有突變體祀序列的3’UTR,使用QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene, La Jolla,CA)將前3個(gè)核苷酸的缺失插入miR-106b和miR-32的種子區(qū)域互補(bǔ)位點(diǎn)。在LNCaP細(xì)胞中測(cè)定miR-106b或miR-32對(duì)螢光素酶報(bào)告基因的翻譯抑制。簡(jiǎn)而言之，將1.2xl05個(gè)LNCaP細(xì)胞/孔接種在24孔板中。第二天,按照制造商的說(shuō)明書(Invitrogen)使用lipofectamine2000試劑用500ng報(bào)告基因質(zhì)粒、2ng Renilla報(bào)告基因和10nM終濃度的微RNA陰性對(duì)照或前體微RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以一式三份重復(fù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用前-微RNA陰性對(duì)照(AM17110)、hsa-miR-106b(cat#AM17100Product ID:PM10067)或 hsa-miR-32 前體(cat#AM17100Product ID:PM12584)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24小時(shí)后，按照Promega標(biāo)準(zhǔn)方案裂解細(xì)胞，并且使用DYNEX Technologies MLX光度計(jì)測(cè)定相對(duì)螢光素酶活性。將報(bào)告基因活性相對(duì)于細(xì)胞提取物中蛋白質(zhì)的濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0184]用雄激素受體激動(dòng)劑處理前列腺癌細(xì)胞
[0185] 將DU-145 (IxlO6)和LNCaP (2xl06)人前列腺癌細(xì)胞(ATCC)涂板在75cm2培養(yǎng)瓶中，用補(bǔ)充有10%PBS、100 μ g/ml鏈霉素、100單位/ml青霉素和0.25 μ g/ml兩性霉素B的RPMI1640培養(yǎng)24小時(shí)。然后，將細(xì)胞置于不含酚紅的、具有5%的葡聚糖包被的炭處理的PBS(Invitrogen)的RPMI1640中，進(jìn)行48小時(shí)以耗盡激素。然后，用1nM R1881 (甲基三烯甘油酯酮，PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA)或溶劑(乙醇)處理細(xì)胞。24小時(shí)后，收獲細(xì)胞，使用mirVana PARIS試劑盒(Amb1n, Inc.)分離總RNA。重復(fù)本實(shí)驗(yàn)5次。如之前所述(21)進(jìn)行微RNA標(biāo)記和雜交,在 Oh1 State University Comprehensive CancerCenter微陣列(版本4.0)上測(cè)定微RNA的全局表達(dá)。
[0186]實(shí)施例1的結(jié)果
[0187]前列腺腫瘤中Dicer的上調(diào)
[0188]從患有局部疾病(1calizeddisease)的非洲裔美國(guó)患者和歐洲裔美國(guó)患者收集前列腺腫瘤(圖10-表1)。
[0189]在從這些腫瘤和16個(gè)非腫瘤組織分離總RNA后，使用微陣列測(cè)定大約13，000個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和329個(gè)獨(dú)特的人微RNA的表達(dá)。
[0190]首先，就已顯示調(diào)控微RNA的加工的mRNA (例如編碼，特別地，Drosha或Dicer的mRNA)的表達(dá)的癌癥相關(guān)的變化搜索這些樣品的基因表達(dá)特征譜。我們的分析顯示，當(dāng)與非腫瘤組織相比較時(shí)Dicer在前列腺腫瘤中的表達(dá)顯著更高(1.6-倍；FDR〈1%)。編碼Drosha的基本輔因子的DGCR8在腫瘤中也上調(diào)，但當(dāng)與非腫瘤組織相比較時(shí)程度低于DiceHl.2倍；FDR〈1%)。編碼Drosha的基本輔因子的DGCR8也在腫瘤中上調(diào)(1.2倍，F(xiàn)DR〈1%)。通過(guò)qRT-PCR來(lái)驗(yàn)證腫瘤中Dicer和DGCR8的增加的表達(dá)，結(jié)果顯示更大的倍數(shù)差異(與微陣列顯示的結(jié)果相比較)(圖4A-4B)。
[0191]進(jìn)一步的分析顯示，Dicer和EIF2C2 (兩者都為RISC復(fù)合物的組分)在具有高Gleason總評(píng)分(評(píng)分7-9)的腫瘤中比在具有低Gleason總評(píng)分(評(píng)分5-6)的腫瘤中更高地表達(dá)。然而，這些表達(dá)差異相當(dāng)適度(Dicer:1.2倍；EIF2C2:1.3倍)。因?yàn)樵谌思?xì)胞中已發(fā)現(xiàn)宿主基因和內(nèi)含子微RNA的頻繁共表達(dá)(28)，因此我們還研究了前列腺腫瘤中微RNA宿主基因的表達(dá)。
[0192]在微RNA的宿主基因當(dāng)中(28;29)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)的表達(dá)在前列腺癌中發(fā)生改變(所有FDR〈1%)。在這些基因當(dāng)中，作為miR-32的宿主的C9orf 5 (2.1倍上調(diào))和作為miR-25簇(miR-25/miR-93/miR-106b)的宿主的MCM7 (1.7倍上調(diào))在腫瘤中最高地過(guò)表達(dá)。NFYC (miR-30c-l 的宿主)、SMC4L1 (miR-15b 和 miR-16-2 的宿主)和 PTPRN2 (miR-153-2 的宿主)，當(dāng)與非腫瘤組織相比較時(shí)，在腫瘤中顯示更適度的30%至40%的增加的表達(dá)。
[0193]前列腺癌的微RNA基因特征
[0194]我們首先搜索在腫瘤與非腫瘤組織之間顯示差異表達(dá)的微RNA。如圖11-表2中所示的，多個(gè)微RNA的表達(dá)在前列腺腫瘤中發(fā)生改變。
[0195]在腫瘤中具有比非 腫瘤組織更低的轉(zhuǎn)錄物水平的微RNA當(dāng)中，miR_520h、miR-494和miR-490減少最多。該清單中兩個(gè)值得注意的其他的微RNA是miR-Ι (-2)和miR-133a (-1)。這兩個(gè)微RNA由相同的pr1-mRNA編碼。miR-32是最顯著上調(diào)的腫瘤微RNA，其次是miR-182、miR-31和miR_26a。最高表達(dá)的腫瘤微RNA的清單還包括miR-106b_25簇(miR-106b/miR-93/miR-25)的所有成員和 miR_99b 簇的兩個(gè)成員 miR_99b 和 miR_125a。miR-32和miR-106b-25簇的上調(diào)與它們各自的宿主基因C9orf5和MCM7在前列腺腫瘤中的增加的表達(dá)相一致。
[0196]微陣列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確認(rèn)，C9orf5與miR-32的組織轉(zhuǎn)錄物水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著相關(guān)(P=0.0003)。Pearson系數(shù)表明，該關(guān)聯(lián)在所有樣品間是適度強(qiáng)的(0.39;95%置信區(qū)間:0.18至0.57;n=76)。對(duì)于MCM7與miR-106b_25簇轉(zhuǎn)錄物水平之間的關(guān)聯(lián)獲得相似的數(shù)據(jù)(miR-106b:0.37 (Pearson 系數(shù)),P=0.001;miR-93:0.35, P=0.002;miR-25:0.23，P=0.04)。
[0197]我們通過(guò)在腫瘤和非腫瘤組織的隨機(jī)亞組中選擇的微RNA的qRT-PCR分析確證了微陣列數(shù)據(jù)。與微陣列相一致，我們發(fā)現(xiàn)，成熟miR-32 (3.2倍)和miR_106b (3.0倍)在腫瘤中比在非腫瘤組織中更高地表達(dá)(圖5A-5D)。我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與非腫瘤組織相比較時(shí)，在腫瘤中成熟miR-Ι下調(diào)(平均:0.44倍)以及miR_106a (miR_106b同源物)過(guò)表達(dá)(平均:3.7倍)。
[0198]我們還在我們的研究中進(jìn)行10個(gè)腫瘤(其周圍的非腫瘤組織是可獲得的)的微陣列數(shù)據(jù)的成對(duì)分析。成對(duì)分析確證了我們之前的發(fā)現(xiàn)。在FDR〈10%的情況下，發(fā)現(xiàn)miR-26a、miR-30c-l、miR-32、miR-146b、miR181a、fiR-182、miR-196a、miR-200c、miR-375 和miR-106b-25簇的所有微RNA在腫瘤中上調(diào)(1.5倍至2.5倍)。最顯著下調(diào)的腫瘤微RNA是miR-494 (0.4倍)和miR-126 (0.6倍)。然而，未發(fā)現(xiàn)miR_133a簇在該腫瘤亞組中顯著地差異地表達(dá)。
[0199]微RNA與前列腺外擴(kuò)展和Gleason評(píng)分的關(guān)聯(lián)
[0200]我們接著就與腫瘤的前列腺外擴(kuò)展相關(guān)的微RNA表達(dá)的差異分析我們的數(shù)據(jù)組。前列腺外擴(kuò)展是前列腺癌患者的不利預(yù)后因素。在FDR〈20%的情況下，我們發(fā)現(xiàn)15個(gè)在顯示疾病的前列腺外擴(kuò)展的腫瘤(n=17)與不顯示疾病的前列腺外擴(kuò)展的腫瘤(n=35)之間的表達(dá)上具有差異的微RNA (圖12-表3)。
[0201]miR-ΙΟ?是擴(kuò)散出前列腺的局限性前列腺腫瘤中最始終如一地過(guò)表達(dá)的微RNA(FDR〈1%)。前列腺外擴(kuò)展與腫瘤特征共有一部分其微RNA特征(圖11-表2)。
[0202]兩個(gè)微RNA，miR_99b和miR_196a對(duì)于兩個(gè)特征是共同的。前列腺外擴(kuò)展特征的兩個(gè)其他的微RNA，miR-200a和miR_200b，與腫瘤特征中的miR_200c具有充分的同源性。我們還研究了微RNA與精囊浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)，雖然本研究中少數(shù)腫瘤經(jīng)診斷具有該特征。在FDR〈20%的情況下，只有一個(gè)微RNA在具有精囊浸潤(rùn)的腫瘤(n=9)與不具有浸潤(rùn)的腫瘤(n=43)之間差異表達(dá)。該微RNA是miR-199a-l，當(dāng)與其他腫瘤相比較時(shí)，其在具有精囊浸潤(rùn)的腫瘤中增加2.3倍。
[0203]微RNA表達(dá)特征譜對(duì)于Gleason評(píng)分未顯示魯棒特征。在FDR〈20%的情況下只發(fā)現(xiàn)極少數(shù)微RNA差異表達(dá)。當(dāng)與具有低Gleason總評(píng)分(評(píng)分5-6, n=15)的腫瘤相比較時(shí)，在具有高Gleason總評(píng)分(評(píng)分7_9，n=45)的腫瘤中顯著上調(diào)的微RNA(P〈0.01)是miR-92-2(l.3倍)(miR-25和miR -32的同源物)以及miR-335 (1.2倍)，顯著下調(diào)的微RNA (P<0.01)是 miR-1-133a 簇(0.7 倍)和 miR-130 (0.8 倍)。
[0204]因?yàn)槲覀兊难芯恐械哪[瘤是從在臨床病理學(xué)參數(shù)上良好匹配的非洲裔美國(guó)患者和歐洲裔美國(guó)患者收集的(圖10-表1)，所以我們比較非洲裔美國(guó)患者(n=30)和歐洲裔美國(guó)患者(n=30)之間的腫瘤微RNA特征。少數(shù)微RNA差異表達(dá)(P〈0.01)。在FDR〈20%的情況下，發(fā)現(xiàn)miR-129、miR-196b和miR-342在非洲裔美國(guó)人的腫瘤中的豐度比在歐洲裔美國(guó)人的腫瘤中的更低(低20%至30%)。根據(jù)該分析，腫瘤微RNA似乎不因人種/族裔而極差異地表達(dá)。
[0205]使用微RNA進(jìn)行的腫瘤和非腫瘤組織的分類。
[0206]基于基因的分類器是提高疾病診斷和用于預(yù)測(cè)臨床行為的強(qiáng)有力的診斷和預(yù)后工具。我們使用PAM應(yīng)用來(lái)鑒定區(qū)分腫瘤與非腫瘤組織、區(qū)分器官局限性腫瘤與具有前列腺外擴(kuò)展的腫瘤以及區(qū)分具有高Gleason總評(píng)分的腫瘤與具有低Gleason總評(píng)分的腫瘤的微RNA特征。PAM鑒定了由7-探針組和37-探針組組成的兩個(gè)微RNA特征，其最佳地區(qū)分腫瘤與非腫瘤組織。7-探針組特征獲得了 16個(gè)非腫瘤組織中的14個(gè)(88%)和60個(gè)腫瘤中的49個(gè)(82%)的正確分類。該特征僅基于4個(gè)微RNA，miR-32、miR-218-2、miR-490和miR-520h的表達(dá)模式(圖13B-表4B)，所述微RNA全都是最顯著上調(diào)或下調(diào)的腫瘤微RNA (圖11-表2)。使用代表23個(gè)微RNA的37-探針組特征(圖14-表5)獲得了總體預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度的進(jìn)一步提高。
[0207]該特征與7-探針組特征完全重疊。通過(guò)使用37-探針組特征，PAM獲得16個(gè)非腫瘤組織中的16個(gè)(100%和60個(gè)腫瘤中的48個(gè)(80%)的正確分類。PAM不能鑒定用于前列腺外擴(kuò)展和Gleason評(píng)分的良好分類器。對(duì)于Gleason評(píng)分，弱至適度的分類器需要149個(gè)探針組(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0208]前列腺組織中微RNA與它們的靶mRNA的轉(zhuǎn)錄物豐度之間的關(guān)系
[0209]微RNA利用靶特異性翻譯抑制(4)來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)。然而，最近顯示，一些微RNA例如miR-Ι可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中下調(diào)許多靶基因的轉(zhuǎn)錄物水平。因?yàn)閙iR-Ι是前列腺腫瘤中最顯著下調(diào)的微RNA，因此我們?cè)谶@些腫瘤中進(jìn)行miR-Ι的表達(dá)水平與預(yù)測(cè)的miR-Ι的靶基因的表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)分析。進(jìn)行該測(cè)試以鑒定由于減少的miR-Ι表達(dá)而在前列腺腫瘤中變得過(guò)表達(dá)的候選miR-Ι的靶基因。分析產(chǎn)生假定的靶mRNA，發(fā)現(xiàn)其在前列腺腫瘤中上調(diào)(FDR〈1%)并且與miR-Ι表達(dá)負(fù)相關(guān)(圖13-表4))。
[0210]其中，WDR6、XP06和SMARCA4的轉(zhuǎn)錄物顯示與腫瘤miR-Ι的表達(dá)呈最顯著的負(fù)相關(guān)(各P〈lxl0_lcl)。前列腺腫瘤中XP06與miR-Ι轉(zhuǎn)錄物水平之間的關(guān)系描繪于圖6中。
[0211]我們還發(fā)現(xiàn),腫瘤中XP06蛋白水平與miR-Ι呈負(fù)相關(guān)(-0.29, Spearman相關(guān)系數(shù)；n=8)。然而，并非所有預(yù)測(cè)的miR-Ι的靶都顯示與腫瘤中miR-Ι轉(zhuǎn)錄物水平呈負(fù)相關(guān)。例如，TWFl (也稱為PTK9)與miR-Ι呈正相關(guān)，這表明微RNA與其靶序列的結(jié)合有時(shí)可導(dǎo)致mRNA扣留(sequestrat1n)和被抑制的mRNA的細(xì)胞積累(30)。
[0212]將我們的分析擴(kuò)展至在前列腺腫瘤中顯著上調(diào)或下調(diào)的其他微RNA。此處，我們首先確定目的微RNA與通過(guò)HG-U133A2.0陣列探測(cè)的所有mRNA或僅為微RNA的預(yù)測(cè)的靶的mRNA之間的Pearson相關(guān)系數(shù)的全局分布。對(duì)于兩個(gè)微RNA, miR-106b和miR_181a,相關(guān)系數(shù)的分布在所有mRNA與為miR_106b和miR_181a的預(yù)測(cè)的祀的mRNA之間顯著不同(圖1A-1B)。
[0213]miR-106b和miR_181a的預(yù)測(cè)的革巴mRNA的分布曲線顯示向負(fù)Pearson相關(guān)系數(shù)延伸的顯著的肩。該模式偏離正態(tài)分布，表明miR-106b和miR-181a降低在3’ UTR中具有預(yù)測(cè)的微RNA的靶序列的mRNA的亞組的組織轉(zhuǎn)錄物水平。在腫瘤中顯著下調(diào)(FDR〈1%)并且其轉(zhuǎn)錄物水平與miR-181a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的靶基因的清單示于圖14-表5中。
[0214]此類靶基因與白血病樣品(31)中一列和mir_181a轉(zhuǎn)錄物水平相關(guān)的基因的比較顯示，幾個(gè)基因例如SLC9A6、RIN2、KLHL2和GHITM在兩個(gè)清單中都與mir_181a呈負(fù)相關(guān)。
[0215]前列腺癌細(xì)胞中候選oncomiR對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制
[0216]我們的來(lái)自腫瘤研究的結(jié)果表明，miR-Ι、miR-32和mir-106b_25簇在前列腺癌中是oncomiR，miR-32和miR-25共有高度的同源性，并且它們的預(yù)測(cè)的靶基因相同(targetscan.0rg)。此外，mir-106b-25 族與已知的 oncomiR, miR-17-92 族(15; 32)高度同源，并且miR-17-5p和miR-106b的預(yù)測(cè)的靶相同。miR-17-92簇的靶是E2F1 (32)。
[0217]我們用前體和反義微RNA轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞系以檢查miR-Ι、miR-32和mir-106b是否調(diào)節(jié)癌相關(guān)基因在此類細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0218]通過(guò)qRT-PCR，此類微RNA在細(xì)胞系中的內(nèi)源性表達(dá)是miR-106>miR-32>miR-l。miR-Ι處于檢測(cè)極限。對(duì)于miR-Ι，我們測(cè)試腫瘤組織中微RNA與它們的靶mRNA的轉(zhuǎn)錄物豐度之間的關(guān)系是否可用于鑒定微RNA靶，檢查輸出蛋白-6(XP06)和蛋白質(zhì)酪氨酸激酶9 (TffFl)的蛋白質(zhì)表達(dá)是否受miR-Ι調(diào)控。使用miR-Ι對(duì)前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染確認(rèn)，其在兩個(gè)前列腺癌細(xì)胞系中在蛋白質(zhì)水平上抑制輸出蛋白-6和PTK9(圖2Α)。miR-32和mir-106b都不改變這些蛋白質(zhì)的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。[0219]我們接著研究miR_106b對(duì)E2F1和p21/WAFl蛋白水平的調(diào)控。兩種蛋白質(zhì)都由在它們的3’ UTR中具有miR-106b的預(yù)測(cè)的靶序列的mRNA編碼。雖然在前列腺腫瘤中E2F1在轉(zhuǎn)錄物水平上與miR-106b不相關(guān)，但在這些腫瘤中在⑶KNlA (編碼p21/WAFl)與miR_106b的表達(dá)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)(-0.34;95%CI;-0.9至-0.55;P=0.003)。
[0220]如圖2B中所示，在兩種細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染的前體miR_106b降低p21/WAFl蛋白水平，反義miR-106b增加p21/WAFl蛋白水平。在用前體和反義miR_106b轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞后，對(duì)于E2F1，我們獲得相同的結(jié)果(圖3A)。
[0221]我們還研究了 miR-32對(duì)Bim蛋白表達(dá)的影響。Bim由BCL2L11編碼并且是miR-32的預(yù)測(cè)的靶。用前體miR-32轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞降低了 Bim蛋白水平，然而反義miR-32增加Bim蛋白水平(圖3C)。Bim由BCL2L11編碼并且是miR-32的預(yù)測(cè)的靶。BCL2L11和miR-32轉(zhuǎn)錄物水平在組織樣品中不相關(guān)，這表明miR-32可能主要通過(guò)翻譯抑制調(diào)控該靶。
[0222]在此類細(xì)胞系中，E2F1和p21/WAFl的蛋白質(zhì)表達(dá)不受miR-32影響，Bim的蛋白質(zhì)表達(dá)也不受miR-106b影響(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0223]E2FI 和 Bim 是 miR_106b 和 miR-32 的直接靶
[0224]為了進(jìn)一步確證我們的發(fā)現(xiàn)和提供此類蛋白質(zhì)是miR_106b和miR-32的直接靶的證據(jù)，用前體微RNA和pGL3螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體(分別含有兩個(gè)基因E2F1和BCL2L11 (編碼Bim)的野生型或突變體3’UTR)共轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞。突變體3’UTR包含miR-106b和miR-32種子區(qū)域互補(bǔ)位點(diǎn)中的前3個(gè)核苷酸的缺失。將3’ UTR置于當(dāng)微RNA結(jié)合靶序列時(shí)可導(dǎo)致螢光素酶報(bào)告基因的翻譯抑制的位點(diǎn)。
[0225] 如圖3B和圖3D中所示，當(dāng)與前體微RNA陰性對(duì)照相比較時(shí)，miR_106b與包含E2F1的野生型3’ UTR的報(bào)告基因構(gòu)建體或miR-32與包含BCL2L11的野生型3’ UTR的報(bào)告基因構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致螢光素酶報(bào)告基因的顯著抑制。在3’ UTR不存在的情況下，微RNA對(duì)報(bào)告基因的抑制不存在。突變體3’UTR的存在消除或減弱微RNA的作用。結(jié)果與微RNA通過(guò)結(jié)合它們的3’UTR靶序列產(chǎn)生的對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的直接作用相一致。已建立了 miR-106b在人結(jié)腸癌和胃癌細(xì)胞中對(duì)P21/WAF1進(jìn)行調(diào)控的這樣的機(jī)制(13，14)。因此，我們觀察到，miR-106b在LNCaP細(xì)胞中通過(guò)⑶KN1A3S UTR介導(dǎo)的機(jī)制抑制螢光素酶報(bào)告基因(圖7)。
[0226]miR-106b-25簇在22Rvl人前列腺癌細(xì)胞中對(duì)胱天蛋白酶活化的抑制。
[0227]我們之前的數(shù)據(jù)表明，miR-32、miR_106b和它們的同源物(例如，miR-25)可用作癌基因，因?yàn)樗鼈儼邢駼im和E2F1的促凋亡功能。為了估計(jì)miR-106b_25簇對(duì)由多柔比星和依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用，我們用編碼miR-106b-25簇的慢病毒表達(dá)載體感染22Rvl細(xì)胞(非轉(zhuǎn)移性人前列腺癌細(xì)胞系)。通過(guò)使用胱天蛋白酶-Glo細(xì)胞凋亡測(cè)定，我們觀察到抗癌藥物處理的細(xì)胞中該簇對(duì)胱天蛋白酶-3/胱天蛋白酶-7活化的顯著抑制(圖8A-8B)。該數(shù)據(jù)與miR-106b-25簇在前列腺癌細(xì)胞中的抗細(xì)胞凋亡功能一致。
[0228]受雄激素調(diào)控的微RNA的鑒定
[0229]雄激素在前列腺的生理和腫瘤生物學(xué)中起著至關(guān)重要的作用。我們檢查DU145和LNCaP細(xì)胞中雄激素對(duì)微RNA的調(diào)控。使用R1881對(duì)DU145細(xì)胞的處理不產(chǎn)生任何顯著的微RNA表達(dá)的變化。相反地，許多微RNA的表達(dá)在R1881處理后在LNCaP細(xì)胞中顯著改變(FDR<5%)(圖 15-表 6)。
[0230]一個(gè)微 RNA，miR-338,顯著上調(diào)。其他微 RNA 下調(diào)，包括 miR-126_5、miR_146b、miR-219-5p 以及 miR181b_l、miR_181c 和 miR-221 簇的所有成員。培養(yǎng)的 DU145 和 LNCaP細(xì)胞中基線微RNA表達(dá)的分析顯示，這三個(gè)微RNA簇的所有成員在雄激素不敏感性DU145細(xì)胞中比在雄激素應(yīng)答性LNCaP細(xì)胞中具有顯著更高的表達(dá)(FDR〈5%)。
[0231]通過(guò)使用Genomatix轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)中的基序搜索，我們發(fā)現(xiàn)，前面提及的微RNA在它們的側(cè)翼區(qū)域具有假定的雄激素受體結(jié)合位點(diǎn)(圖16-表7)。我們進(jìn)一步用LNCaP細(xì)胞(其用I或10nmol/LR1881處理12、24和48小時(shí))在實(shí)驗(yàn)中確證了微陣列結(jié)果。成熟miR-338和miR-221的qRT-PCR分析顯示，它們的表達(dá)水平受雄激素調(diào)控(圖9A-9B)。
[0232]實(shí)施例1的討論
[0233]我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)前列腺腫瘤中獨(dú)特的微RNA表達(dá)特征和調(diào)控腫瘤微RNA加工的基因表達(dá)的變化。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，微RNA的失調(diào)影響前列腺中靶mRNA的轉(zhuǎn)錄物豐度和蛋白質(zhì)表達(dá)。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，我們顯示，前列腺癌中的候選oncomiR例如miR-32和miR_106b抑制癌癥相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。該結(jié)果與改變的微RNA表達(dá)在人前列腺癌發(fā)生中的致病性作用一致。
[0234]這是使用微RNA和編碼蛋白質(zhì)的RNA的大規(guī)模基因表達(dá)特征譜分析鑒定在人前列腺腫瘤中發(fā)生的微RNA功能的改變的首個(gè)研究。本研究的其他有力方面是，樣品數(shù)量大，并且包括非洲裔美國(guó)患者和歐洲裔美國(guó)患者。因此，該發(fā)現(xiàn)代表在美國(guó)具有最高前列腺癌負(fù)荷的兩個(gè)人種/族裔群體(34)。
[0235]我們發(fā)現(xiàn)Dicer和DGCR8在前列腺腫瘤中的增加的表達(dá)，以及Dicer和編碼argonuate-2的EIF2C2在具有高Gleason評(píng)分的腫瘤中的增加的表達(dá)。Dicer在前列腺癌中上調(diào)的觀察結(jié)果與最近的報(bào)導(dǎo)(35)相符并且表明前列腺腫瘤在將微RNA前體加工成成熟微RNA中比正常前列腺組織更有效。最近已顯示受損的微RNA加工增加小鼠的腫瘤發(fā)生
(8)，其他研究人員已假設(shè)微RNA加工在癌細(xì)胞中普遍下調(diào)(36)。
[0236]然而，在前列腺腫瘤中，增強(qiáng)的微RNA加工的相反作用可能發(fā)生，如由我們的數(shù)據(jù)和前面提及的研究所描述的，所述數(shù)據(jù)和研究顯示前列腺癌細(xì)胞中Dicer的增加的蛋白質(zhì)表達(dá)和轉(zhuǎn)移性疾病中Dicer和EIF2C2的過(guò)表達(dá)(35)。
[0237]微RNA表達(dá)特征譜分類人癌癥(10; 14)。已報(bào)導(dǎo)了幾種上皮癌包括乳腺、結(jié)腸、肺和胰腺癌的獨(dú)特特征(11;12;37;38)。兩個(gè)其他研究調(diào)查了前列腺癌中的微RNA表達(dá)(39;40) ο與Baylor前列腺數(shù)據(jù)(40) —致，我們還觀察到，miR-145在前列腺腫瘤中顯著下調(diào)。然而，當(dāng)與我們的研究相比較時(shí)，這兩個(gè)公開的研究規(guī)模相當(dāng)小并且只檢查了少數(shù)幾個(gè)腫瘤。
[0238]我們鑒定了包括上調(diào)和下調(diào)的微RNA的腫瘤基因特征。
[0239]最高上調(diào)的微RNA 是 miR-32，其次是 miR-182、miR-31、miR_26a、miR-200c 和miR_196a。過(guò)表達(dá)的腫瘤微RNA的清單也包括miR-106b_25簇，這與觀察到的mir_25,mir-93和mir_106b的拷貝數(shù)在數(shù)個(gè)人惡性腫瘤中增加一致(41)。
[0240]最顯著下調(diào)的微RNA 包括 miR-520h、miR-494、miR-490 和 miR-l_133a 簇。
[0241]已在許多研究中觀察到人癌癥中微RNA的改變的表達(dá)。腫瘤中微RNA的上調(diào)是很常見的(5，6，8)，并且其與許多微RNA的已知的致癌活性一致(22-25)。上調(diào)的機(jī)制包括轉(zhuǎn)錄激活和基因拷貝數(shù)目的增加。成熟微RNA的豐度的減少可由改變的加工引起，如最近所顯示的(26)，所述改變的加工可導(dǎo)致成熟微RNA的無(wú)差別的更低的表達(dá)。我們?cè)诒狙芯恐形从^察到該現(xiàn)象。備選地，微RNA的表達(dá)可以由于突變或基因組改變(21)或微RNA基因座的表觀遺傳沉默(27，28)而喪失。表觀遺傳沉默是前列腺癌的重要機(jī)制(29)，必須進(jìn)行另外的研究來(lái)闡明該機(jī)制是否阻礙微RNA在前列腺腫瘤中的表達(dá)。
[0242]關(guān)于大多數(shù)此類微RNA的功能知之甚少。miR-32是miR-25，miR-92、miR-363和miR-367的同源物。幾個(gè)此類微RNA在前列腺腫瘤中也上調(diào)。miR-32在結(jié)腸和前列腺癌中增加(10)，并且是人細(xì)胞的抗病毒防御的介體(mediator) (42)。miR-32的該功能可能是其改變的表達(dá)與前列腺癌發(fā)生之間的聯(lián)系，因?yàn)閹讉€(gè)已知的前列腺癌易感基因(susceptibility gene)也參與宿主防御(43)。如對(duì)于其他微RNA所顯示的，miR-32應(yīng)當(dāng)調(diào)控革巴基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0243]我們獲得了新觀察結(jié)果，miR-32抑制Bim(BCL_2家族的促凋亡成員)的表達(dá)(44)。Bim是單倍不足的(haploinsufficient), —個(gè)等位基因的失活足以加速M(fèi)yc誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生(45)。Bim在上皮腫瘤的細(xì)胞凋亡中具有至關(guān)重要的作用并且介導(dǎo)化學(xué)療法的抗腫瘤效應(yīng)(46)。因此，miR-32對(duì)Bim的下調(diào)可在腫瘤環(huán)境中促成腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡刺激的抗性。
[0244]其他值得注意的具有已知功能的微RNA包括miR-1、miR-133a和mirR_196a。miR-1-133a簇優(yōu)先在肌細(xì)胞中表達(dá)并且經(jīng)顯示調(diào)控細(xì)胞分化(47; 48)。miR-Ι是miR-206的同源物，其在乳腺癌中為轉(zhuǎn)移的抑制劑(34)。本
【發(fā)明者】發(fā)現(xiàn)miR-Ι在前列腺腫瘤中下調(diào)，這與其同源物的腫瘤抑制劑功能一致。
[0245]我們檢查miR-Ι并且觀察到，在前列腺腫瘤和培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞中該微RNA的表達(dá)與輸出蛋白-6和 蛋白質(zhì)酪氨酸激酶9(也稱為A6/twinfilin)的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。關(guān)于這兩個(gè)基因的功能知之甚少，但最近的數(shù)據(jù)顯示，兩者都調(diào)控細(xì)胞肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)(49-51)。MiR-196a被鑒定為H0XB8的抑制物(52)，并且miR_196a的提高的表達(dá)預(yù)示胰腺癌的較低的存活(38)。在我們的研究中，該微RNA對(duì)于腫瘤特征和前列腺外擴(kuò)展特征是共同的，這表明前列腺癌中miR-196a的上調(diào)可以是疾病進(jìn)展的因素。
[0246]已顯示微RNA特征在人癌癥中具有診斷和預(yù)后價(jià)值(13 ;38;53; 54)。
[0247]我們通過(guò)研究微RNA與腫瘤診斷、前列腺外擴(kuò)展、Gleason評(píng)分和患者的人種/族裔的關(guān)聯(lián)確定了前列腺癌中微RNA表達(dá)的診斷和預(yù)后意義。比較非洲裔美國(guó)患者與歐洲裔美國(guó)患者的腫瘤微RNA特征，因?yàn)樽钚伦C據(jù)表明，這兩個(gè)患者群體之間可能存在腫瘤生物學(xué)中的差異(55)。雖然在前列腺的腫瘤與非腫瘤組織之間發(fā)現(xiàn)微RNA表達(dá)的巨大差異，但相對(duì)少數(shù)的微RNA在擴(kuò)散出前列腺的腫瘤與未擴(kuò)散出前列腺的腫瘤之間，在Gleason評(píng)分大于7的腫瘤與評(píng)分小于7的腫瘤之間以及在來(lái)自非洲裔美國(guó)患者與歐洲裔美國(guó)患者的腫瘤之間差異表達(dá)。
[0248]此外，利用PAM鑒定了可區(qū)分腫瘤與非腫瘤前列腺組織的由四(4)個(gè)微RNA組成的七(7)探針組特征。然而，PAM分析不能產(chǎn)生用于前列腺外擴(kuò)展、Gleason評(píng)分或人種/族裔的良好分類器。
[0249]我們鑒定了以低邊際誤差與前列腺外疾病擴(kuò)展相關(guān)的一個(gè)微RNA，miR_101。該微RNA的功能未知。我們認(rèn)為，前列腺腫瘤的內(nèi)在異質(zhì)性妨礙我們發(fā)現(xiàn)更多的與前列腺癌中不利的預(yù)后因素相關(guān)的微RNA。[0250]微RNA的基因組定位的分析可提供關(guān)于它們的假定的功能和在腫瘤中引起改變的微RNA表達(dá)的機(jī)制的線索(56)。最近的研究已顯示，微RNA通常位于蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子中并且與此類宿主基因共表達(dá)(28;29)。我們研究前列腺腫瘤中宿主基因的表達(dá)并且發(fā)現(xiàn)它們中的幾個(gè)在前列腺腫瘤中增加。C9orf5和MCM7是兩個(gè)最高上調(diào)的宿主基因，并且它們的表達(dá)分別與內(nèi)含子微RNA，miR-32和miR-106b_25簇的表達(dá)相關(guān)。該數(shù)據(jù)暗示了導(dǎo)致前列腺腫瘤中宿主基因和共轉(zhuǎn)錄的微RNA的上調(diào)的共同機(jī)制。
[0251]雖然C9orf5在癌癥中的作用未知，但之前發(fā)現(xiàn)MCM7擴(kuò)增與前列腺癌相關(guān)聯(lián)。發(fā)現(xiàn)MCM7基因座在88%的癌癥復(fù)發(fā)的病例中擴(kuò)增(57)。MCM7過(guò)表達(dá)不限于前列腺癌，已在其他惡性腫瘤包括宮頸癌中觀察到MCM7過(guò)表達(dá)(58)。
[0252]我們檢查miR-106b在前列腺癌細(xì)胞中是否靶向E2F1和CDKNlA(編碼p21/WAFl)并且發(fā)現(xiàn)此類基因的蛋白質(zhì)表達(dá)被miR-106b抑制。miR-106b-25簇與兩個(gè)其他的微RNA簇廣泛同源，所述兩個(gè)其他的微RNA簇是候選人癌基因miR-17-92簇和miR-106a_363簇(15; 59; 60)。E2F1 也是 miR-17-92 簇中的 miR-17_5p 和 miR_20a 的靶(32)，并且其具有癌基因和腫瘤抑制功能(61;62)。與Bim—樣，翻譯的E2F1是促細(xì)胞凋亡的并且與腫瘤抑制基因P53協(xié)作以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡(63)。其過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(64)，這表明miR-106b對(duì)E2F1翻譯的抑制可在腫瘤環(huán)境中保護(hù)前列腺癌細(xì)胞免受細(xì)胞凋亡。
[0253]p21/ WAFl是p53腫瘤抑制的介體(65)。已顯示p21/WAFl在前列腺癌中的生長(zhǎng)抑制作用(66)，其在前列腺癌細(xì)胞中響應(yīng)抗癌劑而介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯出7;68)。我們檢測(cè)miR-106b-25簇是否具有抗細(xì)胞凋亡活性并且發(fā)現(xiàn)其在22Rvl細(xì)胞中抑制由多柔比星和依托泊苷產(chǎn)生的胱天蛋白酶活化。
[0254]這些數(shù)據(jù)與前列腺癌中miR_106b的致癌功能一致，部分因?yàn)槠湟种艵2F1和p21/WAFl蛋白表達(dá)的能力。
[0255]miR-1 ,miR-32和miR-106b_25簇都不受LNCaP細(xì)胞的雄激素刺激調(diào)控。然而，我們鑒定了受雄激素處理而上調(diào)或下調(diào)的幾個(gè)其他的微RNA。此類微RNA包括，特別地，miR-338和miR-126以及miR-181b-l、miR-181c、miR-221簇?；蛩阉黠@示，此類微RNA在它們的側(cè)翼區(qū)域具有假定的雄激素受體結(jié)合位點(diǎn)。
[0256]MiR-338是唯一顯著上調(diào)的微RNA。沒有關(guān)于該微RNA的功能的報(bào)導(dǎo)，但其在三種上皮癌中位于拷貝數(shù)目頻繁增加的區(qū)域。
[0257]MiR-181家族成員影響造血譜系分化(69)，并且它們的表達(dá)在白血病和幾種實(shí)體瘤中發(fā)生改變(10;31)。已發(fā)現(xiàn)miR-221簇調(diào)控p27Kipl腫瘤抑制基因并且在前列腺癌中可能具有致癌特性(70;71)。然而，該簇也抑制癌基因c-Kit和血管生成(72)。
[0258]已證明受特定微RNA調(diào)控的蛋白質(zhì)編碼基因的鑒定非常困難，盡管預(yù)測(cè)微RNA的靶的計(jì)算機(jī)方法獲得了發(fā)展(73; 74)。發(fā)現(xiàn)靶mRNA的能力還牽涉微RNA的靶選擇性可能依賴于細(xì)胞微環(huán)境的事實(shí)。
[0259]我們使用探測(cè)方法和進(jìn)行前列腺組織中微RNA表達(dá)與mRNA表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)分析。然而不希望受理論束縛，在本文中本
【發(fā)明者】現(xiàn)相信，如果目的微RNA影響靶mRNA的轉(zhuǎn)錄物豐度，則該方法是成功的，但如果靶基因只受翻譯抑制調(diào)控，則其是失敗的。
[0260]我們發(fā)現(xiàn)，在前列腺腫瘤中miR-Ι的表達(dá)與許多計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的靶基因例如XP06呈負(fù)相關(guān)。然而，我們還發(fā)現(xiàn)，腫瘤miR-Ι的表達(dá)與預(yù)測(cè)的靶例如PTK9的轉(zhuǎn)錄物水平呈正相關(guān)。在細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)這些觀察結(jié)果的隨后驗(yàn)證確認(rèn)，XP06和PTK9在前列腺癌細(xì)胞中受miR-1調(diào)控。
[0261]該數(shù)據(jù)提供了微RNA與3’ UTR序列的結(jié)合可導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被靶向的mRNA的降解和積累以及人組織中微RNA與mRNA之間的負(fù)相關(guān)和正相關(guān)可預(yù)示微RNA的靶基因的新證據(jù)。因此，可證明人組織中微RNA和mRNA表達(dá)的關(guān)聯(lián)分析在鑒定受微RNA調(diào)控的mRNA中是有用的。
[0262]我們現(xiàn)已鑒定了在人前列腺腫瘤中發(fā)生并且與這些組織中蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)變化相關(guān)的微RNA表達(dá)的變化。細(xì)胞培養(yǎng)物中的實(shí)驗(yàn)顯示，腫瘤微RNA可在人前列腺癌細(xì)胞中調(diào)控癌癥相關(guān)基因的表達(dá)。這些結(jié)果顯示微RNA在前列腺癌生物學(xué)中的致病性作用。
[0263]實(shí)施例1I
[0264]引言
[0265]前列腺癌是最頻繁診斷的惡性腫瘤并且是美國(guó)男性癌癥死亡率的第二大原因[I]。死亡率可歸因于癌細(xì)胞在前列腺外的擴(kuò)散。神經(jīng)周浸潤(rùn)(PNI)是前列腺癌中局部浸潤(rùn)的主要途徑并且也是疾病的前列腺外擴(kuò)散的機(jī)制[2]。然而，PNI的預(yù)后意義仍然存在爭(zhēng)議[3-5]。幾個(gè)研究已觀察到PNI與不良結(jié)果的標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)[2，6-8]，但其他研究未發(fā)現(xiàn)其為前列腺癌的預(yù)后因素[9-12]。 [0266]PNI的發(fā)生是臨床疾病的發(fā)展中相對(duì)早期的事件，并且大多數(shù)來(lái)自根治性前列腺切除術(shù)的腫瘤樣品是PNI陽(yáng)性的[2]。正是臨床樣品中PNI的高發(fā)生率(85%至100%)和其生物學(xué)知識(shí)的不足限制了我們對(duì)PNI在前列腺癌進(jìn)展和疾病結(jié)果中的作用的理解。
[0267]PNI是其中癌細(xì)胞附著至和環(huán)繞神經(jīng)的過(guò)程[13，14]。其在許多其他類型的癌癥包括胰腺癌和頭頸癌中發(fā)生[15，16]。具有神經(jīng)周圍定位的前列腺癌細(xì)胞獲得了存活和生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)并且當(dāng)與遠(yuǎn)離神經(jīng)的細(xì)胞相比較時(shí)，展示減少的細(xì)胞凋亡和增加的增殖[17，18]。已在PNI中觀察到粘著分子在前列腺癌細(xì)胞和相鄰神經(jīng)中的表達(dá)發(fā)生改變，已假設(shè)此類分子的改變的表達(dá)允許癌細(xì)胞在神經(jīng)的附近旺盛生長(zhǎng)[14，19]。
[0268]然而，導(dǎo)致PNI的分子機(jī)制仍然知之甚少。
[0269]在實(shí)施例1I中，本
【發(fā)明者】將微RNA和蛋白質(zhì)編碼基因的基因表達(dá)特征譜分析用于鑒定在人前列腺癌中與PNI相關(guān)的基因表達(dá)的變化。本
【發(fā)明者】研究，區(qū)別PNI與非PNI腫瘤的基因表達(dá)特征是否將顯示在從非侵襲性腫瘤轉(zhuǎn)變成具有PNI的腫瘤時(shí)發(fā)生的分子改變。我們測(cè)定了微RNA，因?yàn)橐炎C明它們?cè)诎┌Y中的至關(guān)重要的作用[20，21]。已顯示它們的表達(dá)特征譜根據(jù)發(fā)育譜系和分化狀態(tài)分類腫瘤[22，23]。
[0270]用于實(shí)施例1I的材料和方法
[0271]組織樣品。
[0272]從NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource (CPCTR)獲得冷凍的腫瘤樣品。腫瘤是在前列腺切除術(shù)前未接受任何治療的切除的腺癌。由病理學(xué)家再檢查宏觀解剖的腫瘤樣品，其確認(rèn)冷凍樣品中存在腫瘤。在2002至2004年收集所有組織。組織收集由參與單位的制度評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)。
[0273]RNA 提取。
[0274]按照制造商的說(shuō)明書(Invitrogen, Carlsbad, CA)使用TRIZOL試劑分離總RNA。使用 Agilent2100B1analyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)驗(yàn)證各樣品的 RNA完整性。然后將各RNA樣品分成兩等分，其經(jīng)處理用于微RNA微陣列或mRNA微陣列。
[0275]基因微陣列
[0276]如之前所述[24]進(jìn)行微RNA的標(biāo)記和雜交。微RNA微陣列(Oh1 StateUniversity Comprehensive Cancer Center, Vers1n2.0)含有以一式四份點(diǎn)印的針對(duì) 235個(gè)人和222個(gè)小鼠微RNA的探針[24]。按照Affymetrix標(biāo)準(zhǔn)方案(Santa Clara, CA)進(jìn)行mRNA標(biāo)記和雜交。簡(jiǎn)而言之，用在5’末端具有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的寡聚(dT)引物反轉(zhuǎn)錄5yg總RNA。在第二鏈合成后，通過(guò)使用來(lái)自Enzo Life Sciences (Farmingdale,NY)的 B1Array High Yield RNA Transcript Labeling Kit T3 整合生物素化的核糖核苷酸來(lái)產(chǎn)生cRNA。將標(biāo)記的cRNA片段化，然后與Affymetrix GeneChip HG-U133A2.0陣列雜交。該陣列包含代表大約13，000個(gè)人蛋白質(zhì)編碼基因的22，283個(gè)探針組。使用藻紅蛋白綴合的鏈霉抗生物素蛋白(Invitrogen)顯現(xiàn)雜交信號(hào)，并且使用GeneChipScanner30007G(Affymetrix)進(jìn)行掃描。根據(jù)關(guān)于微陣列實(shí)驗(yàn)的最小信息(MIAME)指南，我們將額外的患者信息和微陣列數(shù)據(jù)的CEL文件保存在GEO庫(kù)(.ncb1.nlm.nih.gov/geo/)。微RNA和mRNA特征譜數(shù)據(jù)的GEO提交登錄號(hào)都是GSE7055。可在ArrayExpress登錄號(hào):A-MEXP-258下找到關(guān)于定制的微RNA微陣列(版本2.0)的其他信息。
[0277]數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計(jì)分析。
[0278]將中值-中心標(biāo)準(zhǔn)化用于定制的微RNA寡核苷酸芯片。使用魯棒多芯片分析(RMA)方法[25]標(biāo)準(zhǔn)化Affymetrix芯片。為了產(chǎn)生顯著差異表達(dá)的基因的清單，將所得的數(shù)據(jù)組經(jīng)歷微陣列顯著性分析(SAM)方法[26]。我們基于來(lái)自雙側(cè)t檢驗(yàn)的P值和期望的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)產(chǎn)生基因清單。FDR計(jì)算按照Storey和Tibshirani描述的方法[27]進(jìn)行。按照Eisen等人描述的原理[28]進(jìn)行無(wú)監(jiān)督層次聚類。
[0279]微RNA和mRNA的定量實(shí)時(shí)PCR分析。
[0280] 按照公開的方案[29]使用MicroRNA Assays試劑盒(Applied
B1systems, Foster City, CA)測(cè)量成熟微 RNA 的豐度。使用來(lái)自 TaqMan? MicroRNA
Assays試劑盒的成熟微RNA特異性環(huán)狀RT引物和來(lái)自TaqMan? MicroRNA ReverseTranscript1n試劑盒(Applied B1systems)的試劑，按照制造商的指導(dǎo)使用1ng總RNA,將成熟微 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 5’ -延伸的 cDNA。使用 Applied B1systems Taqman? 2X
Universal PCR Master Mix 和合適的 5X TaqiMIl? MicroRNAAssay Mix 就各目的微 RNA對(duì)
cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。在96孔板中，將一式三份反應(yīng)物在Applied B1systems7500Real-TimePCR系統(tǒng)中于95°C下溫育10分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的在95°C下15秒和在60°C下I分鐘。對(duì)于各樣品，利用ABI7500Sequence Detect1nSystem軟件計(jì)算循環(huán)閾值(Ct)。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品中微RNA的濃度，然后將其相對(duì)于U6RNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。按照之前描述的定量實(shí)時(shí)(qRT)PCR法[30]測(cè)定mRNA的豐度。因此，使用High-Capacity cDNA Archive試劑盒(Applied B1systems,Foster City, CA)逆轉(zhuǎn)錄 10ng 總 RNA。然后使用 TaqMan GeneExpress1n Assays (Applied B1systems)(其包括特異于待驗(yàn)證的基因的預(yù)先最優(yōu)化的探針和引物組)以一式三份進(jìn)行qRT-PCR。驗(yàn)證的基因的測(cè)定ID號(hào)如下:Hs00744661_sH(對(duì)于
金屬硫蛋白1F)和Hs00828387_gl(對(duì)于金屬硫蛋白1M)。使用ABI PRISM? 7500SequenceDetect1n System收集數(shù)據(jù)。將18s RNA用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)參照。使用如所描述的比較Ct法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)，倍數(shù)變化來(lái)源于各基因的值[30]。
[0281]免疫組織化學(xué)
[0282]在福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤切片上對(duì)神經(jīng)周圍和非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué)評(píng)估。腫瘤(n=30)來(lái)自Baltimore VA Hospital和University of Maryland Medical Center的通過(guò)根治性前列腺切除術(shù)治療的前列腺患者。就SlOO (神經(jīng)干的標(biāo)志物)對(duì)5微米切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以顯現(xiàn)具有PNI的區(qū)域。發(fā)現(xiàn)來(lái)自14個(gè)腫瘤的切片包含具有神經(jīng)周圍和非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞的代表性區(qū)域。為了進(jìn)行抗原恢復(fù)，將脫臘的切片在Ix Citra緩沖液(B1genex, San Ramon, CA)中進(jìn)行微波處理。用Dako Envis1n系統(tǒng)(DakoCytomat1n,Carpinteria,CA)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。使用下列一抗:1:500稀釋的兔多克隆抗體(對(duì)于S100) (Ventana, Tucson, AR) ; 1:1000稀釋的小鼠單克隆抗體(對(duì)于柯薩奇腺病毒受體(CXADR)) (Atlas Antibodies, Stockholm, Sweden);和1:500稀釋的小鼠單克隆抗體(對(duì)于金屬硫蛋白)(DakoCytomat1n)。該抗體(E9)識(shí)別金屬硫蛋白-1和-2家族成員(#M0639)。陽(yáng)性對(duì)照:腸(CXADR)和肝(金屬硫蛋白)。一抗的省略用作陰性對(duì)照。對(duì)微陣列結(jié)果不知情的病理學(xué)家評(píng)估神經(jīng)周圍和非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞的免疫染色的強(qiáng)度，將神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中的免疫染色分類為更低的強(qiáng)度、相同強(qiáng)度或更高的強(qiáng)度(與非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞相比較)。獲取代表性區(qū)域的圖像以記錄表達(dá)差異。
[0283]原位雜交。
[0284]按照制造商的方案，使用GenPoint? Catalyzed Signal Amplificat1nSystem (DakoCytomat1n)進(jìn)行原位雜交(ISH)。簡(jiǎn)而言之,將載玻片在60°C下溫育30分鐘，并且如所描述的進(jìn)行脫臘。切片用蛋白酶K(DakoCytomat1n)在室溫下處理30分鐘，用dH20漂洗數(shù)次，然后在風(fēng)干前于95%乙醇中浸潰10秒鐘。在以50nM的終濃度含有5’ -生物素標(biāo)記的miR-224miRCURY? LNA檢測(cè)探針(Exiqon，Woburn, MA)或亂序的陰性對(duì)照探針(Exiqon)的緩沖液中于54°C下溫育過(guò)夜之前，將載玻片在54°C下用原位雜交緩沖液(Enzo Life Sciences, Inc.Farmingdale, NY)預(yù)雜交 I 小時(shí)。將載玻片在 TBST 和GenPoint?嚴(yán)格清洗液中進(jìn)行清洗(在54°C下進(jìn)行30分鐘)。然后將載玻片暴露于H2O2封閉溶液(DakoCytomat1n) 20分鐘，然后在封閉緩沖液(DakoCytomat1n, X0909)中進(jìn)一步封閉30分鐘，然后按照制造商的方案將其暴露于第一鏈霉抗生物素-HRP抗體、生物素基酪胺(b1tinyl tyramide)、第二鏈霉抗生物素-HRP抗體和DAB色原體溶液。然后將載玻片于蘇木精中進(jìn)行短暫復(fù)染，在封片之前用TBST和水漂洗。病理學(xué)家使用相同的用于免疫組織化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估神經(jīng)周圍和非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中的miR-224的ISH強(qiáng)度。
[0285]途徑分析。
[0286]使用內(nèi)部WPS軟件[31]進(jìn)行該分析。按照基因本體論生物過(guò)程(GOBP) (GeneOntology Consortium: geneontology.0rg)注釋途徑。我們的數(shù)據(jù)庫(kù)具有16，762個(gè)針對(duì)GOBP進(jìn)行注釋的人基因?；谖㈥嚵猩纤鼈兊南鄳?yīng)探針組的FDR( ( 30%)將基因包括入途徑分析。如果幾個(gè)探針組編碼相同基因，那么軟件可識(shí)別該現(xiàn)象并且確保在途徑水平上只對(duì)該基因進(jìn)行一次顯著性測(cè)試。將單側(cè)Fisher’s精確檢驗(yàn)用于確定具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異表達(dá)的基因的富集(P〈0.05)的生物過(guò)程。我們匯集Fisher’s精確檢驗(yàn)的結(jié)果以進(jìn)行聚類分析，并且以顏色編碼的熱圖展示結(jié)果以揭示顯著改變的生物過(guò)程的模式。熱圖的顏色編碼與生物過(guò)程中基因的富集相關(guān)(基于-Log(P值))，紅色表示更高的富集。
[0287]實(shí)施例1I的結(jié)果
[0288]臨床樣品和基因表達(dá)分析。
[0289]我們從57位前列腺癌患者的根除性前列腺切除術(shù)收集了宏觀解剖的腫瘤樣品(圖22-表8)。7個(gè)腫瘤(12%)對(duì)于PNI是陰性的。與文獻(xiàn)一致，這些腫瘤與PNI陽(yáng)性腫瘤相比具有更小的大小和更低的Gleason評(píng)分。此外，所有PNI陰性腫瘤局限于前列腺。我們研究了具有PNI的腫瘤與對(duì)于PNI是陰性的腫瘤之間的基因表達(dá)差異。使用代表235個(gè)人微RNA的定制的微RNA微陣列和代表大約13，000個(gè)人蛋白質(zhì)編碼基因的AffymetrixGeneChip HG-U133A2.0陣列產(chǎn)生來(lái)自這些腫瘤的基因表達(dá)特征譜。
[0290]在我們的數(shù)據(jù)組的初步分析中，我們將無(wú)監(jiān)督層次聚類用于檢查微RNA和mRNA的表達(dá)是否可區(qū)分具有PNI的腫瘤和不具有PNI的腫瘤?；趍RNA的全局性表達(dá)的層次聚類不能區(qū)分PNI病例與非PNI病例(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，這些樣品的微RNA的表達(dá)模式產(chǎn)生了具有不同微RNA特征譜的兩個(gè)主要簇(圖17A-17B)。簇#1包括所有非PNI腫瘤和具有PNI的腫瘤的亞組。簇#2包括比簇#1中的腫瘤明顯更可能具有高Gleason評(píng)分(> 7)和前列腺外疾病擴(kuò)展的PNI腫瘤(分別地，P〈0.05;雙側(cè)Fisher’s精確檢驗(yàn))。
[0291]微陣列數(shù)據(jù)的顯著性分析顯示，在FDR ( 10%的情況下，19個(gè)微RNA和34個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因在PNI與非PNI腫瘤之間顯著地差異表達(dá)。在該閾值上，所有微RNA在具有PNI的腫瘤中上調(diào)(圖23-表9) ，而所有mRNA在PNI腫瘤中具有比在非PNI腫瘤中更低的表達(dá)(圖 24-表 10)。
[0292]差異表達(dá)的微RNA的該清單在我們的數(shù)據(jù)組中對(duì)于PNI與非PNI腫瘤之間的比較是獨(dú)特的。此類微RNA中沒有一個(gè)因腫瘤分級(jí)或分期而顯著地差異表達(dá)(FDR〈30%)。與PNI對(duì)非PNI的比較相反，只有極少數(shù)微RNA在高(總評(píng)分7-9)和低(總評(píng)分5_6) Gleason評(píng)分之間(例如，miR-Ι在具有高Gleason評(píng)分的腫瘤中下調(diào))以及在器官局限性腫瘤與具有前列腺外擴(kuò)展的腫瘤之間顯著地差異表達(dá)。在PNI與非PNI腫瘤之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因中，許多基因編碼金屬硫蛋白(金屬硫蛋白1F、1G、1H、1M、1X、2A)或具有線粒體定位的蛋白質(zhì)(4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶、亞鐵螯合酶和長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶、線粒體核糖體蛋白L39/S1)。當(dāng)與低Gleason評(píng)分腫瘤相比較時(shí),此類基因的亞組也在具有高Gleason評(píng)分的腫瘤中下調(diào)(圖19A-19D)。與因腫瘤分期而差異表達(dá)的基因不存在重疊。
[0293]通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行的對(duì)微陣列數(shù)據(jù)的驗(yàn)證。
[0294]選擇5個(gè)微RNA和2個(gè)mRNA用于通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證(圖25-表11)。與微陣列數(shù)據(jù)一致，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與非PNI腫瘤相比較時(shí)，成熟miR-224、miR-?Ο、miR_125b、miR-30c和miR-100在PNI腫瘤中的表達(dá)顯著更高。當(dāng)與非PNI腫瘤相比較時(shí)，金屬硫蛋白IM和IF的轉(zhuǎn)錄物水平在PNI腫瘤中顯著更低，這也與我們的微陣列數(shù)據(jù)一致。
[0295]因PNI狀態(tài)而差異表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因的途徑關(guān)聯(lián)。
[0296]我們基于GOBP注釋的基因(n=62)進(jìn)行途徑分析，所述基因的mRNA在FDR ( 30%時(shí)在PNI與非PNI腫瘤之間差異表達(dá)。分析顯示了富集差異表達(dá)的基因(比較PNI腫瘤與非PNI腫瘤)的許多生物過(guò)程。最顯著改變的生物過(guò)程包括有機(jī)酸(羧酸)/脂肪酸、氨基酸和(聚)胺的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(圖26-表12)。它們還包括“神經(jīng)發(fā)生”的生物過(guò)程，這與PNI中腫瘤細(xì)胞與神經(jīng)之間的已知的相互作用一致。[0297]進(jìn)行聚類分析以鑒定富集因腫瘤PNI狀態(tài)(PNI陽(yáng)性對(duì)PNI陰性)而非因Gleason評(píng)分(高對(duì)低Gleason評(píng)分)、病理分期(pT3對(duì)ρΤ2)、或因前列腺外擴(kuò)展的存在(存在對(duì)不存在)而差異表達(dá)的基因的生物過(guò)程。如通過(guò)熱圖顯示的，分析鑒定了獨(dú)特地富集比較PNI陽(yáng)性與PNI陰性腫瘤而產(chǎn)生的差異表達(dá)的基因的許多生物過(guò)程(圖18)。這些生物過(guò)程包括有機(jī)酸(羧酸)/脂肪酸、氨基酸和(聚)胺的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，如之前所描述的，還包括與程序化細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控相關(guān)的過(guò)程。
[0298]神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中金屬硫蛋白、柯薩奇腺病毒受體和miR-224的表達(dá)。
[0299]盡管我們的基于微陣列的分析表明，PNI與非PNI腫瘤在它們的基因表達(dá)模式上不同，但該方法未提供關(guān)于此類基因在神經(jīng)周圍和非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中的表達(dá)的信息。我們使用免疫組織化學(xué)和原位雜交來(lái)研究?jī)煞N蛋白質(zhì)編碼基因，金屬硫蛋白(金屬硫蛋白-1和-2)和柯薩奇腺病毒受體(CXADR)以及miR-224在神經(jīng)周圍和非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)。對(duì)來(lái)自14個(gè)腫瘤的切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)，所述切片包含神經(jīng)周圍和非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞的代表性區(qū)域。對(duì)來(lái)自11個(gè)腫瘤的切片進(jìn)行原位雜交。
[0300]已發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白、CXADR和miR-224在腫瘤上皮中表達(dá)(圖19A-19D，圖20A-20D和圖21A-21D)。金屬硫蛋白(上皮、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核)和CXADR(上皮、膜、細(xì)胞質(zhì))的標(biāo)記模式與其他研究人員描述的一致[32，33]。當(dāng)與相同組織中的非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞相比較時(shí)，分別在6個(gè)腫瘤(43%)和7個(gè)腫瘤(50%)的神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中觀察到金屬硫蛋白和CXADR的更低的表達(dá)(圖19A-19D，圖20A-20D)。除了一個(gè)腫瘤(7%)外(其中金屬硫蛋白的表達(dá)在神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中的評(píng)分比非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞更高)，在其他腫瘤中未檢測(cè)到差異。在4個(gè)腫瘤(36%)中觀察到，miR-224在神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加(圖21A-21D)。在其他7個(gè)腫瘤(其中miR-224的表達(dá)在腫瘤上皮中大部分低至不可檢測(cè))中未看到這樣的差異。
[0301]實(shí)施例1I的討論
[0302]我們研究了 PNI與非PNI腫瘤的基因表達(dá)特征譜并且發(fā)現(xiàn)它們之間的微RNA與mRNA的表達(dá)的顯著差異。最令人驚訝的是，基于235個(gè)微RNA的表達(dá)的無(wú)監(jiān)督層次聚類分析產(chǎn)生兩個(gè)主要的腫瘤簇，其中一個(gè)包括所有非PNI腫瘤?；?3，000個(gè)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，我們不能獲得這樣的分類，這與不能發(fā)現(xiàn)前列腺癌中與局部侵襲相關(guān)的mRNA表達(dá)特征的其他研究一致[34]。
[0303]我們的發(fā)現(xiàn)顯示，當(dāng)與非PNI腫瘤相比較時(shí)，微RNA的表達(dá)可以是比mRNA表達(dá)更獨(dú)特的PNI腫瘤特征。這些發(fā)現(xiàn)與之前的報(bào)導(dǎo)一致，所述報(bào)導(dǎo)顯示微RNA表達(dá)特征譜在根據(jù)發(fā)育譜系和分化狀態(tài)分類腫瘤中可優(yōu)于mRNA表達(dá)特征譜[22，23]。
[0304]發(fā)現(xiàn)19個(gè)微RNA在PNI腫瘤中比在非PNI腫瘤中更高地表達(dá)。其中，miR-10、miR-21和miR-125b是候選癌基因[35-37]。此外，miR-21和miR-224位于惡性腫瘤相關(guān)染色體區(qū)域，已發(fā)現(xiàn)該區(qū)域在人前列腺癌中具有增加的基因表達(dá)[38]。已描述了對(duì)于幾種人實(shí)體癌包括前列腺癌是共同的微RNA表達(dá)特征[23]。該研究與我們的PNI特征之間的共有微RNA是miR-21、miR-24和miR-30c。然而，最值得注意的是，PNI特征與在實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)現(xiàn)的其他微RNA特征的重疊。
[0305]已發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)miR-24、miR_26、miR-27 和 miR-181 [39]。此類微 RNA 也在 PNI腫瘤中上調(diào)。甚至更顯著的是PNI特征與LPS處理的小鼠的肺中炎癥誘導(dǎo)的微RNA特征之間的相似性。此處，LPS誘導(dǎo)，除幾種其他的微RNA以外，miR-21, miR-27b, miR-100和miR-224 [40]。因此，觀察到的PNI微RNA特征可能部分地是癌性前列腺中促炎環(huán)境和缺氧的結(jié)果。
[0306]為了估計(jì)PNI特征中由腫瘤分級(jí)和分期產(chǎn)生混雜效應(yīng)的可能性，我們將在PNI與非PNI腫瘤之間差異表達(dá)的微RNA的清單與比較高Gleason評(píng)分的腫瘤與低Gleason評(píng)分的腫瘤以及比較器官局限性腫瘤與顯示前列腺外擴(kuò)展的腫瘤得到的相同清單相比較。該額外的分析顯示，這兩個(gè)對(duì)比不共有PNI特征。相反地，只發(fā)現(xiàn)極少數(shù)微RNA因腫瘤分級(jí)和分期而顯著差異地表達(dá)。前列腺腫瘤的異質(zhì)性可能已限制我們發(fā)現(xiàn)與這兩個(gè)預(yù)后因素相關(guān)的微RNA特征的能力。備選地，PNI特征對(duì)于非PNI至PNI的轉(zhuǎn)換可以是顯著不同和獨(dú)特的并且可能特異性地參與神經(jīng)與癌細(xì)胞之間的相互作用。該特征還可以是癌細(xì)胞的瞬時(shí)現(xiàn)象，當(dāng)這些細(xì)胞從它們的神經(jīng)周圍定位擴(kuò)散時(shí)，該特征消失。我們分析miR-224(因PNI狀態(tài)而最差異地表達(dá)的微RNA)在神經(jīng)周圍和非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中的表達(dá)并且發(fā)現(xiàn)其在腫瘤亞組的神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中表達(dá)增加。雖然并非所有腫瘤都顯示miR-224在神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中上調(diào)，但觀察顯示，癌細(xì)胞籍以附著至神經(jīng)的機(jī)制可牽涉miR-224的誘導(dǎo)。
[0307]mRNA表達(dá)特征譜的分析顯示，在FDR閾值≤ 10%時(shí)34個(gè)基因在PNI腫瘤中下調(diào)。即使我們觀察到在PNI腫瘤中比在非PNI腫瘤中更高表達(dá)的基因例如CRISP3，PSCA, BMP7或BCL2，它們的高FDR也將它們排除出我們的顯著差異表達(dá)的基因的清單。只有兩個(gè)其他的研究(使用DU-145前列腺癌細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞的共培養(yǎng)模型)檢查了與PNI相關(guān)的mRNA的表達(dá)特征譜[18，19]。這些研究發(fā)現(xiàn)編碼bystin和Pim_2的基因在PNI中上調(diào)。我們?cè)赑NI腫瘤中未檢測(cè)到相應(yīng)的mRNA的增加。不同的方法可解釋不同研究中產(chǎn)生的基因清單之間的一些差異。此外，我們的芯片不包括針對(duì)編碼bystin的基因的探針組。
[0308] 34個(gè)差異表達(dá)的基因中的幾個(gè)基因是金屬硫蛋白基因家族的成員。這些基因位于染色體16ql3上的基因簇中[41]并且已發(fā)現(xiàn)這些基因通過(guò)啟動(dòng)子超甲基化和減少的鋅可用性在前列腺癌中下調(diào)[32，42，43]。通過(guò)免疫組織化學(xué)，我們確認(rèn)，當(dāng)與前列腺腫瘤亞組中非神經(jīng)周圍癌細(xì)胞相比較時(shí)，金屬硫蛋白的表達(dá)在神經(jīng)周圍癌細(xì)胞中顯著更低。在從非PNI腫瘤至pNI腫瘤的轉(zhuǎn)換時(shí)的下調(diào)可顯示在該疾病期發(fā)生的癌細(xì)胞金屬代謝的重要變化。我們的差異表達(dá)的基因的清單中幾個(gè)其他基因編碼具有線粒體定位的蛋白質(zhì)，例如，特別地，4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶、亞鐵螯合酶和長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶。氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶和長(zhǎng)鏈酰基輔酶A脫氫酶是細(xì)胞的有機(jī)酸(羧酸)代謝(例如酮體，脂肪酸)中的至關(guān)重要的基因，而亞鐵螯合酶參與血紅素的生物合成[44]。線粒體的代謝和基因組的改變是前列腺癌發(fā)生中的常見事件[45-47]。我們的數(shù)據(jù)顯示，一些此類改變可在至PN1-陽(yáng)性腫瘤的轉(zhuǎn)換中發(fā)生。
[0309]發(fā)現(xiàn)其在PNI腫瘤中下調(diào)的其他基因是編碼精胺合酶、v-MAF癌基因同源物(MAF)和CXADR的基因。精胺合酶是催化亞精胺轉(zhuǎn)化為精胺的多胺合成途徑的至關(guān)重要的酶。已觀察到多胺合成途徑在前列腺癌中轉(zhuǎn)錄失調(diào)[48]。精胺是前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的內(nèi)源抑制劑
[49]。因此，精胺合酶的下調(diào)可允許前列腺癌細(xì)胞在神經(jīng)周圍環(huán)境中增加生長(zhǎng)和存活。MAF是淋巴瘤和骨髓瘤的癌基因，但發(fā)現(xiàn)其為前列腺癌的候選腫瘤抑制基因[50]。CXADR在腺病毒至人細(xì)胞內(nèi)的攝取中具有至關(guān)重要的功能[51]。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)與正常前列腺相比較時(shí)，該受體在局部晚期前列腺癌中下調(diào)[33]。
[0310]因?yàn)閱位蛐?yīng)不可能引起PNI，所以我們進(jìn)行在PNI腫瘤與非PNI腫瘤之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因的途徑分析。該分析顯示，當(dāng)與非PNI腫瘤相比較時(shí)，PNI腫瘤中最顯著改變的生物過(guò)程是調(diào)控細(xì)胞和能量代謝的生物過(guò)程。其他改變的生物過(guò)程與神經(jīng)元功能例如神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞以及與細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控相關(guān)。后者與之前的發(fā)現(xiàn)(即，神經(jīng)周圍定位的前列腺癌細(xì)胞顯示減少的細(xì)胞凋亡和增加的存活)[17，18] 一致。
[0311]我們觀察到在從非PNI腫瘤轉(zhuǎn)換成PNI腫瘤時(shí)微RNA和mRNA表達(dá)發(fā)生顯著改變。無(wú)監(jiān)督層次聚類顯示，非PNI腫瘤與PNI腫瘤在它們的微RNA表達(dá)特征譜上的差異大于在它們的mRNA表達(dá)特征譜上的差異。我們還鑒定了與線粒體功能和細(xì)胞代謝相關(guān)的許多基因和生物過(guò)程，其在PNI中可以是功能上顯著的。
[0312]其用途和定義的實(shí)例
[0313]除非另外指出，否則本發(fā)明的實(shí)施將使用在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)的藥物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)方法。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中得到詳盡的解釋。參見，例如，Handbook of Experimental Immunology,第 1-1V 卷(D.M.Weir和 C.C.Blackwell eds., BlackwelI Scientific Publicat1ns) ;A.L.Lehninger,B1chemistry (Worth Publishers, Inc., current addit1n);Sambrook 等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual (第 2 版，1989) ;Methods In Enzymology (S.Colowick 和N.Kaplan eds., Academic Press, Inc.)。
[0314]因此，本文中提供了用于進(jìn)一步解釋的定義，所述定義不應(yīng)解釋為限定性的。 [0315]冠詞“a”和“an”在本文中是指一個(gè)或多于一個(gè)(即，至少一個(gè))冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。例如，“an element”是指一個(gè)元素或多于一個(gè)的元素。
[0316]“標(biāo)志物”和“生物標(biāo)志物”是與其在正常或健康組織或細(xì)胞中的表達(dá)水平相比，其在組織或細(xì)胞中改變的表達(dá)水平與病癥和/或疾病狀態(tài)相關(guān)的基因和/或蛋白質(zhì)和/或其功能性變體。
[0317]標(biāo)志物的“正?！钡谋磉_(dá)水平是標(biāo)志物在未患病癥和/或疾病狀態(tài)的人受試者或患者的細(xì)胞中的表達(dá)水平。
[0318]標(biāo)志物的“過(guò)表達(dá)”或“顯著更高的表達(dá)水平”是指測(cè)試樣品中的表達(dá)水平，所述表達(dá)水平高于用于估量表達(dá)的測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)誤，在某些實(shí)施方案中，至少2倍，在其他實(shí)施方案中，3、4、5或10倍于對(duì)照樣品(例如，來(lái)自未患有標(biāo)志物相關(guān)病癥和/或疾病狀態(tài)的健康受試者的樣品)中的標(biāo)志物的表達(dá)水平和在某些實(shí)施方案中幾個(gè)對(duì)照樣品中的標(biāo)志物的平均表達(dá)水平。
[0319]標(biāo)志物的“顯著更低的表達(dá)水平”是指測(cè)試樣品中的表達(dá)水平，所述表達(dá)水平比對(duì)照樣品(例如，來(lái)自未患有標(biāo)志物相關(guān)病癥和/或疾病狀態(tài)的健康受試者的樣品)中的標(biāo)志物的表達(dá)水平和在某些實(shí)施方案中幾個(gè)對(duì)照樣品中的標(biāo)志物的平均表達(dá)水平低至少2倍，在其他實(shí)施方案中低3、4、5或10倍。
[0320]試劑盒是包含至少一種試劑，例如用于特異性檢測(cè)標(biāo)志物的表達(dá)的探針的任何產(chǎn)品(例如，包裝或容器)?？梢砸杂糜谶M(jìn)行本發(fā)明的方法的單位的形式推銷(promote)、分配或銷售試劑盒。
[0321]“蛋白質(zhì)”包括標(biāo)志物蛋白和它們的片段；變異標(biāo)志物蛋白和它們的片段；包含標(biāo)志物或變異標(biāo)志物蛋白的至少15個(gè)氨基酸的區(qū)段的肽和多肽；以及包含標(biāo)志物或變異標(biāo)志物蛋白，或標(biāo)志物或變異標(biāo)志物蛋白的至少15個(gè)氨基酸的區(qū)段的融合蛋白。[0322]本文中所述的組合物、試劑盒和方法特別地具有下列非限定性用途:
[0323]I)評(píng)估受:試者是否患有病癥和/或疾病狀態(tài)；
[0324]2)評(píng)估受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的分期；
[0325]3)評(píng)估受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的分級(jí)；
[0326]4)評(píng)估受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的性質(zhì)；
[0327]5)評(píng)估受試者發(fā)生病癥和/或疾病狀態(tài)的可能性；
[0328]6)評(píng)估與受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞的組織學(xué)類型；
[0329]7)制備可用于治療受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的抗體、抗體片段或抗體衍生物；
[0330]8)評(píng)估病癥和/或疾病狀態(tài)在受試者的細(xì)胞中的存在；
[0331]9)評(píng)估一種或多種測(cè)試化合物抑制受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的功效；
[0332]10)評(píng)估療法抑制受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的功效；
[0333]11)監(jiān)控受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的進(jìn)展；
[0334]12)選擇抑制受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的組合物或療法；
[0335]13)治療患有病癥和/或疾病狀態(tài)的受試者；
[0336]14)抑制受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)；
[0337]15)評(píng)估測(cè)試化合物的有害潛能；和
[0338]16)預(yù)防處于發(fā)生病癥和/或疾病狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的發(fā)作。
[0339]篩選方法
[0340]可產(chǎn)生動(dòng)物模型以使能夠篩選可用于治療或預(yù)防受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的治療劑。因此，該方法可用于鑒定用于治療或預(yù)防受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的治療劑。該方法包括對(duì)由本文所述的方法產(chǎn)生的動(dòng)物模型施用候選試劑，評(píng)估與未施用候選試劑的對(duì)照動(dòng)物模型相比動(dòng)物模型中的至少一種應(yīng)答。如果至少一種應(yīng)答在癥狀上減輕或在發(fā)作上延遲，則候選試劑是用于治療或預(yù)防疾病的試劑。
[0341]候選試劑可以是本領(lǐng)域已知的藥理學(xué)試劑(pharmacologic agent)或可以是之前未知具有任何藥理活性的試劑。試劑可以是天然產(chǎn)生的或?qū)嶒?yàn)室中設(shè)計(jì)的。它們可從微生物、動(dòng)物或植物分離，或可重組產(chǎn)生或通過(guò)任何適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法合成。它們可以是小分子、核酸、蛋白質(zhì)、肽或模擬肽(peptidomimetics)。在某些實(shí)施方案中，候選試劑是具有大于50且小于大約2，500道爾頓的分子量的小有機(jī)化合物。候選試劑包含與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性相互作用所必需的官能團(tuán)。還在生物分子中發(fā)現(xiàn)候選試劑，包括但不限于:肽、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合。
[0342]可從多種來(lái)源(包括合成的或天然化合物的文庫(kù))獲得候選試劑。存在例如許多可獲得用于隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物和生物分子的方法，包括隨機(jī)化寡核苷酸和寡肽的表達(dá)。備選地，以細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物的形式存在的天然化合物的文庫(kù)是可獲得的或可容易地產(chǎn)生。此外，天然或合成產(chǎn)生的文庫(kù)和化合物可容易地通過(guò)常規(guī)化學(xué)、物理和生物學(xué)方法進(jìn)行修飾，并且可用于產(chǎn)生組合文庫(kù)。在某些實(shí)施方案中，候選試劑可使用組合文庫(kù)方法領(lǐng)域中的許多方法中的任一方法來(lái)獲得，所述方法包括非限定性實(shí)例:生物文庫(kù)法；空間可定位平行固相或溶液相文庫(kù)法(spatially addressable parallel solidphase or solut1n phase libraries);需要解卷積(deconvolut1n)的合成文庫(kù)法；“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文庫(kù)法；和使用親和層析選擇的合成文庫(kù)法。
[0343]在某些其他實(shí)施方案中，可將某些藥理學(xué)藥劑經(jīng)歷定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，例如?；?、酯化、酰胺化(amidificat1n)等以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
[0344]用于鑒定治療受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的治療劑的相同方法還可用于驗(yàn)證體外研究產(chǎn)生的前導(dǎo)化合物(lead compound) /試劑。
[0345]候選試劑可以是上調(diào)或下調(diào)受試者中一個(gè)或多個(gè)病癥和/或疾病狀態(tài)應(yīng)答途徑的試劑。在某些實(shí)施方案中，候選試劑可以是影響這樣的途徑的拮抗劑。
[0346]用于治療病癥和/或疾病狀態(tài)的方法
[0347]本文提供了用于治療、抑制、減輕或逆轉(zhuǎn)病癥和/或疾病狀態(tài)應(yīng)答的方法。在本文所述的方法中，對(duì)有此需要的個(gè)體施用干擾信號(hào)級(jí)聯(lián)的試劑，所述個(gè)體例如但不限于其中這樣的并發(fā)癥還不明顯的受試者和已具有至少一種這樣的應(yīng)答的受試者。
[0348]在前一種情況下，這樣的治療用于預(yù)防此類應(yīng)答的發(fā)生和/或減輕它們發(fā)生的程度。在后一種情況下，這樣的治療用于減輕此類應(yīng)答發(fā)生的程度，阻止它們進(jìn)一步發(fā)展或逆轉(zhuǎn)所述應(yīng)答。
[0349]在某些實(shí)施方案中，干擾應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑可以是對(duì)此類應(yīng)答特異的抗體。
[0350]生物標(biāo)志物的表達(dá)
[0351]可以以許多方式抑制標(biāo)志物的表達(dá)，所述方式包括非限定性實(shí)例:可對(duì)疾病細(xì)胞提供反義寡核苷酸以抑制標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄、翻譯或兩者。備選地，可對(duì)細(xì)胞提供編碼特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段并且與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子/調(diào)節(jié)子區(qū)域有效連接的多核苷酸，以產(chǎn)生抑制所述蛋白的功能或活性的細(xì)胞內(nèi)抗體。標(biāo)志物的表達(dá)和/或功能還可通過(guò)用特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段處理疾病細(xì)胞來(lái)抑制。通過(guò)使用本文中描述的方法，可篩選多種分子，特別地包括足夠小以使它們能夠穿過(guò)細(xì)胞膜的分子，以鑒定抑制標(biāo)志物的表達(dá)或抑制標(biāo)志物蛋白的功能的分子?？蓪?duì)受試者提供如此鑒定的化合物以抑制受試者的疾病細(xì)胞。
[0352]任何標(biāo)志物或標(biāo)志物的組合，以及與所述標(biāo)志物組合的任何特定標(biāo)志物可用于本文中描述的組合物、試劑盒和方法中。一般地，期望使用這樣的標(biāo)志物，對(duì)于所述標(biāo)志物，疾病細(xì)胞中該標(biāo)志物的表達(dá)水平與正常系統(tǒng)細(xì)胞中相同標(biāo)志物的表達(dá)水平之間的差異盡可能大。雖然該差異可以小至用于評(píng)估標(biāo)志物的表達(dá)的方法的檢測(cè)極限，但期望差異至少大于評(píng)估方法的標(biāo)準(zhǔn)誤，在一些實(shí)施方案中，與正常組織中相同標(biāo)志物的表達(dá)水平相比，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000 倍或更大的差異。
[0353]已公認(rèn)，某些標(biāo)志物蛋白被分泌至圍繞細(xì)胞的細(xì)胞外空間。由于此類標(biāo)志物蛋白可在體液樣品中檢測(cè)，因此將這些標(biāo)志物用于組合物、試劑盒和方法的某些實(shí)施方案，所述體液樣品可以比組織活檢樣品更容易地從人受試者收集。此外，用于檢測(cè)標(biāo)志物蛋白的體內(nèi)技術(shù)包括將抗所述蛋白的標(biāo)記抗體引入受試者。例如，抗體可用其在受試者中的存在和定位可利用標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)來(lái)檢測(cè)的放射性標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。
[0354]為了確定任何特定的標(biāo)志物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如人細(xì)胞系中表達(dá)標(biāo)志物蛋白，收集細(xì)胞外液體，評(píng)估蛋白質(zhì)在細(xì)胞外液體中的存在或不存在(例如，使用特異性結(jié)合所述蛋白的標(biāo)記抗體)。[0355]應(yīng)理解，含有此類細(xì)胞的受試者樣品可用于本文中所述的方法。在這些實(shí)施方案中，標(biāo)志物的表達(dá)水平可通過(guò)評(píng)估樣品中標(biāo)志物的量(例如，絕對(duì)量或濃度)來(lái)評(píng)估。當(dāng)然，可在評(píng)估樣品中標(biāo)志物的量之前將細(xì)胞樣品經(jīng)歷多種收集后制備和貯藏技術(shù)(例如，核酸和/或蛋白質(zhì)提取、固定、貯藏、冷凍、超濾、濃縮、蒸發(fā)、離心等)。
[0356]還應(yīng)理解，可使標(biāo)志物流出細(xì)胞進(jìn)入例如呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血流和/或間質(zhì)間隙。可以例如通過(guò)檢查痰、BAL、血清、血漿、尿、糞便等來(lái)檢測(cè)流出的標(biāo)志物。
[0357]組合物、試劑盒和方法可用于檢測(cè)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)，所述標(biāo)志物蛋白具有至少一個(gè)展示于表達(dá)其的細(xì)胞的表面上的部分。例如，可將免疫學(xué)方法用于檢測(cè)完整細(xì)胞上的此類蛋白，或可將基于計(jì)算機(jī)的序列分析法用于預(yù)測(cè)至少一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(即，包括分泌蛋白和具有至少一個(gè)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì))的存在?？蓹z測(cè)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)而無(wú)需裂解細(xì)胞(例如，使用特異性結(jié)合蛋白的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域的標(biāo)記抗體)，所述標(biāo)志物蛋白具有至少一個(gè)展示于表達(dá)其的細(xì)胞的表面上的部分。
[0358]標(biāo)志物的表達(dá)可通過(guò)多種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄的核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法中的任一種來(lái)評(píng)估。此類方法的非限定性實(shí)例包括用于檢測(cè)分泌蛋白、細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白或核蛋白的免疫學(xué)方法、蛋白質(zhì)純化法、蛋白質(zhì)功能或活性測(cè)定法、核酸雜交法、核酸逆轉(zhuǎn)錄法以及核酸擴(kuò)增法。
[0359]在特定的實(shí)施方案中，標(biāo)志物 的表達(dá)可使用特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或其片段(包括已經(jīng)歷所有或部分其正常翻譯后修飾的標(biāo)志物蛋白)的抗體(例如，放射性標(biāo)記的、發(fā)色團(tuán)標(biāo)記的、熒光團(tuán)標(biāo)記的或酶標(biāo)記的抗體)、抗體衍生物(例如，綴合有底物或蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-配體對(duì)的配體的抗體)或抗體片段(例如，單鏈抗體、分離的抗體高變結(jié)構(gòu)域等)來(lái)評(píng)估。
[0360]在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，標(biāo)志物的表達(dá)通過(guò)下述來(lái)評(píng)估:從受試者樣品的細(xì)胞制備mRNA/cDNA(即，轉(zhuǎn)錄的多核苷酸)，然后將mRNA/cDNA與為標(biāo)志物核酸的互補(bǔ)序列的參照多核苷酸或其片段雜交。任選地，可在與參照多核苷酸雜交前使用多種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法中的任一種來(lái)擴(kuò)增cDNA ;優(yōu)選，其不進(jìn)行擴(kuò)增。同樣可使用定量PCR檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物的表達(dá)以評(píng)估標(biāo)志物的表達(dá)水平。備選地，可使用檢測(cè)標(biāo)志物的突變或變體(例如，單核苷酸多態(tài)性、缺失等)的許多方法中的任一種來(lái)檢測(cè)受試者中標(biāo)志物的存在。
[0361]在相關(guān)實(shí)施方案中，將獲自樣品的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸的混合物與在其上固定有多核苷酸(其與標(biāo)志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更多個(gè)核苷酸殘基)互補(bǔ)或同源)的基質(zhì)接觸。如果可在基質(zhì)上差異地檢測(cè)到互補(bǔ)或同源的多核苷酸(例如，可使用不同的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)檢測(cè)或固定至不同的選擇的位置)，那么可使用單個(gè)基質(zhì)(例如，固定在所選擇的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微陣列)同時(shí)評(píng)估多個(gè)標(biāo)志物的表達(dá)水平。當(dāng)使用包括將一個(gè)核酸與另一個(gè)核酸雜交的評(píng)估標(biāo)志物表達(dá)的方法時(shí)，期望在嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行雜交。
[0362]在某些實(shí)施方案中，可使用質(zhì)譜法或表面等離子共振術(shù)進(jìn)行生物標(biāo)志物測(cè)定(b1marker assay)。在不同的實(shí)施方案中，鑒定活性抗受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的試劑的方法可包括一個(gè)或多個(gè)下列步驟:a)提供含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物或其衍生物的細(xì)胞的樣品山)從此類細(xì)胞制備提取物；c)將所述提取物與含有標(biāo)志物結(jié)合位點(diǎn)的標(biāo)記核酸探針混合；和，d)在測(cè)試試劑存在或不存在的情況下測(cè)定標(biāo)志物與核酸探針之間的復(fù)合物的形成。測(cè)定步驟可包括將所述提取物/核酸探針混合物經(jīng)歷電泳遷移率試驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay)。
[0363]在某些實(shí)施方案中，測(cè)定步驟包括選自酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、基于熒光的測(cè)定和超高通量測(cè)定，例如，表面等離子共振術(shù)(SPR)或熒光相關(guān)光譜(FCS)測(cè)定的測(cè)定。在此類實(shí)施方案中，SPR傳感器用于指導(dǎo)生物分子相互作用的實(shí)時(shí)觀察，因?yàn)镾PR對(duì)金屬-電介質(zhì)表面上的微小折射率改變非常敏感。SPR是對(duì)大約200nm的SPR傳感器/樣品介面內(nèi)的15至10_6折射率(RI)單位的改變敏感的表面技術(shù)。因此，SPR光譜法用于監(jiān)控沉積在傳感層上的薄有機(jī)薄膜的生長(zhǎng)。
[0364]因?yàn)榻M合物、試劑盒和方法依賴于一種或多種標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異的檢測(cè)，因此期望標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著大于用于評(píng)估至少一種正常細(xì)胞和受癌癥影響的細(xì)胞中的表達(dá)的方法的最小檢測(cè)極限。
[0365]應(yīng)理解，通過(guò)使用一種或多種標(biāo)志物對(duì)另外的受試者樣品進(jìn)行常規(guī)篩選，將了解某些標(biāo)志物在不同類型的細(xì)胞，包括受試者的特定病癥和/或疾病狀態(tài)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。
[0366]此外，通過(guò)就標(biāo)志物的表達(dá)評(píng)估更大數(shù)量的受試者樣品，并且使從其獲得樣品的個(gè)體受試者的結(jié)果相互關(guān)聯(lián)，還將確認(rèn)某些標(biāo)志物的改變的表達(dá)與受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)強(qiáng)相關(guān)以及其他標(biāo)志物的改變的表達(dá)與其他疾病強(qiáng)相關(guān)。從而組合物、試劑盒和方法可用于表征受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的分期、分級(jí)、組織學(xué)類型和性質(zhì)中的一種或多種。
[0367]當(dāng)組合物、試劑盒和方法用于表征受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的分期、分級(jí)、組織學(xué)類型和性質(zhì)中的一種或多種時(shí)，期望選擇標(biāo)志物或標(biāo)志物組以使在至少大約20%,在某些實(shí)施方案中，至少大約40%、60%或80%和基本上所有受試者(其患有相應(yīng)分期、分級(jí)、組織學(xué)類型或性質(zhì)的病癥和/或 疾病狀態(tài))中獲得陽(yáng)性結(jié)果?？蛇x擇本發(fā)明的標(biāo)志物或標(biāo)志物組以使對(duì)于一般群體可獲得大于大約10%的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(在非限定性的實(shí)例中，外加大于80%的測(cè)定特異性)。
[0368]當(dāng)多個(gè)標(biāo)志物用于組合物、試劑盒和方法時(shí)，可在單個(gè)反應(yīng)混合物(即，使用針對(duì)各個(gè)標(biāo)志物的試劑，例如不同的熒光探針)或在相應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物的單獨(dú)的反應(yīng)混合物中，將受試者樣品中各標(biāo)志物的表達(dá)水平與相同類型的非病癥和/或非疾病樣品中多個(gè)標(biāo)志物中的每一個(gè)的正常表達(dá)水平相比較。在一個(gè)實(shí)施方案中,相對(duì)于相應(yīng)的正常水平，樣品中一個(gè)以上的標(biāo)志物的顯著增加的表達(dá)水平表示受試者患有病癥和/或疾病狀態(tài)。當(dāng)使用多個(gè)標(biāo)志物時(shí)，可使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多個(gè)單獨(dú)的標(biāo)志物；在某些實(shí)施方案中，可能期望使用更少的標(biāo)志物。
[0369]為了使組合物、試劑盒和方法的靈敏性最大化(即在干擾可歸因于受試者樣品中系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞的情況下)，期望本文中所使用的標(biāo)志物是具有受限制的組織分布(例如通常不在非系統(tǒng)組織中表達(dá))的標(biāo)志物。
[0370]應(yīng)認(rèn)識(shí)到，組合物、試劑盒和方法對(duì)于具有增加的發(fā)生受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)的受試者和他們的醫(yī)學(xué)顧問(wèn)將是特別有用的。被認(rèn)為具有增加的發(fā)生病癥和/或疾病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者包括例如具有此類病癥或疾病的家族史的受試者。
[0371]可以以多種方法評(píng)估正常人系統(tǒng)組織中標(biāo)志物的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，該正常表達(dá)水平通過(guò)下述來(lái)評(píng)估:評(píng)估一部分表現(xiàn)正常的系統(tǒng)細(xì)胞中標(biāo)志物的表達(dá)水平且將該正常表達(dá)水平與一部分懷疑為異常的系統(tǒng)細(xì)胞中的表達(dá)水平相比較。備選地，特別是當(dāng)由于常規(guī)進(jìn)行本文中所述的方法而可獲得進(jìn)一步的信息時(shí)，可使用標(biāo)志物的正常表達(dá)的群體平均值。在其他實(shí)施方案中，標(biāo)志物的〃正?！ū磉_(dá)水平可通過(guò)評(píng)估標(biāo)志物在從未受影響的受試者獲得的受試者樣品、在懷疑病癥和/或疾病狀態(tài)在受試者中發(fā)作之前從受試者獲得的受試者樣品、編檔保存的受試者樣品等中的表達(dá)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
[0372]本文中還提供了用于評(píng)估病癥和/或疾病狀態(tài)細(xì)胞在樣品(例如編檔保存的組織樣品或從受試者獲得的樣品)中的存在的組合物、試劑盒和方法。這些組合物、試劑盒和方法基本上與上述的相同，除了必要時(shí)，使組合物、試劑盒和方法適用于除了受試者樣品外的樣品。例如，當(dāng)待使用的樣品是石蠟包埋的(parafinized)編檔保存的人組織樣品時(shí)，可能必需在用于評(píng)估樣品中標(biāo)志物表達(dá)水平的組合物、試劑盒或方法中調(diào)整化合物的比例。
[0373]試劑盒和試劑
[0374]試劑盒可用于評(píng)估疾病細(xì)胞的存在(例如在樣品例如受試者樣品中)。試劑盒包括多種試劑，其各自能夠特異性結(jié)合標(biāo)志物核酸或蛋白質(zhì)。用于與標(biāo)志物蛋白結(jié)合的合適的試劑包括抗體、抗體衍生物、抗體片段等。用于與標(biāo)志物核酸(例如基因組DNA、MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)結(jié)合的合適的試劑包括互補(bǔ)核酸。例如，核酸試劑可包括固定至基質(zhì)的寡核苷酸(標(biāo)記的或未標(biāo)記的)、不與基質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記的寡核苷酸、PCR引物對(duì)、分子信標(biāo)探針等。
[0375]試劑盒可任選地包含用于進(jìn)行本文中所述的方法的另外的成分。例如，試劑盒可包含適合于使互補(bǔ)核酸 退火或適合于使抗體與其特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合的液體(例如SSC緩沖液)、一個(gè)或多個(gè)樣品隔室、描述方法的進(jìn)行的說(shuō)明書、正常系統(tǒng)細(xì)胞樣品、癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞樣品等。
[0376]產(chǎn)生抗體的方法
[0377]本文中還提供了制備產(chǎn)生用于評(píng)估受試者是否患有病癥和/或疾病狀態(tài)的抗體的分離的雜交瘤的方法。在該方法中，合成或分離(例如通過(guò)從表達(dá)其的細(xì)胞純化或通過(guò)體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸)含有完整標(biāo)志物蛋白或其區(qū)段的蛋白質(zhì)或肽。使用蛋白質(zhì)或肽免疫脊椎動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物例如小鼠、大鼠、兔或綿羊。任選地(和優(yōu)選地)可用蛋白質(zhì)或肽免疫脊椎動(dòng)物至少另外一次，從而使脊椎動(dòng)物呈現(xiàn)強(qiáng)烈的針對(duì)蛋白質(zhì)或肽的免疫應(yīng)答。從免疫的脊椎動(dòng)物分離脾細(xì)胞，使用多種方法中的任一種將其與永生化的細(xì)胞系融合從而形成雜交瘤。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法篩選以該方式形成的雜交瘤，從而鑒定一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)生特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或其片段的抗體的雜交瘤。本文還提供了通過(guò)該方法制備的雜交瘤和使用這樣的雜交瘤制備的抗體。
[0378]評(píng)估有效性的方法
[0379]本文還提供了評(píng)估測(cè)試化合物抑制疾病細(xì)胞的有效性的方法。如上所述，標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異與受試者的細(xì)胞的異常狀態(tài)相關(guān)。雖然公認(rèn)，某些標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化可能由此類細(xì)胞的異常狀態(tài)引起，但同樣公認(rèn)，其他標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化誘導(dǎo)、維持和促進(jìn)此類細(xì)胞的異常狀態(tài)。因此，抑制受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的化合物將使一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物的表達(dá)水平改變至更接近該標(biāo)志物的正常表達(dá)水平(即，所述標(biāo)志物在正常細(xì)胞中的表達(dá)水平)的水平。
[0380]因此本方法包括將在測(cè)試化合物存在的情況下維持的第一細(xì)胞樣品中的標(biāo)志物的表達(dá)與在測(cè)試化合物不存在的情況下維持的第二細(xì)胞樣品中的標(biāo)志物的表達(dá)相比較。在測(cè)試化合物存在的情況下，標(biāo)志物的顯著減少的表達(dá)表示該測(cè)試化合物抑制相關(guān)疾病。細(xì)胞樣品可以例如是獲自受試者的正常細(xì)胞的單個(gè)樣品的等分、獲自受試者的正常細(xì)胞的混合樣品、正常細(xì)胞系的細(xì)胞、獲自受試者的相關(guān)疾病細(xì)胞的單個(gè)樣品的等分、獲自受試者的相關(guān)疾病細(xì)胞的混合樣品、相關(guān)疾病細(xì)胞系的細(xì)胞等。
[0381]在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是獲自受試者的癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞，并且檢測(cè)多種據(jù)認(rèn)為對(duì)于抑制各種癌癥相關(guān)疾病是有效的化合物，以鑒定可能最佳地抑制受試者的癌癥相關(guān)疾病的化合物。
[0382]同樣可將該方法用于評(píng)估療法抑制受試者的相關(guān)疾病的有效性。在該方法中，評(píng)估一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物在樣品對(duì)(一個(gè)樣品經(jīng)歷療法，另一個(gè)不經(jīng)歷療法)中的表達(dá)水平。與評(píng)估測(cè)試化合物的有效性的方法一樣，如果療法誘導(dǎo)顯著更低的標(biāo)志物表達(dá)水平，則療法對(duì)于抑制癌癥相關(guān)疾病是有效的。如上，如果來(lái)自選擇的受試者的樣品用于本方法，那么可在體外評(píng)估備選療法以選擇對(duì)于抑制受試者的癌癥相關(guān)疾病最可能有效的療法。
[0383]如本文中所描述的，人細(xì)胞的異常狀態(tài)與標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化相關(guān)。還提供了用于評(píng)估測(cè)試化合物的有害潛能的方法。該方法包括在測(cè)試化合物存在和不存的情況下維持分開的人細(xì)胞等分。比較各等分中標(biāo)志物的表達(dá)。在測(cè)試化合物存在的情況下維持的等分中標(biāo)志物的顯著更高的表達(dá)水平(相對(duì)于在測(cè)試化合物不存在的情況下維持的等分)表示測(cè)試化合物具有有害的潛能。各種測(cè)試化合物的相對(duì)有害潛能可通過(guò)比較相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平的增強(qiáng)或抑制的程度，通過(guò)比較其表達(dá)水平被增強(qiáng)或抑制的標(biāo)志物的數(shù)目，或通過(guò)比較兩者來(lái)評(píng)估。在下列部分更詳細(xì)地描述了各個(gè)方面。
[0384]分離的蛋白質(zhì)和抗體
[0385]一個(gè)方面涉及分離的標(biāo)志物蛋白和其生物活性部分，以及適合用作免疫原以產(chǎn)生抗標(biāo)志物蛋白或其片段的抗體的多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，天然標(biāo)志物蛋白可使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過(guò)適當(dāng)?shù)募兓桨笍募?xì)胞或組織來(lái)源分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有完整的標(biāo)志物蛋白或其區(qū)段的蛋白質(zhì)或肽通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。除重組表達(dá)外，可使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成此類蛋白質(zhì)或肽。
[0386]“分離的”或“純化的”蛋白質(zhì)或其生物活性部分基本上不含細(xì)胞材料或來(lái)自細(xì)胞或組織來(lái)源(所述蛋白質(zhì)源自于其)的其他污染性蛋白，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)藥品。術(shù)語(yǔ)“基本上不含細(xì)胞材料”包括其中將蛋白質(zhì)與從其分離或重組產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞組分分離的蛋白質(zhì)制劑。因此，基本上不含細(xì)胞材料的蛋白質(zhì)包括具有低于大約30%、20%、10%或5%(按干重計(jì)算)的異種蛋白質(zhì)(在本文中也稱為“污染性蛋白”)的蛋白質(zhì)制劑。
[0387]當(dāng)重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)或其生物活性部分時(shí)，其也優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占據(jù)低于大約20%、10%或5%的蛋白質(zhì)制劑的體積。當(dāng)通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生蛋白質(zhì)時(shí)，其優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)藥品，即，其與參與蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或其他化學(xué)藥品分離。因此，此類蛋白質(zhì)制劑具有低于大約30%、20%、10%、5%(按干重計(jì)算)的化學(xué)前體或除了目的多肽外的化合物。
[0388]標(biāo)志物蛋白的生物活性部分包括含有與標(biāo)志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源自于其的氨基酸序列的多肽，其包含比全長(zhǎng)蛋白質(zhì)更少的氨基酸，并且展示相應(yīng)的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的至少一種活性。通常，生物活性部分包含具有相應(yīng)的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。標(biāo)志物蛋白的生物活性部分可以是其長(zhǎng)度為例如10、25、50、100或更多個(gè)氨基酸的多肽。此外，其中標(biāo)志物蛋白的其他區(qū)域被缺失的其他生物活性部分可通過(guò)重組技術(shù)來(lái)制備，并且可就標(biāo)志物蛋白的天然形式的一種或多種功能活性對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。在某些實(shí)施方案中，有用的蛋白質(zhì)與此類序列之一基本上同一(例如，至少大約40%，在某些實(shí)施方案中，50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一)并且保持相應(yīng)的天然發(fā)生的標(biāo)志物蛋白的功能活性但因天然等位基因變異或誘變而在氨基酸序列上不同。
[0389]此外，標(biāo)志物蛋白的區(qū)段文庫(kù)可用于產(chǎn)生用于篩選和隨后選擇變異標(biāo)志物蛋白或其區(qū)段的多肽的多樣化(variegated)群體。
[0390]預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)
[0391]本文中還提供了動(dòng)物模型和標(biāo)志物在預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的用途，其中診斷測(cè)定、預(yù)后測(cè)定、藥物基因組學(xué)和監(jiān)控臨床試驗(yàn)用于預(yù)后(預(yù)測(cè))目的，從而預(yù)防性治療個(gè)體。因此，本文中還提供了用于測(cè)定一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物蛋白或核酸的表達(dá)水平以確定個(gè)體是否處于發(fā)生特定病癥和/或疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的診斷測(cè)定。此類測(cè)定可用于預(yù)后或預(yù)測(cè)目的，從而在病癥和/或疾病發(fā)作之前預(yù)防性治療個(gè)體。
[0392]在另一個(gè)方面，方法可用于相同個(gè)體的至少周期性篩查以觀察該個(gè)體是否已暴露于改變他/她的表達(dá)模式的化學(xué)藥品或毒素。
[0393]另一方面涉及監(jiān)控被施用以抑制病癥和/或疾病或治療或預(yù)防任何其他病癥的試劑(例如，藥物或其他化合物)在臨床試驗(yàn)中對(duì)標(biāo)志物的表達(dá)或活性的影響(例如，以了解這樣的治療可能具有的任何系統(tǒng)性作用)。
[0394]藥物組合物
[0395]化合物可進(jìn)行配制以用于在合適的藥物載體中局部(topically)、局域(locally)或全身性施用。Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 15 版，E.ff.Martin (MarkPublishing Company, 1975),公開了常用載體和制備方法。化合物還可以封裝在用于祀向細(xì)胞的合適的生物相容性微膠囊、微粒或微球體(由生物可降解或非生物可降解聚合物或蛋白質(zhì)或脂質(zhì)體形成)。此類系統(tǒng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的并且可進(jìn)行最優(yōu)化以與合適的核酸一起使用。
[0396]在例如Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, New York;和 Ausubel 等人，1994, Current Protocols inMolecular B1logy, John ffiley&Sons, New York中描述了用于核酸遞送的各種方法。此類核酸遞送系統(tǒng)包括期望的核酸，例如但不限于，其以“裸露的”形式作為“裸露的”核酸，或配制于適合于遞送的媒介物中例如與陽(yáng)離子分子或形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的復(fù)合物中，或作為載體的成分或藥物組合物的成分?？蓪⒑怂徇f送系統(tǒng)直接(例如通過(guò)將其與細(xì)胞接觸)或間接(例如通過(guò)任何生物過(guò)程的作用)提供給細(xì)胞。
[0397]用于局部施用的制劑可包括軟膏、洗劑、乳膏劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。需要時(shí)可使用常規(guī)藥物載體(水性的、粉狀的或基于油的)或增稠劑。
[0398]適合用于胃腸外施用例如通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)(關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑施用的制劑包括水性和非水性的等滲無(wú)菌注射液，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與期望的受者的血液等滲的溶質(zhì)，以及水性和非水性無(wú)菌懸浮液、溶液或乳劑，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、分散劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。用于注射的制劑可以以單位劑型、與加入的防腐劑一起存在，例如存在于安瓿中或存在于多劑量容器中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定制備和配制組合物的各種參數(shù)而無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。可單獨(dú)地或與其他合適的成分組合來(lái)使用化合物。
[0399]—般地，施用化合物(包括核酸)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。特別地，已用于核酸治療劑的施用途徑，和目前使用的制劑一起，為選擇的核酸提供了優(yōu)選的施用和配制途徑，當(dāng)然這將取決于因素例如特定的制劑、待治療的受試者的狀態(tài)的嚴(yán)重度和治療功效所需的劑量。如本文中通常使用的，“有效量”是指在對(duì)其施用了制劑的受試者(與未接受所述化合物的匹配的受試者相比較)中能夠治療病癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀，逆轉(zhuǎn)病癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀的進(jìn)展，終止病癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀的進(jìn)展或預(yù)防病癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀的發(fā)生的量。化合物的實(shí)際有效量可根據(jù)待使用的特定化合物或其組合、配制的特定組合物、施用模式，和個(gè)體的年齡、體重、狀況，和待治療的癥狀或病況的嚴(yán)重度而變化。
[0400]本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可接受的方法可用于給受試者施用制劑。取決于待治療的病況，施用可以是局部的(即，至特定區(qū)域、生理系統(tǒng)、組織、器官或細(xì)胞類型)或全身性的。
[0401]藥物基因組學(xué)
[0402]標(biāo)志物還可用作藥物基因組學(xué)標(biāo)志物。如本文中所用的，“藥物基因組學(xué)標(biāo)志物”是其表達(dá)水平與受試者中特定臨床藥物應(yīng)答或易感性相關(guān)的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。藥物基因組學(xué)標(biāo)志物表達(dá)的存在或量與預(yù)測(cè)的受試者應(yīng)答和更特別地受試者的腫瘤對(duì)用特定藥物或藥物種類的療法的應(yīng)答相關(guān)。通過(guò)評(píng)估受試者中一個(gè)或多個(gè)藥物基因組學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)的存在或量，可選擇最適合于受試者的或預(yù)測(cè)具有更大的成功程度的藥物療法。 [0403]監(jiān)控臨床試驗(yàn)
[0404]監(jiān)控試劑(例如，藥物化合物)對(duì)標(biāo)志物的表達(dá)水平的影響不僅可用于基礎(chǔ)藥物篩選，而且還可用于臨床試驗(yàn)。例如，可在接受癌癥相關(guān)疾病治療的受試者的臨床試驗(yàn)中監(jiān)控試劑影響標(biāo)志物表達(dá)的有效性。
[0405]在一個(gè)非限定性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于監(jiān)控利用試劑(例如，激動(dòng)劑、拮抗劑、模擬肽、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或其他藥物候選物)治療受試者的有效性的方法，該方法包括步驟:
[0406]i)在施用試劑之前從受試者獲得施用前的樣品；
[0407]ii)檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)選擇的標(biāo)志物在施用前的樣品中的表達(dá)水平；
[0408]iii)從受試者獲得一個(gè)或多個(gè)施用后的樣品；
[0409]iv)檢測(cè)標(biāo)志物在施用后的樣品中的表達(dá)水平；
[0410]V)將施用前的樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平與施用后的樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平相比較；和
[0411]vi)相應(yīng)地改變?cè)噭┲潦茉囌叩氖┯谩?br> [0412]例如，在治療過(guò)程中增加的標(biāo)志物基因的表達(dá)可表明無(wú)效劑量，從而需要增加劑量。相反地，減少的標(biāo)志基因的表達(dá)可表明有效治療，從而不需要改變劑量。
[0413]電子設(shè)備可讀介質(zhì)、系統(tǒng)、陣列和使用其的方法
[0414]如本文中所使用的，“電子設(shè)備可讀介質(zhì)”是指用于存儲(chǔ)、保存或包含可用電子設(shè)備直接閱讀和存取的數(shù)據(jù)或信息的任何適當(dāng)介質(zhì)。此類介質(zhì)可包括但不限于:磁性存儲(chǔ)介質(zhì)，例如軟盤、硬盤存儲(chǔ)介質(zhì)以及磁帶；光學(xué)存儲(chǔ)介質(zhì)例如光盤；電子存儲(chǔ)介質(zhì)例如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等；以及普通硬盤和這些類別的混合體例如磁性/光學(xué)存儲(chǔ)介質(zhì)?？蓪?duì)介質(zhì)進(jìn)行改造或設(shè)定以用于在其上記錄本文中所述的標(biāo)志物。
[0415]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“電子設(shè)備”旨在包括任何適當(dāng)?shù)挠?jì)算或處理設(shè)備或其他經(jīng)改造或設(shè)定用于存儲(chǔ)數(shù)據(jù)或信息的裝置。適合用于本發(fā)明的電子設(shè)備的實(shí)例包括獨(dú)立的計(jì)算設(shè)備；網(wǎng)絡(luò)，包括局域網(wǎng)(LAN)、廣域網(wǎng)絡(luò)(WAN)因特網(wǎng)、內(nèi)聯(lián)網(wǎng)和外聯(lián)網(wǎng)；電子器具例如個(gè)人數(shù)字助理(PDA)、手機(jī)、尋呼機(jī)(pager)等；以及局域和分布式處理系統(tǒng)。
[0416]如本文中所使用的，“記錄”是指在電子設(shè)備可讀介質(zhì)上存儲(chǔ)或編碼信息的過(guò)程。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地采用任何用于在介質(zhì)上記錄信息的方法來(lái)產(chǎn)生包含本文中所述的標(biāo)志物的材料。
[0417]許多軟件程序和格式可用于在電子設(shè)備可讀介質(zhì)上存儲(chǔ)本發(fā)明的標(biāo)志物信息。為了獲得或產(chǎn)生在其上記錄了標(biāo)志物的介質(zhì)，可使用許多數(shù)據(jù)處理程序構(gòu)建格式(dataprocessor structuring format)(例如，文本文件或數(shù)據(jù)庫(kù))。通過(guò)以可讀形式提供標(biāo)志物，可常規(guī)存取用于多種目的的標(biāo)志物序列信息。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用可讀形式的核苷酸或氨基酸序列來(lái)將靶序列或靶結(jié)構(gòu)基序與存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)工具中的序列相比較。搜索工具用于鑒定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或區(qū)域。
[0418]因此，本文中還提供了用于保存進(jìn)行確定受試者是否具有癌癥相關(guān)疾病或?qū)Π┌Y相關(guān)疾病的易感性的方法的說(shuō)明書的介質(zhì)，其中所述方法包括步驟:確定標(biāo)志物的存在或不存在，并且基于標(biāo)志物的存在或不存 在來(lái)確定受試者是否具有癌癥相關(guān)疾病或?qū)Π┌Y相關(guān)疾病的易感性，和/或推薦用于癌癥相關(guān)疾病或癌癥相關(guān)疾病前狀況(pre-cancer-related disease condit1n)的特定治療。
[0419]本文中還提供了電子系統(tǒng)和/或在網(wǎng)絡(luò)中提供了用于確定受試者是否患有癌癥相關(guān)疾病或具有對(duì)與標(biāo)志物相關(guān)的癌癥相關(guān)疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步驟:確定標(biāo)志物的存在或不存在，并且基于標(biāo)志物的存在或不存在來(lái)確定受試者是否患有特定病癥和/或疾病或具有對(duì)此類病癥和/或疾病的易感性，和/或推薦用于此類疾病或疾病和/或這樣的癌癥相關(guān)疾病前狀況的特定治療。該方法還可包括接收與受試者相關(guān)的表型信息和/或從網(wǎng)絡(luò)獲取與受試者相關(guān)的表型信息的步驟。
[0420]本文中還提供了網(wǎng)絡(luò)，用于確定受試者是否患有病癥和/或疾病或具有對(duì)與標(biāo)志物相關(guān)的病癥和/或疾病的易感性的方法，所述方法包括步驟:接收與標(biāo)志物相關(guān)的信息，接收與受試者相關(guān)的表型信息，從網(wǎng)絡(luò)獲取相應(yīng)于標(biāo)志物和/或病癥和/或疾病的信息，并且基于表型信息、標(biāo)志物和獲取的信息中的一個(gè)或多個(gè)，確定受試者是否患有病癥和/或疾病或具有對(duì)其的易感性。所述方法還包括推薦用于病癥和/或疾病或?qū)ζ涞囊赘行缘奶囟ㄖ委煹牟襟E。
[0421]本文中還提供了用于確定受試者是否患有病癥和/或疾病或具有對(duì)其的易感性的商業(yè)方法，所述方法包括步驟:接收與標(biāo)志物相關(guān)的信息，接收與受試者相關(guān)的表型信息，從網(wǎng)絡(luò)獲取相應(yīng)于標(biāo)志物和/或病癥和/或疾病的信息，并且基于表型信息、標(biāo)志物和獲得的信息中的一個(gè)或多個(gè)，確定受試者是否患有病癥和/或疾病或具有對(duì)其的易感性。所述方法還可包括推薦用于其的特定治療的步驟。
[0422]本文中還提供了可用于測(cè)定陣列中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的陣列。在一個(gè)實(shí)施方案中，陣列可用于測(cè)定組織中基因的表達(dá)，從而確定陣列中基因的組織特異性。這樣，可就表達(dá)同時(shí)測(cè)定直至大約7000或更多個(gè)基因。這使得能夠產(chǎn)生顯示在一個(gè)或多個(gè)組織中特異性表達(dá)的一組基因的特征譜。
[0423]除了此類定性測(cè)定外，本文中還提供了基因表達(dá)的定量。因此，不僅組織特異性而且一組基因在組織中的表達(dá)水平也是可確定的。因此，可基于基因本身的組織表達(dá)和在該組織中的表達(dá)水平來(lái)對(duì)基因進(jìn)行分類。這可用于例如確定組織間基因表達(dá)的關(guān)系。因此，可干擾一個(gè)組織，然后可測(cè)定對(duì)第二組織中的基因表達(dá)的影響。在本說(shuō)明書中，可測(cè)定一種細(xì)胞類型對(duì)另一種細(xì)胞類型(響應(yīng)生物刺激)的影響。
[0424]此類測(cè)定可用于例如在基因表達(dá)的水平上了解細(xì)胞間相互作用的效果。如果試劑被治療性施用以治療一種細(xì)胞類型但其對(duì)另一種細(xì)胞類型具有不期望的作用，則所述方法提供了確定不期望的作用的分子基礎(chǔ)的測(cè)定，從而提供共施用中和劑(counteractingagent)或另外治療不期望的作用的機(jī)會(huì)。類似地，即使在單個(gè)細(xì)胞類型中，可在分子水平上測(cè)定不期望的生物學(xué)效應(yīng)。因此，可確定和中和試劑對(duì)非靶基因的表達(dá)的作用。
[0425]在另一個(gè)實(shí)施方案中，陣列可用于監(jiān)控陣列中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的時(shí)程。如本文中所公開的，這可發(fā)生在各種生物學(xué)背景(例如病癥和/或疾病的發(fā)生，其進(jìn)展)和過(guò)程(例如與其相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化)中。
[0426]陣列還可用于確定基因的表達(dá)或其他基因的表達(dá)在相同細(xì)胞或不同細(xì)胞中的作用。如果不能調(diào)控最終或下游靶，那么這提供了例如用于治療性干預(yù)的備選分子靶的選擇。
[0427]陣列還可用于確定一個(gè)或多個(gè)基因在正常和異常細(xì)胞中的差異表達(dá)模式。這提供了可用作診斷或治療性干預(yù)的分子靶的一組基因。 [0428]替代標(biāo)志物(SurrogateMarker )
[0429]標(biāo)志物可用作一種或多種病癥或疾病狀態(tài)或?qū)е缕涞臓顩r的替代標(biāo)志物。如本文中所使用的，“替代標(biāo)志物”是與疾病或病癥的不存在或存在，或與疾病或病癥的進(jìn)展相關(guān)的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。此類標(biāo)志物的存在或量不依賴于疾病。因此，此類標(biāo)志物可用于指示特定的療程在減輕疾病狀態(tài)或病癥中是否有效。當(dāng)疾病狀態(tài)或病癥的存在或程度難以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)評(píng)估，或當(dāng)在達(dá)到潛在危險(xiǎn)的臨床終點(diǎn)之前期望評(píng)估疾病進(jìn)展時(shí)，替代標(biāo)志物是特別有用的。
[0430]標(biāo)志物還可用作藥效標(biāo)志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的藥效標(biāo)志物”是與藥物作用特異性相關(guān)的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。藥效標(biāo)志物的存在或量與將對(duì)其施用藥物的疾病狀態(tài)或病癥無(wú)關(guān)；因此，標(biāo)志物的存在或量表示藥物在受試者中的存在或活性。例如，藥效標(biāo)志物可表示藥物在生物組織中的濃度，因?yàn)闃?biāo)志物在該組織中表達(dá)或轉(zhuǎn)錄，或者不表達(dá)或轉(zhuǎn)錄與藥物的水平相關(guān)。這樣，藥物的分布或吸收可通過(guò)藥效標(biāo)志物來(lái)監(jiān)控。類似地，藥效標(biāo)志物的存在或量可與藥物的代謝產(chǎn)物的存在或量相關(guān)，這樣標(biāo)志物的存在或量表示藥物在體內(nèi)的相對(duì)分解速率。
[0431]藥效標(biāo)志物在增加藥物作用的檢測(cè)的靈敏性中特別有用，特別是當(dāng)以低劑量施用藥物時(shí)。由于即使少量的藥物也可足以激活多輪的標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，因此擴(kuò)增的標(biāo)志物可以以比藥物本身更容易檢測(cè)的量存在。同樣，標(biāo)志物由于其本身的性質(zhì)而可以更容易地進(jìn)行檢測(cè)；例如，通過(guò)使用本文中描述的方法，可將抗體用于針對(duì)蛋白標(biāo)志物的基于免疫的檢測(cè)系統(tǒng)，或可使用標(biāo)志物特異性放射性標(biāo)記探針來(lái)檢測(cè)mRNA標(biāo)志物。此外，藥效標(biāo)志物的使用可提供由于藥物治療超出可直接觀察的范圍而產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)的基于機(jī)制的預(yù)測(cè)。
[0432]用于檢測(cè)的方案
[0433]檢測(cè)病癥和/或疾病的方法可包括例如在一段時(shí)間內(nèi)測(cè)量各標(biāo)志物基因在來(lái)自受試者的生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平和將該水平與對(duì)照生物學(xué)樣品中標(biāo)志物基因的水平相比較。
[0434]當(dāng)標(biāo)志物基因是本文中描述的基因之一并且表達(dá)水平差異表達(dá)(例如，比對(duì)照中的表達(dá)水平更高或更低)時(shí)，受試者被判斷為患有病癥和/或疾病。當(dāng)標(biāo)志物基因的表達(dá)水平落在容許的范圍內(nèi)時(shí)，受試者不可能患有所述病癥和/或疾病。
[0435]可通過(guò)測(cè)量對(duì)照中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平來(lái)預(yù)先測(cè)定對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)值，以比較表達(dá)水平。例如，可基于上述標(biāo)志物基因在對(duì)照中的表達(dá)水平來(lái)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)值。例如，在某些實(shí)施方案中，容許的范圍基于標(biāo)準(zhǔn)值采用±2S.D.。在測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)值后，可通過(guò)只測(cè)量來(lái)自受試者的生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平并將該值與測(cè)定的對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)值相比較來(lái)進(jìn)行檢測(cè)方法。
[0436]標(biāo)志物基因的表達(dá)水平包括標(biāo)志物基因至mRNA的轉(zhuǎn)錄和至蛋白質(zhì)的翻譯。因此，基于相應(yīng)于標(biāo)志物基因的mRNA的表達(dá)強(qiáng)度或由標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的比較，進(jìn)行檢測(cè)病癥和/或疾病的一個(gè)方法。
[0437]可根據(jù)各種基因分析方法在病癥和/或疾病的檢測(cè)中測(cè)量標(biāo)志物基因的表達(dá)水平。具體地，可使用例如利用與此類基因雜交的核酸作為探針的雜交技術(shù)，或利用與標(biāo)志物基因雜交的DNA作為引物的基因擴(kuò)增技術(shù)。
[0438]可基于標(biāo)志物基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)用于檢測(cè)的探針或引物。本文中描述了各標(biāo)志物基因的核苷酸序列的標(biāo)識(shí)號(hào)。
[0439]此外，應(yīng)理解，高等動(dòng)物的基因通常伴有高頻率的多態(tài)性。也存在許多在剪接過(guò)程中產(chǎn)生含有相互不同的氨基酸序列的同種型的分子。與癌癥相關(guān)疾病相關(guān)的、具有與標(biāo)志物基因的活性相似的活性的任何基因包括在標(biāo)志物基因中，即使其由于多態(tài)性或?yàn)橥N型而具有核苷酸序列差異。
[0440]也應(yīng)理解，標(biāo)志物基因可包括除了人外的其他物種的同源物。因此，除非明確指出，否則表述“標(biāo)志物基因”是指對(duì)于物種獨(dú)特的標(biāo)志物基因的同源物或已被導(dǎo)入個(gè)體的外源標(biāo)志物基因。
[0441]同樣，應(yīng)理解，“標(biāo)志物基因的同源物”是指來(lái)源于除了人以外的物種的基因，其在嚴(yán)格條件下可作為探針與人標(biāo)志物基因雜交。這樣的嚴(yán)格條件對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員(其可通過(guò)實(shí)驗(yàn)或憑經(jīng)驗(yàn)選擇適當(dāng)?shù)臈l件來(lái)產(chǎn)生相同嚴(yán)格性)來(lái)說(shuō)是已知的。
[0442]含有標(biāo)志物基因的核苷酸序列或與標(biāo)志物基因的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈互補(bǔ)并且具有至少15個(gè)核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探針。因此，“互補(bǔ)鏈”是指由A:T (對(duì)于RNA為U)和G:C堿基對(duì)組成的雙鏈DNA中相對(duì)于另一條鏈的一條鏈。
[0443]此外，“互補(bǔ)”不僅意指與至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域完全互補(bǔ)的序列，而且還指具有在某些情況下至少40%，在某些情況下50%，在某些情況下60%，在某些情況下70%，在某些情況下80%、在某些情況下90%和在某些情況下95%或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之間的同源性的程度可利用算法BLAST等來(lái)測(cè)定。
[0444]此類多核苷酸可用作檢測(cè)標(biāo)志物基因的探針，或用作擴(kuò)增標(biāo)志物基因的引物。當(dāng)用作引物時(shí)，多核苷酸通常包含15bp至lOObp，在某些實(shí)施方案中15bp至35bp的核苷酸。當(dāng)用作探針時(shí)，DNA包含標(biāo)志物基因的整個(gè)核苷酸序列(或其互補(bǔ)鏈)，或具有至少15bp核苷酸的其部分序列。當(dāng)用作引物時(shí)，3’區(qū)域必須與標(biāo)志物基因互補(bǔ)，而5’區(qū)域可連接至限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列或標(biāo)簽(tag)。
[0445]“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此類多核苷酸可以是合成的或天然發(fā)生的。同樣，通常也標(biāo)記用作雜交探針的DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解此類標(biāo)記方法。在本文中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”意指具有相對(duì)低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸內(nèi)。
[0446]可使用例如Northern雜交、斑點(diǎn)印跡雜交或DNA微陣列技術(shù)進(jìn)行利用雜交技術(shù)的病癥和/或疾病的檢測(cè)。此外，可使用基因擴(kuò)增技術(shù)例如RT-PCR法。通過(guò)在RT-PCR的基因擴(kuò)增步驟中使用PCR擴(kuò)增監(jiān)控法，可更加定量地分析標(biāo)志物基因的表達(dá)。
[0447]在PCR基因擴(kuò)增監(jiān)控法中，將檢測(cè)靶(DNA或RNA的反轉(zhuǎn)錄物)與用熒光染料和吸收熒光的猝滅劑標(biāo)記的探針雜交。當(dāng)PCR進(jìn)行并且Taq聚合酶以其5’-3’外切核酸酶活性降解探針時(shí)，熒光染料與猝滅劑彼此分離，從而檢測(cè)到熒光。實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光。通過(guò)同時(shí)測(cè)量其中靶的拷貝數(shù)是已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品，可利用循環(huán)數(shù)(其中PCR擴(kuò)增是線性的)測(cè)定受試者樣品中靶的拷貝數(shù)。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)PCR擴(kuò)增監(jiān)控法可使用任何適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)進(jìn)行。
[0448]還可通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)癌癥相關(guān)疾病的方法。在下文中，標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)被描述為“標(biāo)志物蛋白”。對(duì)于此類檢測(cè)方法，可通過(guò)使用結(jié)合各標(biāo)志物蛋白的抗體來(lái)應(yīng)用例如，Western印跡法、免疫沉淀法和ELISA法。
[0449]用于檢測(cè)的結(jié)合標(biāo)志物蛋白的抗體可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)來(lái)產(chǎn)生。同樣，為了檢測(cè)標(biāo)志物蛋白，可適當(dāng) 地標(biāo)記這樣的抗體。備選地，可不標(biāo)記抗體，而是標(biāo)記特異性結(jié)合抗體的物質(zhì)例如蛋白A或蛋白G以間接檢測(cè)標(biāo)志物蛋白。更特別地，此類檢測(cè)方法可包括ELISA 法。
[0450]可以例如通過(guò)將標(biāo)志物基因或其部分插入表達(dá)載體，將構(gòu)建體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化株，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化株以表達(dá)重組蛋白，然后從培養(yǎng)物或培養(yǎng)上清液純化表達(dá)的重組蛋白來(lái)獲得用作抗原的蛋白質(zhì)或其部分肽。備選地，可化學(xué)合成由基因編碼的氨基酸序列或含有由全長(zhǎng)cDNA編碼的氨基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。
[0451]此外，可通過(guò)將不僅生物學(xué)樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平而且標(biāo)志物蛋白的活性用作指標(biāo)來(lái)進(jìn)行癌癥相關(guān)疾病的檢測(cè)。標(biāo)志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物學(xué)活性?？墒褂酶鞣N方法測(cè)量每一種蛋白的活性。
[0452]即使在常規(guī)檢測(cè)中受試者未被診斷為患有病癥和/或疾病(盡管癥狀暗示此類疾病)，這樣的受試者是否患有病癥和/或疾病也可通過(guò)按照本文中所述的方法進(jìn)行檢測(cè)來(lái)容易地確定。
[0453]更特別地，在某些實(shí)施方案中，當(dāng)標(biāo)志物基因是本文描述的基因之一時(shí)，其癥狀至少暗示對(duì)病癥和/或疾病的易感性的受試者中，標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的增加或減少表明癥狀主要由所述病癥和/或疾病引起。
[0454]此外，檢測(cè)可用于確定病癥和/或疾病是否在受試者中得到改善。換句話說(shuō)，本文中描述的方法可用于判斷用于所述病癥和/或疾病的治療的治療效果。此外，當(dāng)標(biāo)志物基因是本文描述的基因之一時(shí)，已被診斷為患有所述病癥和/或疾病的受試者中，標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的增加或減少意味著疾病已向前發(fā)展。[0455]還可基于表達(dá)水平的差異測(cè)定病癥和/或疾病的嚴(yán)重度和/或?qū)ζ涞囊赘行?。例如，?dāng)標(biāo)志物基因是本文描述的基因之一時(shí)，標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的增加程度與病癥和/或疾病的存在和/或嚴(yán)重度相關(guān)。
[0456]動(dòng)物模型
[0457]還可產(chǎn)生病癥和/或疾病的動(dòng)物模型，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物基因或功能上與標(biāo)志物基因等同的基因的表達(dá)水平在所述動(dòng)物模型中已被提高。如本文中所用的，“功能上等同的基因”通常是編碼具有與標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)的已知活性相似的活性的蛋白質(zhì)的基因。功能上等同的基因的代表性實(shí)例包括受試動(dòng)物的標(biāo)志物基因?qū)?yīng)物，其是動(dòng)物本身固有的。
[0458]動(dòng)物模型可用于檢測(cè)由于病癥和/或疾病而引起的生理學(xué)變化。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物模型可用于揭示標(biāo)志物基因的另外的功能和評(píng)估其靶為標(biāo)志物基因的藥物。
[0459]動(dòng)物模型可通過(guò)控制對(duì)應(yīng)物基因的表達(dá)水平或施用對(duì)應(yīng)物基因來(lái)產(chǎn)生。方法可包括通過(guò)控制選自本文中所述的基因的基因的表達(dá)水平來(lái)產(chǎn)生動(dòng)物模型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法可包括通過(guò)施用由本文中所描述的基因編碼的蛋白質(zhì)或施用抗所述蛋白的抗體來(lái)產(chǎn)生動(dòng)物模型。還應(yīng)理解，在某些其他實(shí)施方案中，可過(guò)表達(dá)標(biāo)志物，以便可使用適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量標(biāo)志物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物模型可通過(guò)導(dǎo)入選自此類基因的基因，或通過(guò)施用由這樣的基因編碼的蛋白質(zhì)來(lái)產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病癥和/或疾病可通過(guò)抑制選自此類基因的基因的表達(dá)或由這樣的基因編碼的蛋白質(zhì)的活性來(lái)誘導(dǎo)。反義核酸、核酶或RNAi可用于抑制 表達(dá)。蛋白質(zhì)的活性可通過(guò)施用抑制所述活性的物質(zhì)例如抗體來(lái)有效地控制。
[0460]動(dòng)物模型可用于闡明病癥和/或疾病背后的機(jī)制，還可用于檢測(cè)通過(guò)篩選獲得的化合物的安全性。例如，當(dāng)動(dòng)物模型產(chǎn)生特定病癥和/或疾病的癥狀時(shí)，或當(dāng)牽涉某種病癥和/或疾病的測(cè)量值在動(dòng)物中改變時(shí)，可構(gòu)建篩選系統(tǒng)以探測(cè)具有減輕疾病的活性的化合物。
[0461]如本文中所使用的，表述“表達(dá)水平的增加”是指下列情況的任一種:人工表達(dá)作為外源基因?qū)氲臉?biāo)志物基因；受試動(dòng)物本身固有的標(biāo)志物基因的轉(zhuǎn)錄和其至蛋白質(zhì)的翻譯得到增強(qiáng)；或作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的水解被抑制。
[0462]如本文中所用的，表述“表達(dá)水平的減少”是指其中受試動(dòng)物的標(biāo)志物基因的轉(zhuǎn)錄和其至蛋白質(zhì)的翻譯被抑制的情況，或其中作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的水解被增強(qiáng)的情況。基因的表達(dá)水平可以例如通過(guò)DNA芯片上信號(hào)強(qiáng)度的差異來(lái)測(cè)定。此外，翻譯產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的活性可通過(guò)與正常情況中的活性相比較來(lái)測(cè)定。
[0463]也在預(yù)期的范圍內(nèi)的是:動(dòng)物模型可包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，包括例如其中已人工導(dǎo)入并且表達(dá)標(biāo)志物基因的動(dòng)物；標(biāo)志物基因敲除動(dòng)物；和其中已用另一個(gè)基因置換標(biāo)志物基因的基因敲入動(dòng)物。已向其中導(dǎo)入了標(biāo)志物基因的反義核酸、核酶、具有RNAi作用的多核苷酸或用作誘餌核酸的DNA等的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還包括例如這樣的動(dòng)物，在所述動(dòng)物中標(biāo)志物蛋白的活性已通過(guò)將突變導(dǎo)入基因的編碼區(qū)而得到增強(qiáng)或抑制，或氨基酸序列已被修飾而變得抗水解或?qū)λ饷舾?。氨基酸序列中的突變包括置換、缺失、插入和添加。
[0464]表達(dá)的實(shí)例[0465]此外，標(biāo)志物基因本身的表達(dá)可通過(guò)向基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)導(dǎo)入突變來(lái)控制。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解此類氨基酸置換。同樣，被突變的氨基酸的數(shù)目不受特別限制，只要活性得到保持即可。通常，其在50個(gè)氨基酸以內(nèi)，在某些非限定性實(shí)施方案中，在30個(gè)氨基酸以內(nèi)，在10個(gè)氨基酸以內(nèi)，或在3個(gè)氨基酸以內(nèi)。突變的位點(diǎn)可以是任何位點(diǎn)，只要活性得到保持即可。
[0466]在另一個(gè)方面，本文中提供了治療特定病癥和/或疾病的治療劑的候選化合物的篩選方法。一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物基因選自本文中描述的基因。可通過(guò)選擇能夠增加或減少標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的化合物來(lái)獲得癌癥相關(guān)疾病的治療劑。
[0467]應(yīng)理解，表述“增加基因的表達(dá)水平的化合物”是指促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄、基因翻譯或蛋白質(zhì)活性的表達(dá)的步驟中的任一步驟的化合物。另一方面，表述“減少基因的表達(dá)水平的化合物”，如本文中所用的，是指抑制這些步驟中的任一步驟的化合物。
[0468]在特定的方面，可在體內(nèi)或體外進(jìn)行篩選用于病癥和/或疾病的治療劑的方法。該篩選方法可以例如通過(guò)下列步驟來(lái)進(jìn)行:
[0469]I)對(duì)動(dòng)物受試者施用候選化合物；
[0470]2)測(cè)量動(dòng)物受試者的生物學(xué)樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平；或
[0471]3)選擇與對(duì)照(其未與候選化合物接觸)中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平相比較增加或減少標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的化合物。
[0472]在另一個(gè)方面，本文中提供了這樣的方法，其通過(guò)將動(dòng)物受試者與候選化合物接觸，然后監(jiān)控化合物對(duì)來(lái)源于動(dòng)物受試者的生物學(xué)樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的作用來(lái)評(píng)估藥劑的候選化合物對(duì)標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的功效。來(lái)源于動(dòng)物受試者的生物學(xué)樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的變化可使用與上述檢測(cè)方法中所用的相同的技術(shù)來(lái)監(jiān)控。此外，基于評(píng)估，可通過(guò)篩選來(lái)選擇藥劑的候選化合物。
[0473]本文中所引用的所有專利、專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)以其全文通過(guò)引用合并入本文。雖然對(duì)于制備和使用其的本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)已十分詳盡地描述和例示了本發(fā)明，但各種改變、修飾和改進(jìn)是顯然的，且不背離本發(fā)明的精神和范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，本發(fā)明可進(jìn)行適當(dāng)?shù)馗淖円赃m合于實(shí)現(xiàn)目的和獲得提及的目標(biāo)和有利方面以及其中固有的那些。
[0474]某些核喊基(Nucleobase)序列
[0475]本文中描述的成熟miRNA和它們的相應(yīng)的莖-環(huán)序列的核堿基序列是見于miRBase (見于http://microrna.sanger.ac.uk/的miRNA序列和注釋的在線可搜索數(shù)據(jù)庫(kù))中的序列。miRBase序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的條目(entry)代表預(yù)測(cè)的miRNA轉(zhuǎn)錄物的發(fā)夾部分(莖-環(huán))和關(guān)于成熟miRNA序列的定位和序列的信息。數(shù)據(jù)庫(kù)中miRNA的莖-環(huán)序列嚴(yán)格說(shuō)來(lái)不是前體miRNA (pre-miRNA),并且在一些情況下可包括pre_miRNA和來(lái)自假定的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的一些側(cè)翼序列。本文中描述的miRNA核堿基序列包括miRNA的任何形式，包括miRBase序列數(shù)據(jù)庫(kù)的Releasel0.0中描述的序列和miRBase序列數(shù)據(jù)庫(kù)的任何更早的Release中描述的序列。序列數(shù)據(jù)庫(kù)釋放可導(dǎo)致某些miRNA的重新命名。序列數(shù)據(jù)庫(kù)釋放可導(dǎo)致成熟miRNA序列的變化?？砂ù祟愋揎椀墓押塑账岬幕衔锟膳c本文中描述的miRNA的任何核堿基序列形式互補(bǔ)。
[0476] 應(yīng)理解，本文中所示的任何核堿基序列不依賴于對(duì)糖部分、核苷間連接或核堿基的任何修飾。還應(yīng)理解，包含U的核堿基序列也包括其中在一個(gè)或多個(gè)具有‘U’的位點(diǎn)上‘U’被‘T’置換的相同核堿基序列。反過(guò)來(lái)，應(yīng)理解，包含T的核堿基序列也包括其中在一個(gè)或多個(gè)具有‘T’的位點(diǎn)上‘T’被‘U’置換的相同核堿基序列。
[0477]在某些實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸具有與miRNA或其前體互補(bǔ)的核堿基序列，這意味著修飾的寡核苷酸的核堿基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或更多個(gè)核堿基的區(qū)域中與 miRNA 或其前體的互補(bǔ)序列至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99%同一，或兩個(gè)序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交。因此，在某些實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸的核堿基序列相對(duì)于其靶miRNA或靶miRNA前體序列可具有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并且能夠與其靶序列雜交。在某些實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸具有與miRNA或其前體100%互補(bǔ)的核堿基序列。在某些實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸的核堿基序列具有對(duì)miRNA的全長(zhǎng)互補(bǔ)性。
[0478]miRNA (miR)療法
[0479]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制受試者的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的微RNA。微RNA表達(dá)特征譜可用作新型癌癥生物標(biāo)志物。
[0480]本文中包括使用一個(gè)或多個(gè)MiR抑制基因表達(dá)和/或活性的方法。在一些實(shí)施方案中，miR抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，miRNA抑制基因活性(例如，細(xì)胞侵襲活性)。
[0481]可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多種技術(shù)從細(xì)胞或組織分離，重組產(chǎn)生或體外合成miRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，從細(xì)胞或組織分離miRNA。用于從細(xì)胞或組織分離miRNA的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。例如，可使用來(lái)自Amb1n, Inc.的mirVanamiRNA分離試劑盒從總RNA分離miRNA。另一種技術(shù)利用flashlPAGE? Fract1natorSystem (Amb1n, Inc.)來(lái)進(jìn)行小核酸的PAGE純化。
[0482]關(guān)于miRNA治療劑的使用，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，體內(nèi)施用的核酸被吸收和分配至細(xì)胞和組織。
[0483]可以以合適的方式遞送核酸，所述方式使得能夠組織特異性地吸收試劑和/或核酸遞送系統(tǒng)。本文中描述的試劑可通過(guò)任何已知的常規(guī)療法來(lái)補(bǔ)充治療狀況，所述療法包括但不限于抗體施用、疫苗施用、細(xì)胞毒性劑、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸類似物和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的施用。可一起或相繼使用兩個(gè)或多個(gè)組合的化合物。
[0484]本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了包含(a) —種或多種核酸或小分子化合物以及(b)一種或多種其他化學(xué)治療劑的藥物組合物。
[0485]另外的有用的定義
[0486]“受試者”是指經(jīng)選擇接受治療或療法的人或非人動(dòng)物?！皯岩苫加小氖茉囌摺笔侵刚故静“Y、疾病或病況的一個(gè)或多個(gè)臨床指標(biāo)的受試者。
[0487]“預(yù)防”或“防止”是指延遲或阻止病況或疾病的發(fā)作、發(fā)展或進(jìn)展，持續(xù)一段時(shí)間，包括數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年?！爸委煛被颉搬t(yī)治”是指一種或多種用于治愈或改善病癥和/或疾病的特定方法的應(yīng)用。在某些實(shí)施方案中，特定方法是一種或多種藥劑的施用。
[0488]“改善”是指減輕病況或疾病的至少一個(gè)指標(biāo)的嚴(yán)重度。在某些實(shí)施方案中，改善包括病況或疾病的一個(gè)或多個(gè)指標(biāo)的進(jìn)展的延遲或減緩。指標(biāo)的嚴(yán)重度可通過(guò)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的主觀或客觀量度來(lái)測(cè)定。
[0489]“有此需要的受試者”是指確定為需要治療或療法的受試者。
[0490]“施用”是指給受試者提供藥劑或組合物，包括但不限于由醫(yī)學(xué)專業(yè)人員施用和自我施用。
[0491]“胃腸外施用”是指通過(guò)注射或輸注進(jìn)行的施用。胃腸外施用包括但不限于皮下施用、靜脈內(nèi)施用、肌內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用和顱內(nèi)施用。“皮下施用”是指緊在皮膚下方施用。
[0492]“改善功能”是指使功能向正常參數(shù)改變。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)量在受試者的體液中發(fā)現(xiàn)的分子評(píng)估功能?！八幬锝M合物”是指適合于給個(gè)體施用的物質(zhì)的混合物，其包括藥劑。例如，藥物組合物可包含修飾的寡核苷酸和無(wú)菌水性溶液。
[0493]“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA轉(zhuǎn)錄物”和“核酸靶”都是指能夠被反義化合物靶向的核酸?！鞍邢颉笔侵概c靶核酸雜交并且誘導(dǎo)期望的作用的核堿基序列的設(shè)計(jì)和選擇的過(guò)程?！氨话邢颉笔侵妇哂泻藟A基序列，所述序列允許與靶核酸雜交以誘導(dǎo)期望的作用。在某些實(shí)施方案中，期望的作用是靶核酸的減少。
[0494]“調(diào)控”是指對(duì)功能或活性的干擾。在某些實(shí)施方案中，調(diào)控是指基因表達(dá)的增加。在某些實(shí)施方案中，調(diào)控是指基因表達(dá)的減少。
[0495]“表達(dá)”是指藉以將基因的編碼信息轉(zhuǎn)變成存在于細(xì)胞中和在細(xì)胞中運(yùn)轉(zhuǎn)的結(jié)構(gòu)的任何功能和步驟。
[0496]“區(qū)域”是指核酸內(nèi)一部分連接的核苷。在某些實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸具有與靶核酸的區(qū)域互補(bǔ)的核堿基序列。例如，在某些此類實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸與miRNA莖-環(huán)序列的區(qū)域 互補(bǔ)。在某些此類實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸與miRNA序列的區(qū)域100%同一。
[0497]“區(qū)段”是指更小的區(qū)域或區(qū)域的亞部分。
[0498]“核堿基序列”是指以5’至3’方向，不依賴于任何糖、連接和/或核堿基修飾的連續(xù)核喊基的順序。
[0499]“連續(xù)核堿基”是指核酸中彼此緊密相鄰的核堿基。
[0500]“核堿基互補(bǔ)性”是指兩個(gè)核堿基通過(guò)氫鍵非共價(jià)配對(duì)的能力。“互補(bǔ)”是指第一核堿基序列在 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個(gè)核堿基的區(qū)域內(nèi)與第二核堿基序列的互補(bǔ)序列至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 同一，或 100% 同一，或兩個(gè)序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交。在某些實(shí)施方案中，具有與miRNA或其前體100%互補(bǔ)的核堿基序列的修飾的寡核苷酸可以在修飾的寡核苷酸的整個(gè)長(zhǎng)度上不與miRNA或其前體100%互補(bǔ)。
[0501]“互補(bǔ)性”是指第一核酸與第二核酸之間的核堿基配對(duì)能力?！叭L(zhǎng)互補(bǔ)性”是指第一核酸的各核堿基能夠與第二核酸中相應(yīng)的位點(diǎn)上的各核堿基配對(duì)。例如，在某些實(shí)施方案中，其中各核堿基與miRNA中的核堿基具有互補(bǔ)性的修飾的寡核苷酸與miRNA具有全長(zhǎng)互補(bǔ)性。
[0502]“百分比互補(bǔ)性”是指核酸中互補(bǔ)核堿基的數(shù)目除以核酸的長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸的百分比互補(bǔ)性是指與靶核酸互補(bǔ)的核堿基的數(shù)目除以修飾的寡核苷酸的核堿基數(shù)目。在某些實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸的百分比互補(bǔ)性是指與miRNA互補(bǔ)的核堿基的數(shù)目除以修飾的寡核苷酸的核堿基的數(shù)目。
[0503]“百分比結(jié)合的區(qū)域”是指與寡核苷酸區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域的百分比。通過(guò)將與寡核苷酸互補(bǔ)的靶區(qū)域的核堿基的數(shù)目除以靶區(qū)域的長(zhǎng)度來(lái)計(jì)算百分比結(jié)合的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，百分比結(jié)合的區(qū)域是至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%。
[0504]“百分比同一性”是指第一核酸中與第二核酸相應(yīng)的位點(diǎn)上的核堿基相同的核堿基的數(shù)目除以第一核酸中的核堿基的總數(shù)。
[0505]本文中使用的“大體上同一的”可以指第一與第二核堿基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90,95,100 或更多個(gè)核堿基的區(qū)域上至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或99% 同一，或 100% 同一。
[0506]“雜交”是指通過(guò)核堿基的互補(bǔ)性發(fā)生的互補(bǔ)核酸的退火。
[0507]“錯(cuò)配”是指不能夠與第二核酸的相應(yīng)的位點(diǎn)上的核堿基配對(duì)的第一核酸的核堿
基。
[0508]“非互補(bǔ)核堿基”是指不能夠通過(guò)氫鍵配對(duì)的兩個(gè)核堿基。
[0509]“同一的”是指具有相同核堿基序列。
[0510]“miRNA”或“miR”是指長(zhǎng)度在18至25個(gè)核堿基之間的非編碼RNA，其與編碼RNA雜交并且調(diào)控編碼RNA的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，miRNA是Dicer切割pre-miRNA的產(chǎn)物。miRNA 的實(shí)例見于稱為 miRBase 的 miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://microrna.sanger.ac.uk/)。
[0511]“Pre-miRNA”或〃pre_miR”是指具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，其包含miRNA。在某些實(shí)施方案中，pre-miRNA是稱為Drosha的雙鏈RNA特異性核糖核酸酶切割pri_miR的產(chǎn)物。
[0512]“莖-環(huán)序列”是指具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)并且包含成熟miRNA序列的RNA。Pre-miRNA序列和莖-環(huán)序列可重疊。莖-環(huán)序列的實(shí)例可見于稱為miRBase的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(microrna.sanger.ac.uk/)。
[0513]“miRNA前體”是指源自基因組DNA并且包含含有一個(gè)或多個(gè)miRNA序列的非編碼性結(jié)構(gòu)化RNA的轉(zhuǎn)錄物。例如，在某些實(shí)施方案中，miRNA前體是pre-miRNA。在某些實(shí)施方案中，miRNA前體是pr1-miRNA。
[0514]“反義化合物”是指具有允許與靶核酸雜交的核堿基序列的化合物。在某些實(shí)施方案中，反義化合物是具有與靶核酸互補(bǔ)的核堿基序列的寡核苷酸。
[0515]“寡核苷酸”是指連接的核苷的聚合物，各核苷可以彼此獨(dú)立地被修飾或不被修飾?！疤烊话l(fā)生的核苷間連接”是指核苷之間的3’至5’磷酸二酯連接?！疤烊缓藟A基”是指相對(duì)于其天然發(fā)生的形式未被修飾的核堿基?！癿iR拮抗劑”是指經(jīng)設(shè)計(jì)用于干擾或抑制miRNA的活性的試劑。在某些實(shí)施方案中，miR拮抗劑包括靶向miRNA的反義化合物。在某些實(shí)施方案中，miR拮抗劑包括具有與miRNA或其前體的核堿基序列互補(bǔ)的核堿基序列的修飾的寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，miR拮抗劑包括干擾或抑制miRNA的活性的小分子
坐寸ο
[0516]本文中所描述的方法和試劑代表優(yōu)選實(shí)施方案，是示例性的，并且不意欲限制本發(fā)明的范圍。其中的改進(jìn)和其他用途對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯然的。這些改進(jìn)包括在本發(fā)明的精神內(nèi)并且由權(quán)利要求的范圍界定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，同樣極顯然的是可對(duì)本文中公開的發(fā)明進(jìn)行各種替代和改進(jìn)而不背離本發(fā)明的范圍和精神。
[0517]應(yīng)理解，雖然本發(fā)明已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征明確地公開，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用本文中公開的概念的改進(jìn)和變化，并且此類改進(jìn)和變化被認(rèn)為在由所附權(quán)利要求界定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0518]雖然通過(guò)參考各種和優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可進(jìn)行各種變化并且可用等同物替代其元素而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進(jìn)行許多改進(jìn)以使特定的情況或材料適合于本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離本發(fā)明的基本范圍。
[0519]本申請(qǐng)涉及下述實(shí)施方案:
[0520]1.一種方法，所述方法診斷受試者是否患有前列腺相關(guān)病癥或處于發(fā)生前列腺相關(guān)病癥的風(fēng)險(xiǎn)中，確定患有前列腺相關(guān)病癥的受試者的預(yù)后和/或治療患有前列腺相關(guān)病癥的受試者的前列腺相關(guān)病癥，所述方法包括
[0521]測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平，
[0522]其中相對(duì)于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平，測(cè)試樣品中生物標(biāo)志物的水平的改變表示受試者患有所述病癥或處于發(fā)生所述病癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0523]2.項(xiàng)目I的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平低于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平。
[0524]3.項(xiàng)目I的方 法，其中測(cè)試樣品中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平高于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平。
[0525]4.項(xiàng)目I的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物在腫瘤組織和非腫瘤組織之間差異表達(dá)，并且是圖11-表2中所列的一種或多種miR或其功能性變體。
[0526]5.項(xiàng)目4的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖11-表2中所列的在前列腺腫瘤中上調(diào)的一種或多種miR或其功能性變體:miR-32，miR-182，miR-31，miR-26a-l/2，miR-200c, miR-375, miR-196a_l/2， miR-370, miR-425, miR-194-1/2， miR-181a_l/2，miR-34b, let_7i，miR-188, miR-25, miR_106b，miR-449, miR_99b，miR-93, miR-92-1/2，miR-125a。
[0527]6.項(xiàng)目4的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖11-表2中所列的在前列腺腫瘤中下調(diào)的一種或多種miR或其功能性變體:miR-520h、miR-494、miR-490、miR-133a_l、miR-1-2、miR-218-2、miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR_34a、miR-487、let-7bo
[0528]7.項(xiàng)目I的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物與前列腺外疾病相關(guān)，并且選自圖12-表3中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-101-l/2、miR-200a、miR-200b、miR-196a-l/2、miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186、miR-195、let_7f_2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
[0529]8.項(xiàng)目I的方法，其中至少一個(gè)生物標(biāo)志物顯示前列腺腫瘤中miR-Ι與靶基因轉(zhuǎn)錄物水平之間的負(fù)相關(guān)，并且選自圖13A-表4A中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
[0530]9.項(xiàng)目I的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖13B-表4B中所列的一個(gè)或多個(gè) miR 或其功能性變體:miR-l、miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、miR_181a、miR-182、miR-194、miR-196a、miR-200c、miR-218-2、miR-220、miR-329、miR-338、miR_369、miR-409-3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR_520h 和 let_7i。
[0531]10.項(xiàng)目I的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖13B-表4B中所列的一個(gè)或多個(gè) miR 或其功能性變體:miR-32、miR-282-2、miR490 和 miR_520h。
[0532]11.項(xiàng)目I的方法，其包括在前列腺腫瘤中顯示與miR_181a的負(fù)相關(guān)的探針組，其中所述探針組包括圖14-表5中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
[0533]12.項(xiàng)目I的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物是雄激素應(yīng)答性生物標(biāo)志物，并且選自圖15-表6中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-338、miR-126_5p、mir-181b-l 簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。
[0534]13.項(xiàng)目I的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物是圖16-表7中所列的一個(gè)或多個(gè)雄激素受體結(jié)合位點(diǎn)。
[0535]14.項(xiàng)目I的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖23-表9中所列的在前列腺癌中在具有神經(jīng)周浸潤(rùn)的腫瘤中上調(diào)的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-224、miR-21、miR-10 (a/b)、miR_125b (-1/2)、miR-30a/b/c_2/d、miR-100、miR-24(_l/2)、miR-15a-2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、miR_26a(-1/2)、miR-126、miR-145、miR-195、miR-181a_l、miR_199b、miR-151、let_7g。
[0536]15.項(xiàng)目I的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志 物在PNT腫瘤組織與非PNT腫瘤組織之間差異表達(dá)，并且是圖24-表10中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
[0537]16.項(xiàng)目I的方法，其包括下列中的一個(gè)或多個(gè)的增加的表達(dá):前列腺腫瘤中的Dicer和DGCR8,和/或具有高Gleason評(píng)分的腫瘤中的Dicer和編碼argonuate-2的EIF2C2。
[0538]17.項(xiàng)目I的方法，其中所述樣品包括血液樣品。
[0539]18.項(xiàng)目15的方法，其中所述樣品包括血清或血漿血液樣品中的一種或多種。
[0540]19.生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)在腫瘤組織與非腫瘤組織之間差異表達(dá)的生物標(biāo)志物，并且其是圖11-表2中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體。
[0541]20.生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)選自下列的生物標(biāo)志物:圖11-表2中所列的在前列腺腫瘤中上調(diào)的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-32、miR-182、miR-31、miR-26a-l/2、miR-200c、miR-375、miR-196a_l/2、miR-370、miR-425、miR-194-1/2,miR-181a-l/2、miR_34b、let_71、miR-188、miR-25、miR_106b、miR-449、miR_99b、miR-93、miR-92-1/2、miR_125a。
[0542]21.生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)選自下列的生物標(biāo)志物:圖11-表2中所列的在前列腺腫瘤中下調(diào)的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-520h、miR-494、miR-490、miR-133a_l、miR-1-2、miR-218-2, miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR_34a、miR-487、let-7bo
[0543]22.生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)與前列腺外疾病相關(guān)并且選自下列的生物標(biāo)志物:圖12-表3中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-101-1/2、miR-200a、miR-200b、miR-196a_l/2、miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186、miR-195、let_7f_2、miR-34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。[0544]23.生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)顯示miR-Ι與前列腺腫瘤中靶基因轉(zhuǎn)錄物水平之間的負(fù)相關(guān)并且選自下列的生物標(biāo)志物:圖13A-表4A中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
[0545]24.生物標(biāo)志物，其選自圖13B-表4B中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR_l、miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、miR_181a、miR-182、miR-194、miR_196a、miR_200c、miR-218-2、miR-220、miR-329、miR-338、miR-369、miR-409_3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR_520h 和 let_7i。
[0546]25.生物標(biāo)志物，其選自圖13B-表4B中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-32、miR-282-2、miR490 和 miR_520h。
[0547]26.生物標(biāo)志物，其包含在前列腺腫瘤中顯示與miR_181a的負(fù)相關(guān)的探針組，其中所述探針組包括圖14-表5中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
[0548]27.生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)為雄激素應(yīng)答性生物標(biāo)志物并且選自下列的生物標(biāo)志物:圖15-表6中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-338、miR-126_5p、mir-181b-l 簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。
[0549]28.生物標(biāo)志物，其包含圖16-表7中所列的一個(gè)或多個(gè)雄激素受體結(jié)合位點(diǎn)或其功能性變體。
[0550]29.生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)選自下列的生物標(biāo)志物:圖23-表9中所列的在前列腺癌中在具有神經(jīng)周浸潤(rùn)的腫瘤中上調(diào)的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-224、miR-21、miR-10 (a/b)、miR_125b (-1/2)、miR-30a/b/c_2/d、miR-100、miR-24(_l/2)、miR-15a-2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、miR_26a(-1/2)、miR-126、miR-145、miR-195、miR-181a_l、miR_199b、miR-151、let_7g。
[0551] 30.生物標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)在PNT腫瘤組織與非PNT腫瘤組織之間差異表達(dá)的生物標(biāo)志物，并且其是圖24-表10中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
[0552]31.生物標(biāo)志物，其包括下列中的一個(gè)或多個(gè)的增加的表達(dá):前列腺腫瘤中的Dicer和DGCR8,和/或具有高Gleason評(píng)分的腫瘤中的Dicer和編碼argonuate-2的EIF2C2。
[0553]32.前列腺腫瘤中獨(dú)特的微RNA表達(dá)特征，其包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)控腫瘤微RNA加工的生物標(biāo)志物的表達(dá)的改變。
[0554]33.影響前列腺中靶mRNA的轉(zhuǎn)錄物豐度和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其包括使有此需要的受試者中一個(gè)或多個(gè)微RNA失調(diào)。
[0555]34.前述項(xiàng)目的方法，其包括抑制癌癥相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0556]35.前述項(xiàng)目的方法，其包括改變miR-32和miR_106b中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)以抑制癌癥相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0557]36.微RNA和編碼蛋白質(zhì)的RNA的大規(guī)?；虮磉_(dá)特征譜分析的用途，其用于鑒定人前列腺腫瘤中發(fā)生的微RNA功能的改變。
[0558]37.前列腺相關(guān)病癥的腫瘤基因特征，其包括:下列中的一個(gè)或多個(gè):上調(diào)的miR-32，其次 miR-182、miR-31、miR_26a、miR_200c、miR_196a ;和 miR-106b_25 簇；和 / 或顯著下調(diào)的miR-520h、miR-494、miR-490和miR-l_133a簇中的一個(gè)或多個(gè)。
[0559]38.以低誤差邊際與前列腺外疾病擴(kuò)展相關(guān)的腫瘤特征，其包括miR-101。[0560]39.項(xiàng)目I的方法，其中所述生物標(biāo)志物包括在前列腺腫瘤中增加的前列腺腫瘤中的宿主基因表達(dá)。
[0561]40.前述項(xiàng)目的方法，其中所述生物標(biāo)志物包括下列中的一個(gè)或多個(gè):其表達(dá)分別與內(nèi)含子微RNA，miR-32和miR-106b_25簇的表達(dá)相關(guān)的上調(diào)的C9orf5和MCM7。
[0562]41.miR-106b的用途，其作為前列腺癌細(xì)胞中E2F1和/或⑶KNlA基因的靶和/或用于抑制E2F1和/或⑶KNlA基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0563]42.通過(guò)改變前列腺癌細(xì)胞中miR-Ι的表達(dá)進(jìn)行的XP06和PTK9中的一個(gè)或多個(gè)
的調(diào)控。
[0564]43.微RNA與3’ UTR序列的結(jié)合的用途，其用于導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞中靶mRNA的降解和/或積累。
[0565]44.人組織中微RNA與mRNA之間的負(fù)相關(guān)和/或正相關(guān)的用途，其用于預(yù)測(cè)微RNA的靶基因。
[0566]45.用于鑒定受微RNA調(diào)控的mRNA的方法，其包括進(jìn)行人組織中的微RNA和mRNA的表達(dá)的關(guān)聯(lián)分 析。
[0567]46.miR表達(dá)反義抑制劑，其包括miR-32和miR_106b中的一個(gè)或多個(gè)。
[0568]47.前列腺病癥或疾病的oncomiR生物標(biāo)志物，其包括下列中的一個(gè)或多個(gè):miR-Ι、miR-32 和 mir-106b-25 簇。
[0569]48.用于調(diào)控前列腺癌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其包括在前列腺癌細(xì)胞中調(diào)控miR-Ι、miR-32和mir-106b_25簇中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)。
[0570]49.用于抑制前列腺癌細(xì)胞中輸出蛋白-6和PTK9中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)的組合物，所述組合物包含miR-Ι或其功能性變體。
[0571]50.用于調(diào)控有此需要的受試者中E2F1和p21/WAFl中的一個(gè)或多個(gè)的蛋白水平的方法，其包括使用miR-106b或其功能性變體。
[0572]51.一種組合物，其包含用于增加有此需要的受試者的前列腺癌細(xì)胞中P21/WAF1和/或E2F1的蛋白水平的反義miR-106b。
[0573]52.項(xiàng)目I的方法，其包括確定患有前列腺癌的受試者的預(yù)后，包括測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平，其中:i)生物標(biāo)志物與前列腺癌中不利的預(yù)后相關(guān)；和ii)相對(duì)于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平，前列腺測(cè)試樣品中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平的改變表示不利的預(yù)后。
[0574]53.項(xiàng)目I的方法，其包括診斷受試者是否患有前列腺癌或處于發(fā)生前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中，所述方法包括:(I)從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；(2)將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供測(cè)試樣品的雜交特征譜；和(3)將測(cè)試樣品雜交特征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較，其中至少一個(gè)miRNA的信號(hào)的改變表示受試者患有前列腺癌或處于發(fā)生前列腺癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0575]54.前述項(xiàng)目的方法，其中相對(duì)于從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)，至少一個(gè)miRNA的信號(hào)下調(diào)，和/或其中相對(duì)于從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)，至少一個(gè)miRNA的信號(hào)上調(diào)。
[0576]55.前述項(xiàng)目的方法，其中選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的組的至少一個(gè)生物標(biāo)志物的信號(hào)的改變表示受試者患有具有不利預(yù)后的前列腺癌或處于發(fā)生所述癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0577]56.治療患有前列腺癌的受試者的前列腺癌的方法，在所述前列腺癌中至少一個(gè)生物標(biāo)志物在受試者的癌細(xì)胞中相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞下調(diào)或上調(diào)，所述方法包括:(I)當(dāng)所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物在癌細(xì)胞中下調(diào)時(shí)，給受試者施用有效量的至少一個(gè)分離的生物標(biāo)志物，或其分離的變體或生物學(xué)活性片段，以便受試者中癌細(xì)胞的增殖被抑制；或(2)當(dāng)所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物在癌細(xì)胞中上調(diào)時(shí)，給受試者施用有效量的至少一種抑制所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物表達(dá)的化合物，以便受試者中癌細(xì)胞的增殖被抑制。
[0578]57.治療受試者的前列腺癌的方法，其包括:(I)測(cè)定相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的量；和(2)通過(guò)下列來(lái)改變前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量:(i)如果癌細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量低于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量，給受試者施用有效量的至少一個(gè)分離的生物標(biāo)志物；或Qi)如果癌細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量高于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物表達(dá)的化合物。
[0579]58.用于治療前列腺癌的藥物組合物，其包含至少一個(gè)分離的生物標(biāo)志物和可藥用載體。
[0580]59.前述項(xiàng)目的藥物組合物，其中所述至少一個(gè)分離的生物標(biāo)志物相應(yīng)于相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞在前列腺癌細(xì)胞中下調(diào)的生物標(biāo)志物。
[0581]60.前述項(xiàng)目的藥物組合物，其包含至少一個(gè)miR表達(dá)抑制劑化合物和可藥用載體。
[0582]61.鑒定抗前列腺癌試劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑和測(cè)量與前列腺癌細(xì)胞中減少的表達(dá)水平相關(guān)的至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平，其中相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，細(xì)胞中生物標(biāo)志物的水平的增加表示測(cè)試試劑是抗前列腺癌試劑。
[0583]62.鑒定抗前列腺癌試劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑和測(cè)量與前列腺癌細(xì)胞中增加的表達(dá)水平相關(guān)的至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平，其中相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，細(xì)胞中生物標(biāo)志物的水平的減少表示測(cè)試試劑是抗前列腺癌試劑。
[0584]63.評(píng)估療法預(yù)防、診斷和/或治療前列腺癌相關(guān)疾病的有效性的方法，其包括:i)使動(dòng)物經(jīng)歷其有效性待評(píng)估的療法，和ii)通過(guò)評(píng)估表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表
7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物來(lái)測(cè)定被測(cè)試的療法在治療或預(yù)防疾病中的有效性的水平。
[0585]64.前述項(xiàng)目的方法，其中候選治療劑包括:藥物組合物、營(yíng)養(yǎng)組合物和順勢(shì)療法組合物中的一種或多種。
[0586]65.前述項(xiàng)目的方法，其中被評(píng)估的療法用于人受試者。
[0587]66.一種制品,其包含:至少一種結(jié)合前列腺癌相關(guān)疾病的標(biāo)志物的捕獲試劑，所述標(biāo)志物包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物。
[0588]67.用于篩選治療前列腺癌相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中所述試劑盒包括:表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物的一個(gè)或多個(gè)試劑，和表達(dá)至少一個(gè)生物標(biāo)志物的細(xì)胞。
[0589]68.前述項(xiàng)目的試劑盒，其中使用包含特異性結(jié)合至少一個(gè)生物標(biāo)志物的抗體或抗體片段的試劑檢測(cè)生物標(biāo)志物的存在。
[0590]69.干擾前列腺癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的試劑用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或或限制個(gè)體中疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度，其中所述試劑包含表2、表
3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物。
[0591]70.治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制有此需要的個(gè)體的前列腺癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度的方法，其包括:給個(gè)體施用干擾至少前列腺癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑，其中所述試劑包含表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物。
[0592]71.干擾至少前列腺癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個(gè)體的前列腺癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度，其中所述試劑包含表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個(gè)或多個(gè)中所列的至少一個(gè)生物標(biāo)志物。
[0593]72.包含miR-l、miR-32和miR_106b中的一個(gè)或多個(gè)的反義抑制劑的組合物。
[0594]73.治療有此需要的受試者中的前列腺病癥的方法，其包括給受試者施用治療有效量的前述項(xiàng)目的組合物。
[0595]74.前述項(xiàng)目的方法，其中預(yù)防性施用所述組合物。
[0596]75.前述項(xiàng)目的 方法，其中所述組合物的施用延遲病癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀的發(fā)作。
[0597]76.前述項(xiàng)目的方法，其中肽的施用抑制前列腺癌的發(fā)生。
[0598]77.前述項(xiàng)目的方法，其中肽的施用抑制腫瘤生長(zhǎng)。
[0599]78.前述項(xiàng)目的方法，其中肽的施用抑制感染。
[0600]79.用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中前列腺癌的存在的方法，該方法包括:a)將懷疑包含前列腺癌的生物學(xué)樣品暴露于用于其的標(biāo)志物；和《如果有的話，檢測(cè)樣品中所述標(biāo)志物的存在或不存在。
[0601]80.前述項(xiàng)目的方法,其中所述標(biāo)志物包括可檢測(cè)的標(biāo)記。
[0602]81.前述項(xiàng)目的方法，其還包括將來(lái)自受試者的生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量與來(lái)自正常受試者的相應(yīng)的生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量相比較。
[0603]82.前述項(xiàng)目的方法，其還包括在不同時(shí)間點(diǎn)從受試者收集多個(gè)生物學(xué)樣品和比較各生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量以確定標(biāo)志物的量在受試者中是隨時(shí)間增加還是減少。
[0604]83.治療受試者的前列腺癌的方法，該方法包括:給有此需要的受試者施用治療有效量的前列腺受體激動(dòng)劑。
[0605]84.前述項(xiàng)目的方法，其中所述受體激動(dòng)劑是:miRl、miR-21和miR_106b中的一個(gè)或多個(gè)的反義抑制劑。
[0606]85.制造用于治療前列腺癌的藥物的用途，所述藥物包含選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中顯示的miR、來(lái)源于其的序列、此類miR的互補(bǔ)序列和來(lái)源于這樣的互補(bǔ)序列的序列的核酸分子。
[0607]86.前述項(xiàng)目的用途，其中所述藥物包含核酸分子，所述核酸分子提供選自下列的序列:表2中所列的miR、來(lái)源于此類miR的序列、此類miR的互補(bǔ)序列和來(lái)源于這樣的互補(bǔ)序列的序列。
[0608]87.鑒定誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞分化的有效治療劑或治療劑的組合的體外方法，該方法包括步驟:i)培養(yǎng)來(lái)源于前列腺腫瘤的細(xì)胞，ii)向細(xì)胞系的培養(yǎng)基中加入至少一種化合物，iii)分析步驟Q)與(ii)之間至少一個(gè)miR的表達(dá)水平的變化和iv)鑒定誘導(dǎo)步驟Q)與Qi)之間miR的表達(dá)水平的變化的化合物或化合物的組合。
[0609]88.前述項(xiàng)目的方法，其中步驟(iii)包括分析至少一個(gè)miR的表達(dá)水平。
[0610]89.前述項(xiàng)目的方法，其中步驟(iv)包括鑒定調(diào)控至少一個(gè)miR的表達(dá)水平的化合物或化合物的組合。
[0611]90.前述項(xiàng)目的方法，其中步驟(iv)包括鑒定減少至少一個(gè)miR的表達(dá)水平的化合物或化合物的組合。
[0612]91.前述項(xiàng)目的方法，其中所述化合物是治療癌癥的治療劑。
[0613]92.用于分類受試者的前列腺組織的方法，其包括:
[0614]a)測(cè)量測(cè)試細(xì)胞群體中選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的組的一個(gè)或多個(gè)核酸序列的表達(dá)，其中所述測(cè)試細(xì)胞群體中至少一個(gè)細(xì)胞能夠表達(dá)選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的組的一個(gè)或多個(gè)核酸序列；
[0615]b)將所述核酸序列的表達(dá)與參照細(xì)胞群體中核酸序列的表達(dá)相比較，所述參照細(xì)胞群體包含至少一個(gè)已知其前列腺癌分類的細(xì)胞；和
[0616]c)如果存在， 鑒定測(cè)試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體中選擇的一個(gè)或多個(gè)核酸序列的表達(dá)水平的差異，從而分類受試者的前列腺癌。
[0617]93.項(xiàng)目86的方法，其中與參照細(xì)胞群體相比，測(cè)試細(xì)胞群體中核酸的表達(dá)的差異表示測(cè)試細(xì)胞群體具有與來(lái)自參照細(xì)胞群體的細(xì)胞不同的分類。
[0618]94.項(xiàng)目86的方法，其中與參照細(xì)胞群體相比，測(cè)試細(xì)胞群體中核酸的相似表達(dá)模式表示測(cè)試細(xì)胞群體具有與來(lái)自參照細(xì)胞群體的細(xì)胞相同的分類。
[0619]95.項(xiàng)目86的方法，其中所述參照細(xì)胞群體是多個(gè)細(xì)胞或數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0620]96.前述項(xiàng)目的方法，其中所述參照細(xì)胞群體選自:分類為來(lái)自正常前列腺組織的細(xì)胞群體的參照細(xì)胞群體、分類為來(lái)自良性前列腺組織的細(xì)胞群體的參照細(xì)胞群體和分類為來(lái)自惡性前列腺組織的細(xì)胞群體的參照細(xì)胞群體。
[0621]參考文獻(xiàn)
[0622]本文中用于舉例說(shuō)明本發(fā)明或提供關(guān)于本發(fā)明的實(shí)施的另外的詳細(xì)內(nèi)容的公開案和其他材料通過(guò)引用合并入本文，并且為方便起見提供于下列參考書目中。
[0623]本文中引用的任何文獻(xiàn)的引用不意欲作為任何前述內(nèi)容是相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。關(guān)于日期的所有聲明和關(guān)于這些文獻(xiàn)的內(nèi)容的所有陳述基于 申請(qǐng)人:可獲得的信息，并且不構(gòu)成關(guān)于這些文獻(xiàn)的日期或內(nèi)容的正確性的任何承認(rèn)。
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【權(quán)利要求】
1.一種方法，所述方法診斷受試者是否患有前列腺相關(guān)病癥或處于發(fā)生前列腺相關(guān)病癥的風(fēng)險(xiǎn)中，確定患有前列腺相關(guān)病癥的受試者的預(yù)后和/或治療患有前列腺相關(guān)病癥的受試者的前列腺相關(guān)病癥，所述方法包括 測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平， 其中相對(duì)于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平，測(cè)試樣品中生物標(biāo)志物的水平的改變表示受試者患有所述病癥或處于發(fā)生所述病癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平低于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平。
3.權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物的水平高于對(duì)照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物在腫瘤組織和非腫瘤組織之間差異表達(dá)，并且是圖11-表2中所列的一種或多種miR或其功能性變體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖11-表2中所列的在前列腺腫瘤中上調(diào)的一種或多種HiiR或其功能性變體:miR-32，miR-182，miR-31，miR-26a-l/2，miR-200c, miR-375, miR-196a_l/2， miR-370, miR-425, miR-194-1/2， miR-181a_l/2，miR-34b, let_7i，miR-188, miR-25, miR_106b，miR-449, miR_99b，miR-93, miR-92-1/2，miR-125a。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖11-表2中所列的在前列腺腫瘤中下調(diào)的一 種或多種miR或其功能性變體:miR-520h、miR-494、miR-490、miR-133a_l、miR-1-2、miR-218-2、miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR_34a、miR-487、let-7bo
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物與前列腺外疾病相關(guān)，并且選自圖12-表3中所列的一個(gè)或多個(gè)miR或其功能性變體:miR-101-l/2、miR-200a、miR-200b、miR-196a-l/2、miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186、miR-195、let_7f_2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
8.權(quán)利要求1的方法，其中至少一個(gè)生物標(biāo)志物顯示前列腺腫瘤中miR-1與靶基因轉(zhuǎn)錄物水平之間的負(fù)相關(guān)，并且選自圖13A-表4A中所列的一個(gè)或多個(gè)基因或其功能性變體。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖13B-表4B中所列的一個(gè)或多個(gè) miR 或其功能性變體:miR-l、miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、miR_181a、miR-182、miR-194、miR-196a、miR-200c、miR-218-2、miR-220、miR-329、miR-338、miR_369、miR-409-3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR-520h 和 let_7i。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)生物標(biāo)志物選自圖13B-表4B中所列的一個(gè)或多個(gè) miR 或其功能性變體:miR-32、miR-282-2, miR490 和 miR_520h。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104031984SQ201410133658
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2008年2月28日
【發(fā)明者】C·M·克羅斯, S·阿姆布斯 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會(huì), 由衛(wèi)生與公眾服務(wù)部代表的美利堅(jiān)合眾國(guó)政府