一種慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。所述慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體為pCDH-MCS-MuSK-GFP，其核苷酸序列如序列表如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明更進(jìn)一步公開了慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體在制備用于構(gòu)建抗肌肉特異性受體酪氨酸激酶抗體檢測方面的應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建病毒載體建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MuSK的細(xì)胞系，采用靈敏度和特異性更高的熒光免疫細(xì)胞染色結(jié)合流式細(xì)胞檢測技術(shù)，用于臨床定性、定量檢測MuSK抗體，使檢測結(jié)果更加穩(wěn)定，且極大節(jié)約人力和時間成本。該項(xiàng)目的建立將極大提高重癥肌無力的診療水平，提高患者的勞動能力和生活質(zhì)量，將產(chǎn)生很大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，具體是慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和在構(gòu)建抗肌肉特異性受體酪氨酸激酶(muscle specific kinase,MuSK )抗體檢測的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癥肌無力(Myasthenia gravis,MG)是一種由抗體介導(dǎo)的,主要累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜乙酰膽堿受體(acytylcholine receptor, AchR),導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭傳遞障礙的自身免疫性疾病。其臨床特征為部分或全身骨骼肌易疲勞，呈波動性肌無力，具有在活動后加重，休息后緩解和晨輕暮重等特點(diǎn)。隨著醫(yī)療診斷水平的不斷提高和人們生活環(huán)境等因素的變化，MG的發(fā)病率呈逐漸升高的趨勢，因此，早期鑒別診斷對指導(dǎo)兩種疾病的治療和評估預(yù)后非常重要。
[0003]重癥肌無力因其癥狀具有波動性的特點(diǎn)且易與其它相似疾病混淆，所以診斷一直是醫(yī)學(xué)上的難點(diǎn)。血清特異性抗體的檢測在MG的診斷和發(fā)病機(jī)制研究等方面有重要意義。研究證明MG的發(fā)病機(jī)制可能為體內(nèi)產(chǎn)生的AChR-Ab同AChR相結(jié)合，在補(bǔ)體參與下與AChR發(fā)生應(yīng)答。一方面引起細(xì)胞膜 溶解，使AChR大量破壞；一方面可以使膜表面的AChR交聯(lián)，增加AChR的退化速度。但是約20%的重癥肌無力患者體內(nèi)不能檢測到AChR-Ab。研究發(fā)現(xiàn)，50% AChR-Ab陰性患者血清IgG能與肌肉特異性TE671細(xì)胞株結(jié)合，而不與表達(dá)AChR的人囊胚腎細(xì)胞(human embryonic kidney cells, HEK293)結(jié)合。雖然AChR-Ab陰性患者血清能抑制TE671細(xì)胞株AChR的功能，但這些血清中AChR的數(shù)目并不減少。這些證明AChR-Ab陰性患者血清IgG抗體結(jié)合的不是AChR，而是同AChR有密切聯(lián)系的，能調(diào)節(jié)AChR的肌蛋白，并證明是抗肌肉特異性受體酪氨酸激酶(muscle specific kinase, MuSK)。MuSK-Ab與MuSK的細(xì)胞外段直接結(jié)合，抑制發(fā)育中凝集蛋白(Agrin)介導(dǎo)的AChRs在細(xì)胞突觸后膜的聚集。雖然這些抗體在體內(nèi)引起肌無力的機(jī)制還不明確，但是MuSK-Ab的出現(xiàn)定義了一組AChR-Ab陰性患者亞群。40% -70% AChR-Ab陰性MG患者血清中含有抗肌肉特異性受體酪氨酸激酶抗體。所以現(xiàn)在將AChR-Ab陰性MG又分為兩部分，一是MuSK-Ab陽性；二是AChR-Ab和MuSK-Ab均陰性，也稱為血清抗體陰性重癥肌無力(seronegative myastheniagravis, SNMG)。MuSK-Ab的發(fā)現(xiàn),有助于進(jìn)一步研究MG的發(fā)病機(jī)制和總結(jié)臨床特征。
[0004]MuSK抗體陽性的患者，多是女性并且中早發(fā)型(發(fā)病年齡小于40歲者)占70%，臨床癥狀多表現(xiàn)為延髓肌無力、面肌無力，隨著病情的發(fā)展容易出現(xiàn)肌無力危象，面肌萎縮。胸腺區(qū)組織學(xué)多正常或輕微不正常，胸腺切除對MuSK-Ab陽性MG患者療效無顯著意義。MuSK-Ab陽性MG患者通常對抗膽堿酯酶藥物療效差，傳統(tǒng)的免疫抑制治療反應(yīng)差。MuSK-Ab只能在AChR-Ab陰性的MG患者血清中檢測出，不存在于AChR-Ab陽性MG的血清中，而且在其他肌肉相關(guān)疾病的患者血清中也不能檢測出。MuSK抗體在AChR-Ab陰性MG的出現(xiàn)是有特異性的，在檢測AChR-Ab陰性患者中具有診斷意義。而我國目前對MuSK-Ab陽性MG的特征認(rèn)識不足，對MuSK-Ab的檢測尚處空白。[0005]目前國際上檢測MuSK抗體的技術(shù)主要有間接免疫熒光法(IndirectImmunofluorescence, IIF)、突光免疫沉淀法(Fluoroimmunoprecipitation Assay,FI PA)、放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay, RI PA)、突光免疫細(xì)胞染色法(Cell-Based fluorescent immunostaining Assay, CBA)及酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Tmmun o Sorbent Assay, ELISA)。ELISA 是較常用的方法,但是其敏感性和特異性不高；RIPA雖然敏感性和特異性高但因放射性物質(zhì)對環(huán)境等的不利影響，其應(yīng)用受到限制；目前以CBA和FIPA的敏感性和特異性最為理想。然而，CBA法平均檢測周期超過兩天，熒光效率不穩(wěn)定，而且需要人為觀察，費(fèi)時費(fèi)力，而且可能會增加檢測中的人為誤差；FIPA法同樣涉及到同位素的應(yīng)用，環(huán)境危害性大大增加。此外，針對MuSK自身抗體的檢測國內(nèi)目前只少數(shù)研究者利用CBA和FIPA做了科研研究，尚未常規(guī)應(yīng)用于臨床，因此何種方法作為“金標(biāo)準(zhǔn)”被推薦應(yīng)用于臨床MuSK抗體的檢測尚待闡明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明結(jié)合病毒載體構(gòu)建，轉(zhuǎn)染，熒光免疫染色及流式細(xì)胞分析技術(shù)，主要應(yīng)用于重癥肌無力臨床鑒別診斷，提高重癥肌無力診斷水平；能輔助作為用藥療效、病情監(jiān)測、復(fù)發(fā)預(yù)測的指標(biāo)；本發(fā)明提供一種抗肌肉特異性受體酪氨酸激酶自身抗體的檢測方法，可以克服已有技術(shù)的缺陷。將人MuSK isoform 2的cDNA全長克隆到雙表達(dá)慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EFl-CopGFP的多克隆位點(diǎn)區(qū)，包裝病毒，用病毒侵染293T細(xì)胞，流式分選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)MuSK和GFP的細(xì)胞系，采用靈敏度和特異性更高的細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)合流式細(xì)胞檢測技術(shù)用于臨床定性、定量檢測MuSK-Ab。MuSK-Ab檢測平臺的建立能為進(jìn)一步研究MuSK抗體的致病機(jī)制提供基礎(chǔ)。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的為發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容: 本發(fā)明的一個目的是提供一種慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體，其特征在于所述慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體為pCDH-MCS-MuSK-GFP，其核苷酸序列如序列表如SEQ ID N0.2所示。
[0008]本發(fā)明另一個目的是提供一種慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，它包括的步驟:
I)載體構(gòu)建:
以人肌肉組織 cDNA 為模板，利用引物 MuskF: 5’ -CCAGCTAGCATGAGAGAGCTCGTCAACATTCCAC-3’ 和MuskR 5’-CACAGCGGCCGCTTAGACACTCACAGTTCCCTCTGCC-3’ 擴(kuò)增MuSK isoform 2cDNA序列,序列表中SEQ ID N0.1所示,具體步驟如下:
向PCR反應(yīng)管中依次加入DNA模板300 ng，引物各終濃度為0.4 μ mol/L, dNTP終濃度為 0.2 μ mol/L, IOXPCR 緩沖液 5 μ I，Taq DNA 聚合酶 0.5 μ 1，終濃度約 5U/ μ 1，ddH20 補(bǔ)到終體積為50 μ I。PCR的循環(huán)程序?yàn)?94°C變性4分鐘，98°C 10s，68°C退火45s，72°C延伸2min，共循環(huán)32次，以確保充分延伸。
[0009]2)應(yīng)用膠回收試劑盒對擴(kuò)增片段切膠回收(Axygen公司)后連入T載體，經(jīng)測序比對序列正確后將其用NheI和NotI雙酶切。具體步驟如下:
加入DNA I μ g和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶NheI和NotI 2 μ I,再加入重蒸水使總體積為19 μ I,將管內(nèi)溶液混勻后加入I μ I酶液?；靹蚍磻?yīng)體系后，37°C水浴保溫2_3小時，使酶切反應(yīng)完全。反應(yīng)完成后制備瓊脂糖凝膠，取IOy I酶解液與2μ I 6Χ載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中，加完樣后合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳，紫外成像系統(tǒng)觀察并測定DNA酶切片段大小。鑒定正確后，與經(jīng)NheI和NotI雙酶切后的P⑶H-MCS-MCS-EF1-copGFP質(zhì)粒載體(上海吉凱基因有限公司)相連接，得到所用的表達(dá)MuSK和GFP的慢病毒質(zhì)粒載體:pCDH-MCS-MuSK-GFP。構(gòu)建好的病毒載體的完整序列如序列表中SEQ ID N0.2所示。構(gòu)建好的病毒載體的完整序列:
acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatactagtattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagattctagagctagcatgagagagctcgtcaacattccactggtacatattcttactctggttgccttcagcggaactgagaaacttccaaaagctcctgtcatcaccactcctcttgaaacagtggatgccttagttgaagaagtggctactttcatgtgtgcagtggaatcctacccccagcctgagatttcctggac tagaaataaaattctcattaaactctttgacacccggtacagcatccgggagaatgggcagctcctca
【權(quán)利要求】
1.一種慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體，其特征在于所述慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體為pCDH-MCS-MuSK-GFP，其核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。
2.—種權(quán)利要求1所述慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行: 1)載體構(gòu)建:以人肌肉組織cDNA為模板，利用引物MuskF:5’ -CCAGCTAGCATGAGAGAGCTCGTCAACATTCCAC-3’ 和 MuskR 5’ -CACAGCGGCCGCTTAGACACTCACAGTTCCCTCTGCC-3’ 擴(kuò)增MuSK isoform 2 cDNA序列，序列表中SEQ ID N0.1所不，具體步驟如下: 向PCR反應(yīng)管中依次加入DNA模板300 ng，引物各終濃度為0.4 μ mol/L, dNTP終濃度為 0.2 μ mol/L, 10XPCR 緩沖液 5 μ I，Taq DNA 聚合酶 0.5 μ 1，終濃度約 5U/ μ 1，ddH20 補(bǔ)到終體積為50μ I ; PCR的循環(huán)程序?yàn)?94°C變性4分鐘，98°C 10s，68°C退火45s，72°C延伸2min，共循環(huán)32次，以確保充分延伸； 2)應(yīng)用膠回收試劑盒對擴(kuò)增片段切膠回收；后連入T載體，經(jīng)測序比對序列正確后將其用NheI和NotI雙酶切，具體步驟如下: 加入DNA Iyg和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶NheI和NotI 2μ I,再加入重蒸水使總體積為19 μ I,將管內(nèi)溶液混勻后加入I μ I酶液；混勻反應(yīng)體系后，37°C水浴保溫2_3小時，使酶切反應(yīng)完全，反應(yīng)完成后制備瓊脂糖凝膠，取IOy I酶解液與2μ I 6Χ載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中，加完樣后合上電泳槽蓋，立即接通電源，控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳，紫外成像系統(tǒng)觀察并測定DNA酶切片段大小，鑒定正確后，與經(jīng)NheI和NotI雙酶切后的pCDH-MCS-MCS-EFl-copGFP質(zhì)粒載體相連接，得到所用的表達(dá)MuSK和GFP的慢病毒質(zhì)粒載體:pCDH-MCS-MuSK-GFP。
3.權(quán)利要求1所述慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體在制備用于構(gòu)建抗肌肉特異性受體酪氨酸激酶抗體檢測方面的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述構(gòu)建抗肌肉特異性受體酪氨酸激酶抗體檢測的應(yīng)用，其特征在于它是由下述步驟組成: 1)利用CaCl2法病毒包裝表達(dá)MuSK-GFP(pCDH-MCS-Musk-EFl-copGFP)融合蛋白的慢病毒，收集病毒懸液在6 μ g/ml Polybrene存在的情況下感染HEK293細(xì)胞，I周后,分選陽性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
5.繼續(xù)傳代培養(yǎng)后進(jìn)行二次篩選，獲得100%轉(zhuǎn)染過的穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系，培養(yǎng)條件:37°C、含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的HEK293 細(xì)胞； 具體步驟:待HEK293細(xì)胞長至70%密度時，撤掉舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞，利用CaCl2法病毒包裝表達(dá)MuSK-GFP融合蛋白的慢病毒，收集病毒懸液在6 μ g/ml Polybrene存在的情況下感染HEK293細(xì)胞，37°C培養(yǎng)14小時，第二天換成完全培養(yǎng)基，I周后，流式細(xì)胞術(shù)分選陽性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞；繼續(xù)傳代培養(yǎng)后進(jìn)行二次篩選，獲得100%轉(zhuǎn)染過的穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系； 2)流式細(xì)胞術(shù)測定血清Musk抗體: 獲得待檢血清后，用含1%BSA (Sigma) DMEM-Hepes洗液稀釋待測血清，收集轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，按I:1的比例混合，總數(shù)為5X105，用流式staining緩沖液(I XPBS含3%的馬血清及0.02%的疊氮鈉NaN3)清洗I次，離心后棄去上清，用100 μ I稀釋過的血清或人Ig對照重懸細(xì)胞，4度孵育30min,然后加入流式staining緩沖液清洗I次,離心收集細(xì)胞后加入IOOul稀釋后的Fast blue標(biāo)記的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining緩沖液清洗I次，然后用300ul流式staining緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀雙通道檢測熒光信號，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞亞群及人IgG染色組為對照，判斷MuSK抗體陽性樣本，此外，GFP陽性細(xì)胞類群中的Fast blue信號強(qiáng)弱可用來標(biāo)示抗體濃度的相對量； 3)細(xì)胞免疫熒光法測定血清Musk抗體，具體實(shí)驗(yàn)方法過程: 對HEK293細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，并轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；利用PEI對EGFP標(biāo)記的人MuSKcDNA (MuSK-GFP)質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；待轉(zhuǎn)染效率至70%以上時，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液，再加入適量蛋白酶抑制劑；收集細(xì)胞裂解液于EP管中，輪轉(zhuǎn)I小時，13000rpm離心15min，收集上清，即為相應(yīng)抗原提取液； 解凍待測組血清，觀察濾光離心5min，取上清10 μ 1，分別加入已稀釋的50 μ I抗原提取液，混合后輪轉(zhuǎn)過夜，然后加入適量非特異山羊抗人IgG，孵育后離心，棄上清，收集沉淀，最后用Iml裂解提取緩沖液漂洗沉淀，重復(fù)3次；將沉淀移入96孔板中，在高速多通道連續(xù)波長酶標(biāo)儀上獲取熒光吸光度，以健康對照組熒光均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差以上為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，每份血清檢測均雙盲，并重復(fù)3遍； 4)統(tǒng)計(jì)分析:使用Gra phPadPrism 4對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計(jì)分析。
【文檔編號】C12N15/867GK104017827SQ201410135044
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】閆亞平, 施福東, 李敏淑, 金薇娜, 齊媛 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院