一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法，包括：用PCR方法獲得目的基因，將GFAP啟動子從pAAV-GFAP-hchR2-mcherry-WPRE載體上用合適的限制性內(nèi)切酶切下，與目的基因連接克隆到pUC19載體上，然后通過合適的酶切位點將GFAP-EGFP-mir-505片段從pUC載體上切下，克隆到PB載體上，獲得載體。本發(fā)明可與表達轉(zhuǎn)座酶的輔助載體共注射小鼠的受精卵的雄性原核，得到轉(zhuǎn)基因小鼠，用以研究miR-505在神經(jīng)系統(tǒng)特別是在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的包括調(diào)控性發(fā)育啟動在內(nèi)的生物學(xué)功能，并且EGFP蛋白能方便地顯示外源基因在神經(jīng)系統(tǒng)中的定位。
【專利說明】一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因小鼠領(lǐng)域，特別涉及一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNA是長度為21-25堿基單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。自從1993年第一個miRNA被報道以來，人們發(fā)現(xiàn)miRNAs幾乎參與了所有重要的生物學(xué)過程的調(diào)控[Bartel DP(2004)MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.Cel1116(2):281-297], miRNAs的異常表達與人類多種疾病相關(guān)[Ambros V,朱萬渠(2010):Micr0RNAs與疾病和發(fā)育生命科學(xué)3:27-29]。迄今為止，700多種已被鑒定出來的人源性miRNAs調(diào)控了人類1/3以上基因的表達。miR-505位于小鼠X染色體X:57647578-57647667處，ATPllC基因的第一和第二外顯子之間的第一個內(nèi)含子中，對于其生物學(xué)功能的研究目前還處于起步階段。2010年，Verduci L等發(fā)現(xiàn)miR-505能通過作用于其靶標ASF/SF2 (可變剪接因子)發(fā)揮調(diào)控小鼠胚胎成纖維細胞的增殖和衰老/凋亡的作用[Verduci, L, Simili M, RizzoM, Mercatanti A, Evangelista M et al.(2010)MicroRNA(miRNA)-mediated Interactionbetween Leukemia/Lymphoma-related Factor(LRF)and Alternative splicing factor/splicing factor2(ASF/SF2)affects mouse embryonic fibroblast senescence andapoptosis.J Biol Chem, 285:39551-39563], ASF/SF2 也成為目前唯一經(jīng)實驗驗證過的miR-505的靶蛋白。Karni R等發(fā)現(xiàn)在許多細胞中轉(zhuǎn)染ASF/SF2可以激活mTOR部分信號通路[Karni R, Hippo Y, Lowe Sff, Krainer AR(2008) The splicing-factor oncoproteinSF2/ASFactivates mTORCl.Proc Natl Acad Sci USA105 (40): 15323-15327]，但是 ASF 參與調(diào)控mTOR的具體方式還不清楚。Yamamoto Y等在研究腫瘤多藥抗性時,發(fā)現(xiàn)miR-505是一個新的腫瘤抑制miRNA，與其呈現(xiàn)負相關(guān)的蛋白Akt3，與mTOR通路上的AKT屬于同一基因家方矣[Yamamoto Y, Yoshioka Y, Minoura K, Takahashi R, Takeshita F etal., (2011)An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNAand gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells.MolCancer, 10:13539551-39563]。因此我們有理由推測，miR-505可能參與調(diào)控mTOR信號通路，而具體的作用機制有待進一步研究和證實。mTOR信號通路被證明參與了大鼠的性發(fā)育啟動調(diào)控，而小鼠性發(fā)育啟動的調(diào)控中樞在下丘腦神經(jīng)元，因此在神經(jīng)元中特異性高表達miR-505對研究miR-505的生物學(xué)功能有重要的作用。
[0003]GFAP是膠質(zhì)細胞酸性蛋白，其啟動子能指導(dǎo)在轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中特異表達外源蛋白[Nolte C, Matyash M, Pivneva T, Schipke eg, Ohlemeyer C，HanischU, Kirchhoff F and Kettenmann H, (2001)GFAP promoter-controlled egfp expressingtransgenic mice:a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living braintissue.GLIA33:72 - 86]。因此在本研究中采用GFAP啟動子來指導(dǎo)在神經(jīng)元中特異性表達外源的miR505，同時導(dǎo)入EGFP基因來指示外源基因在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達區(qū)域，將這些表達元件構(gòu)建在PB表達載體上。
[0004]PB載體是piggybac轉(zhuǎn)座子載體，PiggyBac轉(zhuǎn)座子能夠在生物體染色體中準確地切出和轉(zhuǎn)座，適用范圍較廣，首先在在鱗翅目等昆蟲中作為基因轉(zhuǎn)移載體發(fā)揮作用，但現(xiàn)在已被證明也可在小鼠中發(fā)揮高效的轉(zhuǎn)基因作用[Ding S，Wu X，Li G, Han M, Zhuang Y andXu T(2005)Efficient Transposition of the piggyBac Resource(PB)Transposon inMammalian Cells and Mice.Celll22:473 - 483]。轉(zhuǎn)基因小鼠是研究基因功能的有效工具，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠一般通過利用質(zhì)粒進行受精卵原核注射的方式來制備。通常會得到多個品系(Founders)。不同品系由于質(zhì)粒在染色體上的整合位點不同、拷貝數(shù)不同，不同品系之間不容易得到一致的結(jié)果。由于轉(zhuǎn)基因小鼠傳代后拷貝數(shù)稀釋以及基因沉默等原因，同一品系的表型在傳代過程中也很容易丟失，造成實驗結(jié)果不能重復(fù)。而PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體轉(zhuǎn)座機制是遵循一剪切一粘貼Il (cut一and一paste)機制,能在小鼠染色體中進行準確的切出和轉(zhuǎn)座，切出和插入時都需要轉(zhuǎn)座酶的作用，并發(fā)生在特征性(TTAA)核苷酸序列目標位點M。本發(fā)明采用PB轉(zhuǎn)座子載體進行外源基因的克隆，與另一表達PB轉(zhuǎn)座酶的載體共注射小鼠受精卵的雄性原核中，實行外源基因(EGFP-miR-505)在小鼠基因組上的插入，通過鑒定子代小鼠基因組中外源基因的存在與否，得到在神經(jīng)元中特異表達miR-505的轉(zhuǎn)基因首建鼠。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法，該方法可與表達轉(zhuǎn)座酶的輔助載體共注射小鼠的受精卵的雄性原核，得到轉(zhuǎn)基因小鼠，用以研究miR-505在神經(jīng)系統(tǒng)特別是在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的包括調(diào)控性發(fā)育啟動在內(nèi)的生物學(xué)功能，并且EGFP蛋白能方便地顯示外源基因在神經(jīng)系統(tǒng)中的定位。
[0006]本發(fā)明的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法，包括:
[0007](I)以pcDNA6.2-EGFP_miR505為模板，進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物進行回收、用SphI 和 HindIII 雙酶切、純化回收，得到 EGFP-mir-505/SphI+HindIII 片段；
[0008](2) pUC-19用SmaI和BamHI進行雙酶切，得到線性載體片段pUC19/BamHI SmaI ；pAAV-GPAP載體用MluI酶切后，以Klenow酶補平，然后以BamHI酶切，電泳分離酶切片段，回收GFAP啟動子片段，與pUC19/BamHI SmaI連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的瓊脂糖平板上篩選陽性克隆，得到PUC19-GFAP載體；
[0009](3)pUC19-GFAP 用 SphI 和 HindIII 雙酶切后，與(I)中得到的 EGFP-mir-505/Sphl+HindHI片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到目的片段pUC19-GFAP-EGFP-mir-505 ；
[0010](4) PB[Act-RFP]DS載體用BamHI酶切，并用Klenow酶補平粘性末端后，以HindIII酶切，電泳分離回收得到PB載體片段；pUC19-GFAP-EGFP-mir_505以EcoRI酶切，并用Klenow酶補平粘性末端后，以HindIII酶切，電泳分離回收目的基因片段，與上述PB載體片段連接，得到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體PB[GFAP-EGFP-mir-505]。[0011 ] 所述步驟(1)中PCR擴增所用引物為:
[0012]上游弓I 物 GCGCATGCCTAGAGAACCCACTGCTTAC ；
[0013]下游引物GCAAGCTTGCTATGGCAGGGCCTGCCG。[0014]所述步驟(1)中PCR反應(yīng)體系為:GTbuffer 1.5 μ 1，2.5mM dNTPl.5 μ 1，上下游引物 1.5 μ 1，BSA0.2μ l，Taq0.2μ 1，原液 0.1 μ 1，H2OlO μ I ;PCR 反應(yīng)條件為:93°C lmin30s ；93°C 30s, 57°C 30s, 65°C 2min，40 個循環(huán)；65°C IOmin0
[0015]所述步驟(1)中雙酶切反應(yīng)體系為:SphIly1，HindIIIly 1，10*M buffer5y I,PCR 產(chǎn)物 15 μ 1，Η2028 μ I。
[0016]所述步驟(2)中SmaI酶切反應(yīng)體系為:SmaI2 μ 1，10*T buffer4y I,
0.1%BSA4 μ I，質(zhì)粒 5 μ 1，Η2035 μ I ；BamHI 酶切反應(yīng)體系為:BamHI2y 1，10*K buffer4 μ 1，質(zhì)粒 7.7μ I, Η2036.3 μ I。
[0017]所述步驟(2)中MluI酶切反應(yīng)體系為:Μ1ιιΙ2μ 1，10*Η buffer5 μ 1，質(zhì)粒4 μ 1，Η2040 μ I ;補平產(chǎn)物 BamHI 酶切反應(yīng)體系為:BamHI2 μ I，10*K buffer5 μ I，GFAP5 μ I，Η2038 μ I。
[0018]有益.效果
[0019]本發(fā)明采用PB轉(zhuǎn)座子載體構(gòu)建該表達載體，可與表達轉(zhuǎn)座酶的輔助載體共注射小鼠的受精卵的雄性原核，得到轉(zhuǎn)基因小鼠，用以研究miR-505在神經(jīng)系統(tǒng)特別是在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的包括調(diào)控性發(fā)育啟動在內(nèi)的生物學(xué)功能，并且EGFP蛋白能方便地顯示外源基因在神經(jīng)系統(tǒng)中的定位，由于轉(zhuǎn)座子插入的采用一剪切-黏貼Il方式，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠相比，插入位點更易識別，拷貝數(shù)更易被檢測，而且對染色體的損傷更小，因此遺傳特性更加穩(wěn)定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1A-C為本發(fā)明載體的制備流程圖；
[0021]圖2 為 pcDNA6.2-EGFP_miR505PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖；
[0022]圖3為pUC19雙酶切電泳檢測圖；
[0023]圖4為PAAV-GFAP MIuI單酶切電泳檢測圖；
[0024]圖5為PGFAP啟動子片段電泳檢測圖；
[0025]圖6為pUC19-GFAP載體PCR檢測結(jié)果；
[0026]圖7 為 PB [GFAP-EGFP-mir-505]電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0028]實施例1
[0029]I) EGFP-mir-505 基因的獲得
[0030]以pcDNA6.2-EGFP_miR505為模板，以下列一對引物進行PCR擴±曾，得到EGFP-mir-505基因，長度為1400bp左右，序列如SEQ ID NO:1所示。
[0031]Pegfp-miR-505forward:
[0032] GCGCATGCCTAGAGAACCCACTGCTTAC[0033]Pegfp-miR-505reverse:
[0034]GCAAGCTTGCTATGGCAGGGCCTGCCG
[0035]體系:(15ul)
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法,包括: (1)以pcDNA6.2-EGFP-miR505為模板，進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物進行回收、用SphI和HindIII 雙酶切、純化回收，得到 EGFP-mir-505/SphI+HindIII 片段； (2 ) pUC-19用SmaI和BamHI進行雙酶切，得到線性載體片段pUC19/BamHI SmaI ；pAAV-GPAP載體用MluI酶切后，以Klenow酶補平，然后以BamHI酶切，電泳分離酶切片段，回收GFAP啟動子片段，與pUC19/BamHI SmaI連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的瓊脂糖平板上篩選陽性克隆，得到PUC19-GFAP載體； (3)pUC19-GFAP用 SphI 和 HindIII 雙酶切后，與(I)中得到的 EGFP-mir-505/Sphl+HindHI片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到目的片段pUC19-GFAP-EGFP-mir-505 ； (4)PB[Act-RFP]DS載體用BamHI酶切，并用Klenow酶補平粘性末端后，以HindIII酶切，電泳分離回收得到PB載體片段；pUC19-GFAP-EGFP-mir-505以EcoRI酶切，并用Klenow酶補平粘性末端后，以HindIII酶切，電泳分離回收目的基因片段，與上述PB載體片段連接，得到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體PB[GFAP-EGFP-mir-505]。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中PCR擴增所用引物為: 上游引物 GCGCATGCCTAGAGAACCCACTGCTTAC ； 下游引物 GCAAGCTTGCTATGGCAGGGCCTGCCG。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中PCR反應(yīng)體系為=GTbufferl.5 μ 1,2.5mM dNTPl.5μ I,上下游引物 1.5 μ 1，BSA0.2μ 1，Taq0.2μ 1，原液 0.1 μ 1，H2OlO μ I ;PCR 反應(yīng)條件為:93°C lmin30s ；93°C 30s, 57°C 30s, 65°C 2min，40 個循環(huán)；65°C IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中雙酶切反應(yīng)體系為=SphIly 1，HindIIIly 1，10*Mbuffer5 μ I, PCR 產(chǎn)物 15 μ I，Η2028 μ I。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中SmaI酶切反應(yīng)體系為:SmaI2 μ 1，10*T buffer4y I,0.1%BSA4 μ I，質(zhì)粒 5 μ 1，Η2035 μ I ；BamHI 酶切反應(yīng)體系為:BamHI2y 1，10*K buffer4 μ 1，質(zhì)粒 7.7μ I, Η2036.3 μ I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達miR-505的載體的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中MluI酶切反應(yīng)體系為:MluI2y 1，10*H buffer5y 1，質(zhì)粒4 μ 1，Η2040μ I ;補平產(chǎn)物BamHI 酶切反應(yīng)體系為:BamHI2y 1，10*K buffer5 μ l,GFAP5y 1，H2038μ I。
【文檔編號】C12N15/66GK103937826SQ201410136599
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】周宇荀, 仝莉, 李曉寧, 肖君華, 李凱 申請人:東華大學(xué)