用于檢測等位基因cyp2c19*2的引物組合及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測等位基因CYP2C19*2的引物組合，所述引物組合包括上游引物p1、下游引物p2、基因延伸引物p3和p4，序列分別如Seq?ID?No.1-4所示。本發(fā)明還提供含有所述引物組合的檢測等位基因CYP2C19*2的試劑盒。本發(fā)明基于特異引物延伸和高分辨率熔解曲線的設計思路，可以在不進行特殊擴增后處理的前提下直接進行基因分型。本方法利用熒光染料識別延伸產(chǎn)物進行基因分型，無需使用特殊標記的探針，方法簡單，成本低廉，易于在臨床中推廣。
【專利說明】用于檢測等位基因CYP2C19*2的引物組合及檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及一種用于檢測等位基因CYP2C19*2的引物組合及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]CYP2C19基因存在多種等位基因，包括*1、*2、*3……*17等。其中，具有正常酶活性的等位基因是CYP2C19*1，而CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因編碼的酶無活性。由CYP2C19*2和CYP2C19*3導致的藥物慢代謝占東方人慢代謝的99%，因此CYP2C19*2和CYP2C19*3的檢測技術日益受到重視。患者如果為*1/*1則屬于快代謝型；如果為*1/*2或*1/*3則屬于中代謝型；如果為*2*2或*2/*3或*3/*3則屬于慢代謝型。通過檢測CYP2C19的G681A變異可以鑒定CYP2C19*2等位基因，通過檢測CYP2C19的G636A變異可以鑒定CYP2C19*3等位基因。[0003]CYP2C19基因型與個體化用藥:
[0004]1)CYP2CI9基因型與氯吡格雷抵抗:氯吡格雷(波立維)是目前世界范圍內使用最廣泛的噻吩吡啶類抗血小板藥，用于急性冠脈綜合征、冠脈支架術和冠心病的一級、二級預防，可以減少心血管疾病患者心臟病發(fā)作、卒中以及死亡的風險。氯吡格雷是一種前體藥物，在體外無活性，口服后必須在體內經(jīng)肝臟細胞色素P450代謝為有效活性產(chǎn)物才能發(fā)揮其抗血小板聚集的作用。美國FDA發(fā)布警告稱，藥師可以通過檢測CYP2C19的基因型來了解患者波立維的代謝能力，對于波立維慢代謝者可以增加藥量或者選用其它抗凝血藥物。
[0005]2) CYP2C19基因型與苯妥英血藥濃度關系:苯妥英(phenytoin，PHT)是臨床上常用的抗癲癇藥物，具有親脂性，進入人體后經(jīng)I相反應進行生物轉化后，由腎臟和肝臟排出體外。苯妥英代謝受CYP2C9和CYP2C19基因調控。研究結果顯示，CYP2C19*2和CYP2C19*3與苯妥英的代謝缺陷關系密切，是苯妥英的關鍵代謝酶。檢測CYP2C19基因型能夠指導苯妥英服用劑量。
[0006]3)CYP2C19基因型與奧美拉唑臨床療效相關性:質子泵抑制藥(PPIs)體內主要經(jīng)CYP2C19代謝，其次是CYP3A4代謝。通過對CYP2C19基因型與奧美拉唑臨床療效的研究發(fā)現(xiàn)，奧美拉唑合用阿莫西林等抗生素治療幽門螺旋桿菌感染性消化道潰瘍患者，慢代謝和中間代謝患者愈合率明顯高于快代謝患者。
[0007]4) CYP2C19基因型與伏立康唑:伏立康唑是一種廣譜的三唑類抗真菌藥，與目前國內市場上的抗真菌藥相比，具有高效低毒的特點。伏立康唑通過細胞色素P450同工酶代謝，包括CYP2C19、CYP2C9和CYP3A4。這些酶的抑制劑或誘導劑可以分別增高或降低伏立康唑的血液濃度。伏立康唑進入人體后，快代謝患者與慢代謝患者血液濃度差異顯著，慢代謝患者使用常規(guī)劑量可能出現(xiàn)毒副反應，此時應考慮減小劑量；快代謝和中間代謝患者應考慮給予常規(guī)劑量，根據(jù)療效小幅增、減劑量；給予常規(guī)劑量，若快代謝患者出現(xiàn)毒副反應或慢代謝患者療效不佳時，均應考慮換藥。
[0008]G681A位點上、下游序列特征分析:[0009]AATTACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCG/AGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAGAAG
[0010]G681A位點上、下游序列如上所述。其中下劃線表示G681A位點。而粗體表示另一個SNP位點。由于該SNP位點緊鄰G681A位點，造成G681A位點基因分型的困難。
[0011]目前已建立了多種G681A基因分型的方法，分述如下:
[0012]1、直接測序法:該方法是基因分型的金標準。但是該方法涉及基因特異擴增和測序反應兩個步驟。不但成本高，耗時長，而且由于需要進行擴增后的處理，容易造成樣本的污染。不適合在臨床開展。
[0013]2、焦磷酸測序法:該方法同樣是基因分型的金標準，與直接測序法具有相同的缺點。
[0014]3、高分辨率熔解曲線法:該方法涉及基因特異擴增和高分辨率熔解曲線分析兩個步驟。其中高分辨率熔解曲線分析可以在不進行任何樣本處理的前提下直接進行，因此方法簡單，便宜，易于在臨床推廣。但由于G681A緊鄰另一個SNP位點，對于約3%。的受試者會產(chǎn)生誤診。而且，普通的高分辨率熔解曲線方法不含有特異針對G681A位點的延伸引物或探針，其檢測出的突變可能是針對擴增區(qū)段中任意位點。因此，特異性遠遜于測序方法。 [0015]4、PCR-LDR法:該方法涉及基因特異擴增和連接酶檢測反應兩個步驟，成本高，耗時長，而且由于需要擴增后的特殊處理，容易造成樣本的污染。
[0016]5、固相芯片法:該方法涉及基因特異擴增、雜交、檢測等多個步驟，成本高，耗時長，而且擴增后的處理比較復雜，容易造成樣本的污染。此外，該方法同樣無法避免對于少量樣本的誤診。
[0017]6、等位基因特異擴增法:該方法使用3’端終止于G681A位點的基因特異引物進行擴增，檢測擴增產(chǎn)物的熒光信號，判定SNP位點的基因型。該方法操作簡單，無需擴增后處理，適合在臨床推廣。該方法的缺點是由于基因特異引物必須終止于G681A位點，從而造成引物設計無法最優(yōu)化，導致擴增效率受到影響。因此，在樣本DNA量較少或質量不高的情況下，很可能會導致擴增和分型的失敗。該方法的另一個缺點是需要使用特殊標記的探針，從而提聞了成本。

【發(fā)明內容】

[0018]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測等位基因CYP2C19*2的引物組合及檢測試劑盒。
[0019]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于檢測等位基因CYP2C19*2的引物組合，所述引物組合包括:
[0020]上游引物p1:5’-GCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCC-3’，也可依照 CYP2C19 基因的喊基序列，在上述喊基序列的基礎上增加或減少若干喊基；也可依照CYP2C19基因的堿基序列，在上述堿基序列的上游或下游重新設計其他序列；
[0021 ]下游引物 p2:5’ -AGTCCCGAGGGTTGTTGATGTCCATCGA-3，，也可依照 CYP2C19 基因的喊基序列，在上述喊基序列的基礎上增加或減少若干喊基；也可依照CYP2C19基因的喊基序列，在上述堿基序列的上游或下游重新設計其他序列；
[0022]基因延伸引物p3:5’-TTTGTTATGGGTTCCC-3’，也可依照CYP2C19基因的堿基序列，在上述喊基序列的基礎上增加或減少若干喊基；
[0023]基因延伸引物p4:5’-TTTGTTATGGGTTCCT-3’，也可依照CYP2C19基因的堿基序列，在上述喊基序列的基礎上增加或減少若干喊基。
[0024]所述基因延伸引物p3和p4的3’端帶有修飾，所述修飾包括但不限于硫代修飾、C3封閉、磷酸修飾等。
[0025]本發(fā)明還提供含有所述引物組合的檢測等位基因CYP2C19*2的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、高保真DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液、熒光染料等中的至少一種。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0026]前述的試劑盒，所述高保真DNA聚合酶包括但不限于DNA聚合酶pfu、phusion、phanta、KocU Vent 等。
[0027]前述的試劑盒，所述突光染料包括但不限于染料LC green、Evagreen、Sybr green
T坐丄 O
[0028]由于G681A位點存在三種可能的基因型:GG、AG、AA。本發(fā)明通過2個不同的反應對其進行檢測。G反應檢測是否存在G等位基因，A反應檢測是否存在A等位基因。如果單獨G反應陽性則證明G681A位點為GG基因型。如果單獨A反應陽性則證明G681A位點為AA基因型。如果G和A反應同時陽性則證明G681A位點為AG基因型。
[0029]通過明確G681A以及G636A位點基因型即可明確受試者的藥物代謝類型?；蛐团c藥物代謝類型間的對應關系如表1所示。
[0030]表1基因型與藥物代謝類型間的對應關系
【權利要求】
1.用于檢測等位基因CYP2C19*2的引物組合，其特征在于，所述引物組合包括:
上游引物 Pl:5’ -GCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCC-3’ ；
下游引物 p2:5’ -AGTCCCGAGGGTTGTTGATGTCCATCGA-3’ ； 基因延伸引物 p3:5’ -TTTGTTATGGGTTCCC-3’ ； 基因延伸引物 p4:5’ -TTTGTTATGGGTTCCT-3’。
2.根據(jù)權利要求1所述的引物組合，其特征在于，基因延伸引物P3和p4的3’端帶有修飾，所述修飾包括但不限于硫代修飾、C3封閉、磷酸修飾。
3.含有權利要求1或2所述引物組合的檢測等位基因CYP2C19*2的試劑盒。
4.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、高保真DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液、熒光染料中的至少一種。
5.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
6.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶包括但不限于DNA 聚合酶 pfu、phusion、phanta、KocU Vent。
7.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光染料包括但不限于染料LCgreen、Eva green、Sybr green I。
【文檔編號】C12Q1/68GK103923988SQ201410136619
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權日:2014年4月4日
【發(fā)明者】宋競巖 申請人:宋競巖