一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌及其培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌及其培養(yǎng)方法，殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌NBIN-863Bacillus?thuringiensis?NBIN-863，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏日2013年11月29日、存活日期2013年11月29日，保藏中心編號CCTCC?NO：M2013612。培養(yǎng)方法，取安徽省九華山附近，東經117度29分,北緯30度39分的土壤，用無菌水懸浮，按梯濃度稀釋涂平板，用LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，稀釋劃線于LB平板上培養(yǎng)；單菌落接種到搖瓶中培養(yǎng)，與甘油混合，放冰箱保藏，單菌落轉接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，涂片、結晶紫染色光學顯微鏡觀察確定。
【專利說明】一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌及其培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌及其培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]據FAO保守估計，全世界每年因線蟲危害對糧食和纖維作物造成的損失大約為12%，對蔬菜、花生、煙草和某些果樹造成的損失要超過20%，甚至達到50%。據權威專家報道，植物寄生線蟲每年造成世界農業(yè)生產的損失約1500億美元。我國每年因線蟲造成的損失大約35億美元。
[0003]目前對植物有害的線蟲約有3000多種，而在我國發(fā)現的有40多種，其中對作物危害最嚴重的線蟲之一是根結線蟲。根結線蟲蟲體微小，生活在植物體內或土壤中，會隨著雨水、勞事操作及病株的轉移而轉移，防治極為困難。
[0004]防治植物寄生線蟲病害的主要方法有化學防治和生物防治?；瘜W藥劑大部分為劇毒藥物，嚴重污染環(huán)境。生物防治是利用線蟲的天敵來控制蟲口數量和限制線蟲引起的損失，且對人、動物和環(huán)境均相對安全，應用前景廣闊。生物防治中目前應用最廣泛的是蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt),此外還有穿刺巴氏桿菌(Psteuriapenetrans)、假單胞桿菌(Pseudomonas spp.)以及近年發(fā)現的堅強芽胞桿菌(Bacillus firmus)等。
[0005]早在1972年，Prasad等首先發(fā)現Bt β -外毒素對根結線蟲(Root_knotnematode, RKN)的卵和幼蟲有很高的活性。之后發(fā)現Bt β —外毒素對香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)、大豆胞囊線蟲和酸醬線蟲(Panagrellus redivivus)等線蟲具有很高的殺蟲活性(Ignoff et al., 1977;Devidas et al.，1988)。20 世紀 80 年代中期Bone等發(fā)現Bt庫斯塔克亞種(subsp.kurstaki)和以色列亞種(subsp.1sraelensis)對動物寄生線蟲蛇形毛圓線蟲(Trichostronglus colubriformis)的卵和幼蟲有很高的殺蟲活性，1988年美國Mycogen公司發(fā)現Bt晶體蛋白對根結線蟲屬(Meloidogynespp.)、矮化線蟲屬(Tylenchs spp.)、短體線蟲屬(Pratylenchus spp.)和滑刃線蟲屬(Aphlenchoides spp.)等植物。美國Mycogen公司篩選到很多對植物寄生線蟲有殺蟲活性的Bt菌株，同時也申請了專利。1993年我們初步篩選到9株對植物寄生線蟲有殺蟲活性的Bt菌株，這些Bt菌株對甘薯莖線蟲(Ditylenchus destructor)、北方根結線蟲(M.hapla)、和芒麻短體線蟲(P.scribneri)有很高殺蟲活性,其中已申請國家專利的菌株是 YBT-1532 (ZL00-1-16062.1)(余子全等，2007b)。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對上述現狀，旨在提供一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌及其培養(yǎng)方法。
[0007]本發(fā)明目的的實現方式為，一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌，蘇云金芽胞桿菌NBIN_863Bacillu s thuringiensis NBIN-863,保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學，保藏中心編號CCTCC NO:M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。
[0008]—種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌的培養(yǎng)方法，具體步驟如下:
[0009]I)取安徽省九華山附近，東經117度29分，北緯30度39分位置的土壤樣品lg，在實驗室用Iml無菌水懸浮，按照10_3、10_4、10_5、10_6濃度進行稀釋涂平板，用LB固體培養(yǎng)液28°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，從平板上挑取單菌落再次稀釋劃線于LB平板上，28°C條件下培養(yǎng)24h ；
[0010]LB固體培養(yǎng)液配方:蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g，瓊脂粉20g，溶于IL蒸餾水中，121°C,30min,濕熱滅菌；
[0011 ] 2 )將重復分離純化到的單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基搖瓶中，28 °C，200rpm,培養(yǎng) 36h,
[0012]所述LB液體培養(yǎng)基配方:蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g，溶于IL蒸餾水中，121°C,30min,濕熱滅菌；
[0013]3)先用去離子水配置甘油，121°C濕熱滅菌30min，水:甘油體積比=1:1 ；
[0014]4)將步驟2)培養(yǎng)了 36h后的500 μ I菌液與滅菌的500 μ 150%的甘油等體積混合，混勻后放于_80°C冰箱中保藏；
[0015]5)將從LB平板上分離純化到的單菌落轉接到LB液體培養(yǎng)液中，28°C，200rpm，培養(yǎng)48h后，進行涂片、固定、結晶紫染色后，在光學顯微鏡油鏡鏡頭下進行形態(tài)觀察為蘇云金芽胞桿菌菌株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863在液體LB培養(yǎng)基里生長48h后的顯微鏡檢測圖片；
[0017]圖2是殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863的進化樹分析圖；
[0018]圖3是殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863的沉淀SDS-PAGE凝膠電泳圖；
【具體實施方式】
[0019]殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863,保減單位:中國典型培養(yǎng)物保減中心，地址:中國，武漢，武漢大學，保減中心編號CCTCC NO:M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。
[0020]殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌菌株形態(tài):平板上生長的單菌落為乳白色雪花狀，表面粗糙，生長24h電鏡下觀察為桿狀，生長36h后為染不上色的芽胞和染上色的菱形晶體；生長48h后上清液廣生6種蛋白，其中3種為殺蟲晶體蛋白，分別是Cry9Aa蛋白(130kDa)、Cry2Aa蛋白(69kDa)及CrylAc蛋白(130kDa)(圖3)。蘇云金芽胞桿菌具有殺南方根結線蟲活性。 [0021]本 申請人:2012年5月10日從安徽省九華山附近，東經117度29分，北緯30度39分的位置采取土壤樣品lg，在實驗室用Iml無菌水懸浮，按照ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6濃度進行稀釋涂平板，用LB固體培養(yǎng)液(蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g，瓊脂粉20g，溶于IL蒸餾水中，121°C，30min，濕熱滅菌)，28°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，從平板上挑取單菌落再次稀釋劃線于LB平板上，28°C條件下培養(yǎng)24h。將重復分離純化到的單菌落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基搖瓶中，28°C，200rpm，培養(yǎng)36h。先用去離子水配置50%的甘油(水:甘油體積比=1:1，121 °C濕熱滅菌30min)，將培養(yǎng)了 36h后的500 μ I菌液與滅菌的500 μ 150%的甘油等體積混合，混勻后放于_80°C冰箱中保藏。將從LB平板上分離純化到的單菌落轉接到LB液體培養(yǎng)液中，28°C，200rpm,培養(yǎng)48h后，進行涂片、固定、結晶紫染色后，在光學顯微鏡油鏡鏡頭下進行形態(tài)觀察，顯微鏡檢測圖片如圖1所示，證實為蘇云金芽胞桿菌菌株。
[0022]利用分離殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌菌株獲取16S rRNA基因，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，具體實施過程:Bacillus thuringiensis NBIN-863菌株過夜活化培養(yǎng)，1% (V/V)接種量接種至新鮮LB培養(yǎng)基(Sambrook et al.，1989)，培養(yǎng)至OD600=0.6，離心收集細胞，按照賽百盛樹脂型?基因組DNA提純試劑盒操作方法提取基因組DNA。以該基因組DNA 為模板，采用細菌 16S rRNA 通用引物(16S_27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ;16S_1429R:GGTTACCTTGTTACGACTT )進行PCR擴增。PCR反應體系為(25 μ I): 10 X擴增緩沖液(含Mg2+L 5mM) 2.5 μ 1，dNTPl μ 1，引物各 I μ 1，模板 DNAl μ 1，Taq DNA 聚合酶 0.2 μ 1，加去離子水補足至25 μ I ;PCR擴增條件:94°C預變性2min，94°C變性30s，55°C退火lmin，72°C延伸1.5min，25個循環(huán)，72°C延伸5min。PCR擴增的16S rDNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用DNA純化試劑盒按照操作說明進行純化，并克隆到PMD19-T載體上，轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，選取陽性克隆，在上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。
[0023]將測序獲得的16S rDNA序列在GenBank中進行BLAST比對分析，選取同源性相近的芽胞桿菌16S rDNA序列，利用Clustal X v2.0和MEGA5.1軟件進行比對分析并構建圖2所示的系統(tǒng)進化樹。
[0024]序列表中是分離殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌菌株16S rDNA序列，系統(tǒng)進化樹顯示NBIN-863與Bacillus thuringiensis L15親緣關系較近，序列同源性為100%，形成一個簇群，表明從安徽省九華山附近土壤中分離到的菌株屬于種Bacillusthuringiensis,進一步命名為Bacillus thuringiensis NBIN-863,提交到GenBank數據庫中獲得的登錄號為KF935650。
[0025]對南方根結線蟲二齡幼蟲進行生物測定，結果顯示Bacillus thuringiensisNBIN-863菌株對南方根結線蟲二齡幼蟲有很高的毒力，處理24h后，南方根結線蟲死亡率達到了 80%以上。發(fā)酵液對根結線蟲的LC50值為0.1 μ g/ml，上清液LC50值為0.6 μ g/ml，沉淀LC50值為1.17 μ g/ml，如表格I所示。
[0026]表格I菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863對南方根結線蟲二齡幼蟲的LC50
值
[0027]
【權利要求】
1.一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌，其特征在于殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌NBIN_863Bacillus thuringiensis NBIN-863,保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學，保藏中心編號CCTCC NO:M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。
2.根據權利要求1所述的一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌，其特征在于殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌菌株形態(tài):平板上生長的單菌落為乳白色雪花狀，表面粗糙，生長24h電鏡下觀察為桿狀,生長36h后為染不上色的芽胞和染上色的菱形晶體；生長48h后上清液產生6種蛋白，其中3種為殺蟲晶體蛋白，分別是Cry9Aa-like蛋白(98kDa)、Cry2Aa蛋白(69kDa)及 CrylAc 蛋白(130kDa)。
3.根據權利要求1所述的一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌，其特征在于具有殺南方根結線蟲活性。
4.培養(yǎng)權利要求1所述的一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌的方法，其特征在于具體步驟如下: 1)取安徽省九華山附近，東經117度29分，北緯30度39分位置的土壤樣品lg，在實驗室用Iml無菌水懸浮，按照10_3、10_4、10_5、10_6濃度進行稀釋涂平板，用LB固體培養(yǎng)液28°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，從平板上挑取單菌落再次稀釋劃線于LB平板上，28°C條件下培養(yǎng)24h ； LB固體培養(yǎng)液配方:蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉IOg,瓊脂粉20g,溶于IL蒸懼水中，121°C,30min,濕熱滅菌； 2)將重復分離純化到 的單菌落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基搖瓶中，28°C，200rpm，培養(yǎng)36h, 所述LB液體培養(yǎng)基配方:蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g，溶于IL蒸餾水中，121°C，30min,濕熱滅菌； 3)先用去離子水配置甘油，121°C濕熱滅菌30min，水:甘油體積比=1:1； 4)將步驟2)培養(yǎng)了36h后的500 μ I菌液與滅菌的500 μ 150%的甘油等體積混合，混勻后放于_80°C冰箱中保藏； 5)將從LB平板上分離純化到的單菌落轉接到LB液體培養(yǎng)液中，28°C，200rpm，培養(yǎng)48h后，進行涂片、固定、結晶紫染色后，在光學顯微鏡油鏡鏡頭下進行形態(tài)觀察為蘇云金芽胞桿菌菌株。
【文檔編號】C12R1/07GK103898025SQ201410137036
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權日:2014年4月4日
【發(fā)明者】劉曉艷, 黃大野, 楊自文, 閔勇, 王開梅, 萬中義, 曹春霞, 周榮華, 江愛兵 申請人:湖北省生物農藥工程研究中心