一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系，屬于動(dòng)物細(xì)胞（組織）工程領(lǐng)域。該大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞來(lái)源于正常成年大鼠胰島組織，體外培養(yǎng)能克隆性生長(zhǎng)，且具有多分化潛能，具體為細(xì)胞貼壁培養(yǎng)呈多角形上皮樣，細(xì)胞核為橢圓形，核仁多為單核仁或雙核仁；細(xì)胞克隆性生長(zhǎng)，細(xì)胞接種第1d生長(zhǎng)緩慢，第2～4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5～6d為平臺(tái)期，第7d增殖能力下降；是正常的二倍體細(xì)胞，染色體數(shù)目2n=42；在蛋白水平表達(dá)八聚體轉(zhuǎn)錄因子4、配對(duì)基因盒4、配對(duì)基因盒6、神經(jīng)源性因子3和巢蛋白；具有多分化潛能，體外定向誘導(dǎo)，分化形成神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞；無(wú)致瘤性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物胰島干細(xì)胞系及其特征，特別涉及一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系及其形態(tài)、生長(zhǎng)、表達(dá)和分化等特征，屬于動(dòng)物細(xì)胞(組織)工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】[0002]糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是危害人類(lèi)健康的重大疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)目前全世界糖尿病患者已達(dá)3.46億(Am J Stem Cells.2012，I (3): 196-204.)，而傳統(tǒng)的藥物及胰島素替代療法卻不能從根本上醫(yī)治該病。近十年來(lái)，隨著移植技術(shù)的發(fā)展，胰島移植治療糖尿病取得了一定的療效(N Engl J Med 2000，343 (4):230-238.Diabetes.2005, 54(7):2060-2069.Am J Transplant.2008, 8(11):2463-2470.1mmuneNetw.2013, 13(6):235-239.)。但是，由于供體來(lái)源短缺，胰島移植治療糖尿病技術(shù)的應(yīng)用受到制約。胰島干細(xì)胞是存在于胰腺內(nèi)分泌組織胰島中的成體干細(xì)胞，能自我更新并具有多分化潛能。體外分離克隆胰島干細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化形成功能性胰島，并移植治療糖尿病是有效解決供體短缺的途徑之一。目前，建立胰島干細(xì)胞系，研究胰島干細(xì)胞分化形成功能性胰島移植治療糖尿病已成為焦點(diǎn)。國(guó)外，Zulewski等(Diabetes.2001，50 (3): 521-533.Endocrinology.2002，143(8):3152-3161.StemCells.2004，22(7):1134-1141.)首先報(bào)道膠原酶消化大鼠或成人胰腺組織分離獲得單個(gè)細(xì)胞和胰島，RPMI1640培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)，96h后，挑出懸浮胰島，培養(yǎng)液中再添加20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF貼壁培養(yǎng)，上皮樣胰島干細(xì)胞克隆性生長(zhǎng)。其中，大鼠胰島干細(xì)胞8.5個(gè)月擴(kuò)增了 10倍，人胰島干細(xì)胞8個(gè)月擴(kuò)增了 7倍。免疫化學(xué)反應(yīng)顯示胰島干細(xì)胞表達(dá)巢蛋白(nestin),不表達(dá)insulin、glucagon、somatostatin和CK19。體外定向誘導(dǎo),胰島干細(xì)胞分化形成胰腺導(dǎo)管細(xì)胞,表達(dá)CK19 ;分化形成胰島細(xì)胞，表達(dá)insulin、glucagon等；分化形成肝臟細(xì)胞,表達(dá)α -甲胎蛋白；分化形成神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性粘附分子。移植在小鼠肝臟內(nèi)，人源性胰島干細(xì)胞分化形成人肝臟細(xì)胞。Maria-Engler 等(J Endocrinol.2004, 183(3): 455-467.)膠原酶 HI灌注消化成人胰腺主胰管，分離獲得細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)，密度梯度離心，雙硫腙(dithizon，DTZ)活性染色檢測(cè)，篩選出直徑大于150 μ m胰島，CMRL1066+10%FCS培養(yǎng)。共聚焦熒光顯微觀(guān)察和RT-PCR檢測(cè)，培養(yǎng)24h，胰島細(xì)胞團(tuán)中僅有少量細(xì)胞表達(dá)nestin ;培養(yǎng)60d，nestin+表達(dá)量顯著增多。采用含10%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)nestin+細(xì)胞30d，表達(dá)insulin ;而采用含1%FBS 培養(yǎng)液培養(yǎng) nestin+ 細(xì)胞 30d,則表達(dá) insulin、glucagon 和 somatostatin。因此，作者認(rèn)為體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，人胰島中的nestin+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。Humphrey等(Diabetes.2003，52(10):2519-2525.)膠原酶消化人胎兒早期胰腺組織獲得胰島細(xì)胞團(tuán)，貼壁培養(yǎng)，上皮樣細(xì)胞擴(kuò)增形成單層。構(gòu)建nestin-GFP質(zhì)粒,腺病毒轉(zhuǎn)染,418篩選,純化出nestin+細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)nestin+細(xì)胞共表達(dá)波形蛋白。采用煙酰胺、HGF等體外定向誘導(dǎo)，nestin+細(xì)胞卻不能分化形成表達(dá)Pdxl、insulin的β細(xì)胞，移植在無(wú)胸腺小鼠體內(nèi)也不能分化形成功能性β細(xì)胞,分泌insulin。這表明nestin不是β細(xì)胞祖細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。Sugiyama 等(Proc Natl Acad Sci USA.2007, 104 (I): 175-180.)膜蛋白酶消化小鼠胎兒胰腺組織，分離獲得單個(gè)細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)分選，獲得共表達(dá)Ngn3、⑶133和⑶45f的胰島干細(xì)胞。體外定向誘導(dǎo)，胰島干細(xì)胞分化形成β細(xì)胞,分泌insulin。Ta等(StemCells.2006, 24(7): 1738-1749.)的研究表明在培養(yǎng)液中添加成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblast growth facter, bFGF)、白細(xì)胞抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 (bone morphogenetic protein-4, BMP4),均能促進(jìn)成年小鼠胰島干細(xì)胞擴(kuò)增。Jin 等(Proc Natl Acad Sci USA.2013, 110(10):3907- 3912.)膠原酶B+DNase消化液消化成年小鼠胰腺組織獲得單個(gè)細(xì)胞，CD 133標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)分選，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，3w后，細(xì)胞克隆形成細(xì)胞團(tuán)，RT-PCR檢測(cè)克隆細(xì)胞表達(dá)CD133。培養(yǎng)液中添加RSP01定向誘導(dǎo)，⑶133+細(xì)胞分化形成表達(dá)Ngn3的胰島干細(xì)胞和腺泡細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分選出Ngn3+胰島干細(xì)胞，體外定向誘導(dǎo)，分化形成β細(xì)胞。葡萄糖刺激，分泌insulin。國(guó)內(nèi)，效梅等(中國(guó)科學(xué)C輯:生命科學(xué).2008，38 (8): 699-707.Science inChina Series C:Life Science.2008，51 (9):779-788.分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào).2008.41 (6):450-457.分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào).2008, 41 (6): 457-464.解剖學(xué)報(bào).2009, 40 (2): 55-58.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào).2009, 29 (2): 191-195.)報(bào)道IV型膠原酶消化人胎兒胰腺組織，收集單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)，低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)原代上皮樣胰腺干細(xì)胞長(zhǎng)出后，0.25%胰蛋白酶消化液消化，傳代。克隆環(huán)篩選出單克隆人胰腺干細(xì)胞，培養(yǎng)液中添加10ng/mLEGF擴(kuò)增培養(yǎng)，建立人胎兒胰腺干細(xì)胞系。免疫化學(xué)反應(yīng)和RT-PCR檢測(cè)該干細(xì)胞表達(dá)Pdxl、glucagon、nestin及CK19蛋白，不表達(dá)insulin、CD34、CD44及CD45。β -巰基乙醇誘導(dǎo)，分化形成神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NF蛋白。煙酰胺誘導(dǎo)，分化形成DTZ染色陽(yáng)性，分泌insulin和C肽的功能性類(lèi)胰島。將誘導(dǎo)類(lèi)胰島移植在STZ制備的糖尿病大鼠腎囊內(nèi)，能降低糖尿病大鼠血糖水平，延長(zhǎng)壽命。閻志風(fēng)等(中國(guó)組織工程研究與臨床.2008，12(3): 485-489.)無(wú)菌取人胎兒胰腺組織，V型膠原酶消化，分離得到胰島樣細(xì)胞團(tuán)。挑出懸浮胰島樣細(xì)胞團(tuán)貼壁培養(yǎng)，上皮樣干細(xì)胞克隆性生長(zhǎng)至單層， 傳代。生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示人胎兒胰島上皮樣干細(xì)胞傳代第3d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6d進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈” S”形。熒光免疫反應(yīng)檢測(cè)原代上皮樣干細(xì)胞表達(dá)PCNA、Pdxl、nestin、CK19、insulin、glucagon和Q)29,傳代后，干細(xì)胞則不表達(dá)insulin、glucagon和CD29。白日星等(中國(guó)普通外科雜志.2004，13(10):746-749)膠原酶消化新生大鼠胰腺組織，組織碎片采用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)36h，nestin+細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。添加bFGF、EGF、N2, nestin+細(xì)胞快速增長(zhǎng)。培養(yǎng)18~24d，nestin+細(xì)胞分化形成類(lèi)胰島樣細(xì)胞團(tuán)，胰島素釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，分泌insulin。馮若鵬等(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué).2007, (3).582-587.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011.19(1): 9-17.)膠原酶消化胎豬胰腺組織分離獲得胰島，貼壁培養(yǎng)，胰島干細(xì)胞快速增殖，傳18代，建系。免疫化學(xué)反應(yīng)顯示胰島干細(xì)胞表達(dá)CK19和a-actin,不表達(dá)nestin。無(wú)血清誘導(dǎo)，2w后,胰島干細(xì)胞分化形成DTZ染色陽(yáng)性的胰島樣細(xì)胞團(tuán)，表達(dá)insulin和Glut2等胰島素分泌細(xì)胞功能相關(guān)的蛋白。葡萄糖刺激，分泌insulin和C-肽。將誘導(dǎo)細(xì)胞移植到糖尿病裸鼠腹腔內(nèi)，可緩解其高血糖狀況。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)建立大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系的報(bào)道。本發(fā)明一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系及其特征，將為研究人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物胰島干細(xì)胞提供依據(jù)，這對(duì)于進(jìn)一步研究人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物胰腺發(fā)育、糖尿病的產(chǎn)生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系及其特征，為研究人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物胰島干細(xì)胞系提供依據(jù)，這對(duì)于進(jìn)一步研究人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物胰腺發(fā)育、糖尿病的產(chǎn)生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。
[0004]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系，保藏號(hào)為C201460，保藏日期2014年4月2日，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0005]包括如下特征:
1.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞形態(tài)特征 H.E染色，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞完全貼壁后，呈多角形上皮樣(圖1) ；Giemsa染色，細(xì)胞核為橢圓形，核仁多為單核仁或雙核仁(圖2)；
2.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞生長(zhǎng)特性
大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞克隆性生長(zhǎng)；生長(zhǎng)曲線(xiàn)表明細(xì)胞接種第Id生長(zhǎng)緩慢，第2~4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5~6d為平臺(tái)期，第7d增殖能力下降(圖3)；
3.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞染色體數(shù)目
染色體標(biāo)本顯示大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞是正常的二倍體細(xì)胞，染色體數(shù)目2n=42 (圖
4)；
4.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞表達(dá)特征
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和熒光免疫化學(xué)反應(yīng)顯示大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)八聚體轉(zhuǎn)錄因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,圖 5)、配對(duì)基因盒 4 (Paired box 4, Pax4,圖 6)、配對(duì)基因盒 6 (Paired box 6, Pax6,圖 7)、神經(jīng)源性因子 3 (Neurogenin 3, Ngn3,圖 9)和巢蛋白(nestin,圖 10),不表達(dá) Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin和secretin ;圖8是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陰性對(duì)照，圖11是突光免疫化學(xué)反應(yīng)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞陰性對(duì)照；
5.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞分化潛能
大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞具有多分化潛能，體外定向誘導(dǎo)，分化形成神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞；
5.1分化形成神經(jīng)細(xì)胞:采用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液體外定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6d，約有50%大鼠胰島多角形上皮樣干細(xì)胞分化形成有突觸的神經(jīng)細(xì)胞(圖12)，熒光免疫化學(xué)反應(yīng)表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(圖13);
5.2分化形成脂肪細(xì)胞:采用DMEM+10%NBS+lumol/L地塞米松+lug/Linsulin+
0.5mmol/LIBMX誘導(dǎo)液體外定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)7d，大鼠胰島多角形上皮樣干細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小而少的脂滴；14d，細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，大小均勻；21d，約80%多角形上皮樣干細(xì)胞變?yōu)閳A形細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)脂滴繼續(xù)增多，大小不一；27d，圓形細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多、增大，油紅O染色陽(yáng)性(圖 14)；
5.3分化形成成骨細(xì)胞:采用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+10mmol/L β -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導(dǎo)液體外定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)7d，約30%大鼠胰島多角形上皮樣干細(xì)胞出現(xiàn)皺縮；14d，皺縮細(xì)胞增至50%，部分細(xì)胞死亡；21d，細(xì)胞分泌增多，開(kāi)始出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)；28d，礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色陽(yáng)性(圖15)，Vonkossa染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色(圖16)；
6.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞致瘤性
大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞無(wú)致瘤性；大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞接種在裸鼠背部皮下30d，剖解，眼觀(guān)未見(jiàn)瘤狀物。
[0006]7.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞傳代培養(yǎng)
大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞按I X IO6個(gè)/mL細(xì)胞密度培養(yǎng)，干細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，
0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化傳代，收集的細(xì)胞接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)；該例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系已傳50代；
8.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞冷凍保存
冷凍:80%DMEM+10%DMS0+10%NBS細(xì)胞冷凍液稀釋大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞至I X IO6個(gè)/mL，分裝于冷凍管；4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長(zhǎng)期冷凍保存；
解凍:從液氮罐中取出大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)；臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞解凍成活率約為93%。
本發(fā)明的有益效果 是:提供一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系及其特征，將為研究人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物胰島干細(xì)胞提供依據(jù)，這對(duì)于進(jìn)一步研究人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物胰腺發(fā)育、糖尿病的產(chǎn)生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0007]本說(shuō)明書(shū)共有16幅附圖，其中:
圖1大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞H.E染色形態(tài)特征(X 200);
圖2大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞Giemsa染色形態(tài)特征(X 400)；
圖3大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)；
圖4大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞染色體數(shù)目2n=42 ；
圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞表達(dá)0ct4 ；
圖6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞表達(dá)Pax4 ；
圖7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞表達(dá)Pax6 ；
圖8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陰性對(duì)照；
圖9熒光免疫化學(xué)反應(yīng)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞表達(dá)Ngn3 (X400)；
圖10熒光免疫化學(xué)反應(yīng)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞表達(dá)nestin (X400)；
圖11熒光免疫化學(xué)反應(yīng)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞陰性對(duì)照(X200)；
圖12體外定向誘導(dǎo)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞分化形成有突觸的神經(jīng)細(xì)胞(X200)；
圖13熒光免疫化學(xué)反應(yīng)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞分化形成的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)NSE(X200)；
圖14體外定向誘導(dǎo)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞分化形成脂肪細(xì)胞，油紅O染色陽(yáng)性(X200)；
圖15體外定向誘導(dǎo)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞分化形成成骨細(xì)胞，茜素紅染色陽(yáng)性(X100)；圖16大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞分化形成成骨細(xì)胞，Vonkossa染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色(X100)。
【具體實(shí)施方式】
[0008]下面通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。
[0009]實(shí)施例1
1.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞形態(tài)特征
Η.Ε染色:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞完全貼壁后，呈多角形上皮樣(圖1)。染色方法參照司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[Μ].世界圖書(shū)出版公司.2007.略；
Giemsa染色:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞核為橢圓形，核仁多為單核仁或雙核仁(圖2)。染色方法參照R.1.弗雷謝尼.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一基本技術(shù)指南[Μ].科學(xué)出版社.2008.略；
2.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞生長(zhǎng)特性
大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞克隆性生長(zhǎng)；生長(zhǎng)曲線(xiàn)表明細(xì)胞接種第Id生長(zhǎng)緩慢，第2~4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5~6d為平臺(tái)期，第7d增殖能力下降(圖3)。
[0010]生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定方法 :解凍復(fù)活第20、30、40代大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養(yǎng)液分別稀釋細(xì)胞至I X IO4個(gè)/mL。取96孔板7個(gè)，每個(gè)板上分別接種3種不同代數(shù)的細(xì)胞，每代設(shè)6個(gè)孔，每孔加100 μ L細(xì)胞懸液，并設(shè)陰性對(duì)照(基礎(chǔ)培養(yǎng)液，無(wú)細(xì)胞)，置于37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此時(shí)記為0d。每24h取出一塊培養(yǎng)板，采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞吸光度值(0D值)，共測(cè)7d。測(cè)定時(shí)，每孔加10 μ LCCK-8后，置于37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中作用2h，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處OD值。以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，吸光度值(OD)為縱坐標(biāo)，繪制大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。
[0011]3.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞染色體數(shù)目
染色體標(biāo)本顯示大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞是正常的二倍體細(xì)胞，染色體數(shù)目2n=42 (圖4)。
[0012]大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞按I父105個(gè)/ HiL細(xì)胞密度接種于鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，貼壁培養(yǎng)。擴(kuò)增至80%融合時(shí)，加入終濃度為0.1 μ g/mL秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)5h，使多數(shù)細(xì)胞染色體停于中期分裂相。0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液室溫消化3min，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液終止消化，離心。棄上清，加入0.4%KC1，并置于37°C水域中，低滲30min，離心。棄上清，加甲醇-冰醋酸固定液(甲醇:冰醋酸=3:1，現(xiàn)用現(xiàn)配)，混勻，靜置固定20min，離心。如此反復(fù)固定2~3次。棄上清，加0.5mL固定液，混勻，制成染色體懸液。取冰凍載玻片，于約80cm高度滴片,火焰干燥。滴加Giemsa染色液,染色lOmin。普通生物學(xué)顯微鏡下觀(guān)察染色體標(biāo)本，照相。
[0013]4.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞表達(dá)特征
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和熒光免疫化學(xué)反應(yīng)顯示大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)八聚體轉(zhuǎn)錄因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,圖 5)、配對(duì)基因盒 4 (Paired box 4, Pax4,圖 6)、配對(duì)基因盒 6 (Paired box 6, Pax6,圖 7)、神經(jīng)源性因子 3 (Neurogenin 3, Ngn3,圖 9)和巢蛋白(nestin,圖 10),不表達(dá) Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin和secretin。圖8是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陰性對(duì)照，圖11是突光免疫化學(xué)反應(yīng)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞陰性對(duì)照。
[0014]4.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
根據(jù)所購(gòu)特異性抗體是否帶熒光標(biāo)記，采用直接免疫熒光標(biāo)記法或間接免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)。
[0015]4.1.1直接免疫熒光標(biāo)記法
直接免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞不表達(dá)MafA、PCNA、⑶117、⑶15、⑶34和 CD45。
[0016]PBS(-)洗滌大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞2次，稀釋細(xì)胞至I X IO6個(gè)/mL。取EP管7個(gè)，分別加入ImL細(xì)胞懸液，離心(1000rpm, 5min)。棄上清，分別加入200uL含1%BSA的PBS(-)稀釋的熒光素標(biāo)記抗體(0.25ug/100uL稀釋的金黃地鼠抗小鼠MafA熒光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人PCNA熒光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人CD117熒光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人CD 15熒光抗體、5uL/IOOuL稀釋的小鼠抗人CD34熒光抗體或5uL/IOOuL稀釋的小鼠抗人⑶45突光抗體,均購(gòu)自eBioscience公司)，陰性對(duì)照加PBS(-),混勻，4°C孵育30min,離心(1000rpm, 5min)。棄上清，PBS (-)洗漆細(xì)胞 2 次,離心(1000rpm, 5min),以除去未結(jié)合的多余抗體。每管分別加0.5mLPBS (-)重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(Accuri C6，BD，美國(guó))檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0017]4.1.2間接免疫熒光標(biāo)記法
間接免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞表達(dá)八聚體轉(zhuǎn)錄因子4 (0ct4)、配對(duì)基因盒 4 (Paired box 4, Pax4)和配對(duì)基因盒 6 (Paired box 6, Pax6)。
[0018]PBS (_)洗滌大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞2次，稀釋細(xì)胞至I X IO6個(gè)/mL。取EP管4個(gè)，分別加入ImL細(xì)胞懸液,離心(1000rpm, 5min)。棄上清，分別加入200uL含1%BSA的PBS (_)稀釋的無(wú)熒光素標(biāo)記的一抗(1:100稀釋的兔抗人0ct4或1:500稀釋的兔抗大鼠Pax6,購(gòu)自Epitomics公司；1:50兔抗人Pax4,購(gòu)自Abgent公司)，陰性對(duì)照加PBS(-),混勻，4°C孵育30min，離心(1000rpm，5min)。棄上清，PBS (-)洗滌細(xì)胞2次，離心(lOOOrpm，5min)，以除去未結(jié)合的多余抗體。棄上清，加入200uL含I %BSA的PBS (_)稀釋的熒光素標(biāo)記二抗(1:100稀釋的羊抗兔突光二抗,購(gòu)自Epitomics公司)，陰性對(duì)照加PBS (-),混勻，4°C孵育30min，離心(lOOOrpm，5min)。棄上清，PBS (-)洗滌細(xì)胞2次，離心(lOOOrpm，5min),以除去未結(jié)合的多余抗體。每管分別加0.5mLPBS(_)重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀(AccuriC6，BD，美國(guó))檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0019]4.2突光免疫化學(xué)反應(yīng)
對(duì)于購(gòu)買(mǎi)不到流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的抗體，則購(gòu)買(mǎi)熒光免疫化學(xué)反應(yīng)抗體檢測(cè)。
[0020]熒光免疫化學(xué)反應(yīng)顯示大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)源性因子3 (Neurogenin
3,Ngn3)和巢蛋白(nestin),不表達(dá) Pdxl、Ptfla、CK19、Nanog、NeuroD2、Sox2、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 及 secretin。
[0021]在鋪有0.1 %明膠的培養(yǎng)皿中放入蓋玻片，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞按I父105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種在放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞爬片15min。PBS (-)洗滌細(xì)胞爬片2次后，l%Triton_X100穿孔30min，1%BSA封閉45min。洗掉多余封閉液，加含1%BSA的PBS (_)稀釋的一抗(1:100稀釋的小鼠抗人Ngn3、3 μ g/mL稀釋的小鼠抗人Ptfla、5 μ g/mL稀釋的小鼠抗人ghrelin或1:100稀釋的兔抗人secretin,均購(gòu)自Abcam公司；1:300稀釋的小鼠抗大鼠nestin,購(gòu)自Novus公司；20yg/mL稀釋的小鼠抗人Pdxl或20 μ g/mL稀釋的小鼠抗人CK19,購(gòu)自eBioscience公司；1:100稀釋的兔抗人Nanog、1:300稀釋的兔抗大鼠NeuroD2、1:100稀釋的兔抗人Sox2或1:100稀釋的兔抗人somatostatin,均購(gòu)自Epitomics公司；1:500稀釋的小鼠抗大鼠insulin或1:500稀釋的兔抗大鼠glucagon，購(gòu)自Boster公司；)，陰性對(duì)照加PBS(-)，4°C過(guò)夜。PBS(_)洗滌3次，每次3min。加含1%BSA的PBS (_)稀釋的熒光二抗(1:1000稀釋的羊抗小鼠突光二抗，購(gòu)自Novu公司或1:100稀釋的羊抗兔突光二抗,購(gòu)自Epitomics公司)，陰性對(duì)照加PBS(-)，37°C孵育lh。PBS (_)洗滌3次，每次3min，甘油封片。熒光顯微鏡下觀(guān)察，照相。陰性對(duì)照細(xì)胞為小鼠胎兒成纖維細(xì)胞。
[0022]5.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞分化潛能
大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞具有多分化潛能，體外定向誘導(dǎo)，分化形成神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。[0023]5.1分化形成神經(jīng)細(xì)胞
分化形成神經(jīng)細(xì)胞:采用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液體外定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6d，約有50%大鼠胰島多角形上皮樣干細(xì)胞分化形成有突觸的神經(jīng)細(xì)胞(圖12)，熒光免疫化學(xué)反應(yīng)表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(圖13)。
[0024]大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞按I X IO5個(gè)/ mL細(xì)胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，換DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，隔天換液。誘導(dǎo)6d，約有50%大鼠胰島多角形上皮樣干細(xì)胞分化形成有突觸的神經(jīng)細(xì)胞，熒光免疫化學(xué)反應(yīng)表達(dá)NSE。
[0025]5.2分化形成脂肪細(xì)胞
分化形成脂肪細(xì)胞:采用 DMEM+10%NBS+lumol/L 地塞米松 +lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX誘導(dǎo)液體外定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)7d，大鼠胰島多角形上皮樣干細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小而少的脂滴；14d，細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，大小均勻；21d，約80%多角形上皮樣干細(xì)胞變?yōu)閳A形細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)脂滴繼續(xù)增多，大小不一；27d，圓形細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多、增大，油紅O染色陽(yáng)性(圖14)。
[0026]大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞按I X IO5個(gè)/ mL細(xì)胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，換DMEM+10%NBS+lumol/L地塞米松+lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，隔天換液。誘導(dǎo)7d,大鼠胰島多角形上皮樣干細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小而少的脂滴；14d，細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，大小均勻；21d，約80%多角形上皮樣干細(xì)胞變?yōu)閳A形細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)脂滴繼續(xù)增多，大小不一 ；27d，圓形細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多、增大,油紅O染色陽(yáng)性。
[0027]5.3分化形成成骨細(xì)胞
分化形成成骨細(xì)胞:采用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導(dǎo)液體外定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)7d，約30%大鼠胰島多角形上皮樣干細(xì)胞出現(xiàn)皺縮；14d，皺縮細(xì)胞增至50%，部分細(xì)胞死亡；21d，細(xì)胞分泌增多，開(kāi)始出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)；28d，礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色陽(yáng)性(圖15)，Vonkossa染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色(圖16)。
[0028]大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞按I X IO5個(gè)/ mL細(xì)胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，換RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，隔天換液。誘導(dǎo)7d，約30%大鼠胰島多角形上皮樣干細(xì)胞出現(xiàn)明顯的皺縮；14d，皺縮細(xì)胞增至50%，部分細(xì)胞死亡；21d，細(xì)胞分泌增多，開(kāi)始出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)；28d，礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色陽(yáng)性，Vonkossa染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色。
[0029]6.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞致瘤性
大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞無(wú)致瘤性。大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞接種在裸鼠背部皮下30d，解剖，眼觀(guān)未見(jiàn)瘤狀物。
[0030]在6只裸鼠背部皮下分別注射大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞，劑量為I X IO6個(gè)/0.2mL/site, 3只裸鼠背部皮下注射0.2mL細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640作為對(duì)照，正常飼養(yǎng)管理30d。結(jié)果，6只實(shí)驗(yàn)裸鼠和3只對(duì)照裸鼠均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，解剖觀(guān)察，均未見(jiàn)瘤狀物。
[0031]7.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞傳代培養(yǎng)
當(dāng)大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化3min, RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液終止消化，離心(lOOOrpm，5min)。收集的細(xì)胞按I X IO6個(gè)/mL細(xì)胞密度接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)。該例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系已傳50代。
[0032]8.大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞冷凍保存
冷凍:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，PBS (_)清洗，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液終止消化，離心(lOOOrpm, 5min)。80%RPMI1640+10%DMS0+10%NBS冷凍液稀釋細(xì)胞至I X IO6個(gè)/mL，分裝于冷凍管。4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長(zhǎng)期冷凍保存。
[0033]解凍:從液氮罐中取出大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液清洗解凍細(xì)胞2~3遍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)。取少量細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)，細(xì)胞解凍成活率約為93%。
[0034]采用該冷凍保存方法，已冷凍保存該例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞50管，約0.5 X IO8個(gè)細(xì)胞。
【權(quán)利要求】
1.一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞來(lái)源于正常成年大鼠胰島組織，體外培養(yǎng)能克隆性生長(zhǎng)，且具有多分化潛能，保藏號(hào)為C201460，保藏日期2014年4月2日，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞形態(tài)特征為:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞完全貼壁后，呈多角形上皮樣，細(xì)胞核為橢圓形，核仁多為單核仁或雙核仁。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞生長(zhǎng)特性為:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞克隆性生長(zhǎng)；細(xì)胞接種第Id生長(zhǎng)緩慢，第2~4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5~6d為平臺(tái)期，第7d增殖能力下降。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞染色體數(shù)目為:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞是正常的二倍體細(xì)胞，染色體數(shù)目2n=42。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞表達(dá)特征為:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)八聚體轉(zhuǎn)錄因子4(Octamer-binding transcription factor 4,0ct4)、配對(duì)基因盒 4(Paired box 4,Pax4)、配對(duì)基因盒6 (Paired box 6, Pax6)、神經(jīng)源性因子3 (Neurogenin 3, Ngn3)和巢蛋白(nestin)，不表達(dá) Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 和 secretin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞分化潛能為:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞具有多分化潛能，體外定向誘導(dǎo)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞分化形成有突觸的神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NSE ;分化形成含有脂滴的脂肪細(xì)胞，油紅O染色陽(yáng)性；分化形成成骨細(xì)胞，產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽(yáng)性，Vonkossa染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞致瘤性:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞無(wú)致瘤性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞傳代培養(yǎng):當(dāng)大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化傳代，收集的細(xì)胞按I X IO6個(gè)/mL細(xì)胞密度接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，RPMI1640+ 10%NBS+10ng/mLbFGF培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)；該干細(xì)胞系已傳50代。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞冷凍保存: 冷凍:80%DMEM+10%DMS0+10%NBS細(xì)胞冷凍液稀釋大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞至I X IO6個(gè)/mL，分裝于冷凍管；4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長(zhǎng)期冷凍保存； 解凍:從液氮罐中取出大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)；臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)，大鼠胰島上皮樣干細(xì)胞解凍成活率約為93%。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK103881961SQ201410138844
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】安立龍, 效梅 申請(qǐng)人:廣東海洋大學(xué)