南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法。該方法包括以下步驟：（1）南美白對蝦肝胰腺樣品總RNA的提?。唬?）以總RNA為模板反轉錄合成cDNA；（3）熒光定量PCR擴增SOD和PO特異性序列：選用特異性引物，PCR反應條件為95℃預變性5min，95℃變性30s、60℃退火15s、72℃延伸30s；（4）根據測得的SOD、PO及內參基因β-actin的ct值，計算出SOD和PO的相對含量。本發(fā)明不僅可以同時測定多個免疫相關因子，而且引物特異性好，擴增效率高，提高了檢測的準確性。
【專利說明】南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于水生動物免疫學分子檢測技術，具體涉及采用熒光定量PCR相對定量技術實時檢測南美白對奸超氧岐化酶(superoxide dismutase, SOD)和酹氧化酶(phenoloxidase, PO)基因的表達，為評估免疫增強劑、不同養(yǎng)殖條件對蝦免疫狀態(tài)的影響提供參考依據。
【背景技術】
[0002]南美白對蝦屬甲殼類動物，其免疫主要為非特異性免疫，包括體液免疫中的一些非特異性的酶或因子來進行的?？寡趸甘菬o脊椎動物機體非特異性免疫的一個重要方面，其中SOD是一種能夠催化超氧化物通過歧化反應轉化為O2和H2O2的酶。SOD是抗氧化系統(tǒng)中起關鍵作用的酶，不僅具有清除體內自由基的作用，而且在機體免疫調節(jié)中具有重要的作用。PO又被稱為酪氨酸酶，是一種含銅的氧化還原酶，在對蝦血細胞內以酚氧化物酶原(Prophenoloxidase,proPO)的形式存在,是一條單一的多肽鏈，可被激活為60kD和62kD具PO活性的酶分子。PO能夠催化單酚羥化成二酚，再把二酚氧化成醌，醌在非酶促條件下形成反應終產物黑色素。但反應鏈的短暫中間產物擁有很高生物毒性，能夠抑制病原體胞外蛋白酶以及幾丁質酶的活性，屬于一種酶級聯(lián)反應系統(tǒng)，在南美白對蝦抵抗病原菌侵襲過程中具有重要作用。
[0003]目前大多檢測南美白對蝦免疫活性因子是通過采集血清，采用生化反應方法檢測免疫相關酶。由于采集過程及檢測過程，酶活性極易受外界環(huán)境的影響，常導致檢測結果波動性很大，檢測的可 靠性受影響。酶的產生是通過基因的轉錄、翻譯及后加工形成的，其轉錄水平的高低也可反映機體的免疫狀態(tài)。蝦肝胰腺是其血細胞產生的主要場所，肝胰腺組織免疫因子的轉錄表達也可作為評價機體免疫能力的指標之一。熒光定量PCR檢測技術已經成為國際上檢測基因表達通用的方法，能對低豐度mRNA水平進行定量分析。設計特異性強的引物以及合適的反應條件是利用熒光定量PCR檢測南美白對蝦免疫相關因子的關鍵。本發(fā)明設計的引物及反應條件可同時用于檢測南美白對蝦肝胰腺SOD和PO的轉錄相對定量表達檢測，為今后準確分析其南美白對蝦免疫狀態(tài)提供了新的方法。該技術未見相關的專利報道。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現有技術的不足，建立一種南美白對蝦肝胰腺免疫相關因子S0D、PO的熒光定量檢測方法，該方法特異性強，敏感性高，克服酶法測定易波動的問題，適合南美白對蝦免疫活力的評估。
[0005]本發(fā)明解決所述技術問題的方案為:一種南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟，
[0006](I)南美白對蝦肝胰腺樣品總RNA的提取:取南美白對蝦肝胰腺組織，用Trizol裂解液裂解，加入氯仿，離心得到總RNA，用DEPC水溶解RNA后測定RNA濃度和純度；
[0007](2)以總RNA為模板反轉錄合成cDNA ；
[0008](3)熒光定量PCR擴增SOD和PO特異性序列:PCR反應條件為95°C預變性5min，95°C變性30s、60°C退火15s、72°C延伸30s ;所用特異性引物序列為:
【權利要求】
1.一種南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:包括以下步驟， (O南美白對蝦肝胰腺樣品總RNA的提取:取南美白對蝦肝胰腺組織，用Trizol裂解液裂解，加入氯仿，離心得到總RNA，用DEPC水溶解RNA后測定RNA濃度和純度； (2)以總RNA為模板反轉錄合成cDNA； (3)熒光定量PCR擴增SOD和PO特異性序列:PCR反應條件為95°C預變性5min，95°C變性30s、60°C退火15s、72°C延伸30s ;所用特異性引物序列為:
2.如權利要求1所述的南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述南美白對蝦肝胰腺樣品總RNA提取的具體步驟為: 取南美白對蝦完整肝胰腺組織，加入500 μ L Trizol裂解液，研磨、勻漿后，取50 μ L勻漿液加入ImL Trizol繼續(xù)裂解，其余勻漿液置-80°C保存?zhèn)溆茫换驅⑼暾我认僭谝旱兴賰龊?，置于_80°C保存，使用時，將組織全部碾磨后，取IOOmg加入ImL Trizol裂解，其余組織粉末置_80°C保存?zhèn)溆茫? 取出的50 μ L勻漿液或IOOmg組織粉末裂解后，離心、吸取上清至新的離心管，加入.200yL氯仿后混勻；再次離心、吸取上清至新的離心管，加入等體積異丙醇后混勻、靜置；離心后棄上清，用500 μ LDEPC水配制的70%乙醇洗滌沉淀，棄去上清；用100 μ LDEPC水溶解RNA后測定RNA濃度和純度。
3.如權利要求1所述的南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述以總RNA為模板反轉錄合成cDNA的具體步驟為:
取 1μ g 總 RNA 為模板，加入 IOmM dNTPl μ L, 50mM Oligo (dT) 151 μ L，加 DEPC 水至總體積6.25 μ L, 65°C變性5min,冰上驟冷2min ； 上述反應液加入5 XMMLV Buffer2 μ L，RNA酶抑制劑0.25 μ L7MMLV逆轉錄酶0.5 μ L，.1OmM 二硫蘇糖醇(DTT) I μ L，使最終反應總體積達10 μ L ; 42°C反應Ih后，65°C孵育lOmin，cDNA合成完畢，合成后的cDNA加入90 μ L無菌雙蒸水稀釋10倍，可立即用于后續(xù)PCR擴增，也可儲于-20°C備用。
4.如權利要求1所述的南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述熒光定量PCR擴增SOD和PO特異性序列的步驟為: 取合成的cDNA稀釋液5 μ L作為擴增模板，分別加入2 X sybgreen反應預混液.12.5 μ L，5 μ M相應的特異性上游和下游引物各0.5 μ L，加無菌雙蒸水6.5 μ L，使反應總體系達25 μ L，置于熒光定 量PCR儀上進行PCR反應。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898224SQ201410141366
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權日:2014年4月10日
【發(fā)明者】劉莉, 林鋒, 曹錚, 藺凌云, 葉雪平, 沈錦玉 申請人:劉莉