一種利用miR-146a為標志物的肝癌患者血清檢測試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于分子生物醫(yī)學【技術(shù)領(lǐng)域】的一種利用miR-146a為標志物的肝癌患者血清檢測試劑盒及方法。本發(fā)明設(shè)計miR-146a特異性的引物，采用定量PCR的方法檢測正常人血清、肝癌患者血清中miR-146a的含量變化，含量顯著降低為肝癌患者血清。本發(fā)明的方法簡單，迅速，靈敏，適用于檢測患者是否患有肝癌。
【專利說明】-種利用miR-146a為標志物的肝癌患者血清檢測試劑盒 及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物醫(yī)學【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用miRNA-146a為標志物的 肝癌血清檢測試劑盒及方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌是一種常見的惡性腫瘤，據(jù)報道，世界范圍內(nèi)每年新增肝細胞癌患者達到 700,000以上。中國是全球肝癌發(fā)病率最高的國家，有統(tǒng)計顯示，我國肝癌發(fā)病人數(shù)占 全球55%，死亡人數(shù)占全球45%，列癌癥死亡的第二位，而且發(fā)病率不斷上升。肝細胞 癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療對肝癌患者的預后和存活時間至關(guān)重要。甲胎蛋白 (alpha-fetoprotein, AFP)是迄今人類發(fā)現(xiàn)的第一個具有診斷價值的腫瘤標志物，在原發(fā) 性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC)發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。但根據(jù)臨 床資料，約有30 %?40 %肝癌患者血清AFP陰性，而中國又是原發(fā)性肝細胞癌的高發(fā)國家， 近年來報道的血清AFP陰性原發(fā)性肝細胞癌有增多趨勢。這部分肝癌患者缺乏有效的腫瘤 標志物用于預后判斷與療效評價。因此，新的肝癌血清標志物，尤其是AFP陰性肝細胞癌的 血清標志物的檢測具有重要的臨床意義。
[0003] microRNA(miRNA)是一類長約22nt的非編碼小RNA分子，它們通過與靶基因 3' UTR結(jié)合降解靶基因或者抑制翻譯，在多種生理過程中發(fā)揮重要作用。肝癌的發(fā)生發(fā)展 過程由多種復雜的調(diào)控通路參與，其中miRNA參與了肝癌致病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。肝 癌的致病原因有很多，如炎性反應、內(nèi)皮細胞功能障礙等，近期越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 能夠參與到上述病理過程的調(diào)控之中。
[0004] 本發(fā)明證實，miR-146a在AFP為陰性的肝癌患者血漿中含量明顯低于正常，這種 特性能作為這種疾病的標志分子，用于臨床診斷。進一步研究證實在肝癌細胞中miR-146a 能抑制人肝癌細胞的增殖、遷移作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供miR_146a作為肝癌血清分子標志物。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測miR_146a表達量的引物。
[0007] 本發(fā)明的目的還在于提供一種肝癌血清檢測試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的目的還在于提供一種非診斷目的的肝癌血清檢測方法。
[0009] -種檢測miR_146a表達量的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 所示。
[0010] 一種肝癌血清檢測試劑盒，所述試劑盒包含序列表中SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 所示的引物，標準樣品，內(nèi)參引物，反轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs，buffer，RNA酶抑制劑和滅菌水。
[0011] 所述標準樣品為未經(jīng)過處理的人血清樣品中的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。
[0012] 一種非診斷目的的肝癌血清檢測方法，按照如下步驟進行：
[0013] (1)提取待檢樣品的總RNA ;
[0014] (2)將步驟（1)得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ;
[0015] (3)利用權(quán)利要求3或4所述的一種肝癌血清檢測試劑盒，以步驟⑵得到的cDNA 為模板，做定量PCR，檢測樣品中miR-146a的表達量；
[0016] (4)若待檢樣品的表達量顯著高于標準樣品的表達量，則該待檢樣品取自肝癌患 者的生物樣品。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是定量PCR檢測正常人血清與AFP為陰性的肝癌患者血清中miR-146a含量 的結(jié)果。
[0019] 圖2是定量PCR檢測人肝癌細胞中miR-146a含量的結(jié)果。
[0020] 圖 3 轉(zhuǎn)染 NC、si_VASN、miR-146a mimics 與 miR_146a inhibitors 后，對人肝癌細 胞株IfepG2中VASN mRNA水平的影響。
[0021] 圖 4 轉(zhuǎn)染 NC、si_VASN、miR-146a mimics 與 miR_146a inhibitors 后，對人肝癌細 胞株H印G2中VASN蛋白水平的影響。
[0022] 圖5是MTT實驗檢測轉(zhuǎn)染miR-146amimics與miR_146a inhibitor后，對人肝癌 細胞株H印G2增殖的影響。 圖6是劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染miR_146a mimics與miR_146a inhibitor后，對人肝癌細胞 株HepG2遷移的影響。 圖 7 是 Transwell 實驗檢測轉(zhuǎn)染 miR_146a mimics 與 miR_146a inhibitor 后，對人肝 癌細胞株H印G2遷移的影響。

【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0024] 以下實施例未說明的實驗步驟參照《分子克隆實驗指南》第三版，或參照相應試劑 盒的說明書。
[0025] 實施例1人血清樣品中RNA的抽提
[0026] (1)樣品（正常人血清、肝癌患者血清）室溫放置5分鐘，從-80°C冰箱取出的樣 品室溫放置15分鐘至融化。
[0027] (2)每250 ill樣品加750微升Trizol混勻，再加入250 ill三氯甲烷，劇烈晃動 15秒，室溫靜置3分鐘。
[0028](3) 4°C、12000g 離心 15 分鐘，上層為 RNA
[0029] (4)將上層水相約500 ill轉(zhuǎn)移到新EP管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻10 秒，置于-20 °C冰箱沉淀兩小時或過夜。
[0030] (5)取出樣品，4°C 12000g離心15分鐘，倒掉上清加入lml80%乙醇（DEPC水配 置）洗滌沉淀，上下翻轉(zhuǎn)十次，使白色RNA沉淀浮起，4°C、7500g離心5分鐘，共進行兩次。
[0031] (6)棄上清，吸盡管中液體，使乙醇揮發(fā)干凈（約2-5分鐘）
[0032] (7)待RNA沉淀邊緣開始變干透明時，立即加入DEPC水（20iU左右）。取liil 用于定量，其它RNA與-80°C保存?zhèn)溆?。可加? yl RNAase inhibiter防止RNA降解。
[0033] 實施例2反轉(zhuǎn)錄
[0034] 米用 M-MLV Reverse Transcriptase [Promega#9PIM170]反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn) 錄。
[0035] 每個樣品取1 U gRNA分別和miRNA_146a及U6的特異反轉(zhuǎn)引物混合，70度水浴 1〇分鐘，冰上放置兩分鐘。然后每個樣品分別加入^^作沾111，(1階？4111，反轉(zhuǎn)錄酶1111， RNAase inhibitorO. 2 y 1。反轉(zhuǎn)好的cDNA在-20度保存，避免反復凍融。
[0036] 實施例3定量-PCR
[0037] 按照實驗分組，每個樣品檢測內(nèi)參和miRNA_146a的含量。PCR正向引物和反向引 物如序列表中SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示，每個實驗組三個復孔，體系為20 iil，儀器 為 Stratagene MxPro3000, SYBR Green mix 為 Promega
[0038] 公司產(chǎn)品。實驗體系為：10iil2XSYBR Green mix，8iil 水，liil 引物，liil cDNA。 PCR反應條件是95度5分鐘，95度20秒，60度20秒，72度20秒，50個循環(huán)，溶解曲線為 60度到95度，溫度間隔為0. 4度。
[0039] PCR結(jié)果如圖1-2所示，在AFP為陰性的肝癌患者中miRNA_146a的拷貝數(shù)明顯低 于正常人血清中miRNA-146a的拷貝數(shù)（圖1);在人肝癌細胞株H印G2中miRNA-146a的拷 貝數(shù)明顯低于肝正常細胞株L02中miRNA-146a的拷貝數(shù)（圖2)。
[0040] 實施例4MTT實驗
[0041] 以2 X 103個細胞/孔接種于96孔板；培養(yǎng)過夜后，待細胞密度達到40 %時進行轉(zhuǎn) 染。37°C培養(yǎng)24h-72h，檢測細胞數(shù)；每孔加入100 ill培養(yǎng)基和20 ill MTS的混合液，37°C 孵育lh，酶聯(lián)免疫檢測儀490nm讀取吸光度值，繪制生長曲線。
[0042] 實施例5細胞劃痕實驗
[0043] 以5X 105個細胞/孔接種于6孔板；培養(yǎng)過夜后待細胞密度達到40%時進行轉(zhuǎn) 染。37°C培養(yǎng)24h，使細胞濃度達到90%左右；用黃槍頭在培養(yǎng)孔中輕劃2-3條劃痕，換新 鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔6h觀察劃痕愈合情況。
[0044] 實施例6細胞遷移實驗
[0045] 以5X 105個細胞/孔接種于6孔板；培養(yǎng)過夜待細胞密度達到40%時進行轉(zhuǎn)染。 37°C培養(yǎng)24h后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h ;消化細胞制備單細胞懸液，稀釋為5X 105個 細胞/ ml，每種細胞種3個小室，每個小室中加入100 iil，在24孔板中加入500 ill含10% FBS的培養(yǎng)基作為下液，將Transwell小室放入孔中，繼續(xù)培養(yǎng)12-24h取出小室；用PBS擦 去小室內(nèi)表面上未穿膜的細胞，甲醛固定30min，結(jié)晶紫染色30min，與顯微鏡下觀察。20X 視野下細胞計數(shù)，共計數(shù)四個視野，取平均值。
【權(quán)利要求】
1. miR-146a作為肝癌血清分子標志物，其特征在于，所述核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1 所示。
2. -種檢測miR-146a表達量的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 所示。
3. -種肝癌血清檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物，標 準樣品，內(nèi)參引物，反轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs，buffer，RNA酶抑制劑和滅菌水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述一種肝癌血清檢測試劑盒，其特征在于，所述標準樣品為未經(jīng) 過處理的人血清樣品中的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。
5. -種非診斷目的的肝癌血清檢測方法，其特征在于，按照如下步驟進行： (1) 提取待檢樣品的總RNA ; (2) 將步驟⑴得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ; ⑶利用權(quán)利要求3或4所述的一種肝癌血清檢測試劑盒，以步驟⑵得到的cDNA為 模板，做定量PCR，檢測樣品中miR-146a的表達量； (4)若待檢樣品的表達量顯著高于標準樣品的表達量，則該待檢樣品取自肝癌患者的 生物樣品。
【文檔編號】C12N15/113GK104450703SQ201410143207
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】邵寧生, 李慧, 李少華, 李潔, 王瑋, 丁紅梅, 黃皚雪, 蘇雪婷, 趙強 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所