一種提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法。該方法包括以下步驟：制備蛭弧菌微生物制劑；將蛭弧菌微生物制劑與不同種類和/或不同濃度的保護劑混合，得到混合液；將混合液置于不同溫度下進行加速試驗；定期取樣，檢測混合液中蛭弧菌微生物制劑的活菌濃度；運用阿倫尼烏斯方程及記錄的數(shù)據(jù)計算出蛭弧菌微生物制劑的保質(zhì)期，通過比對保質(zhì)期來確定保護劑的效果。通過該方法，對不同的保護劑對于蛭弧菌微生物制劑的保質(zhì)效果進行對比，篩選出保質(zhì)效果最佳的保護劑，明顯延長蛭弧菌微生物制劑的保質(zhì)期；且可在長時間內(nèi)有效保持蛭弧菌微生物制劑中菌體的活力。本發(fā)明提供的保護劑選材廣泛價格低廉，適用于推廣使用。
【專利說明】一種提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于蛭弧菌【技術領域】，特別涉及一種提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法。
【背景技術】
[0002]目前，出于環(huán)境友好的需要，許多在畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用的殺菌防病制劑多采用微生物型。但是多數(shù)微生物制劑存在活性極易喪失或下降、貨架期短等缺點。同時，在我們的實際養(yǎng)殖環(huán)境當中，我們需要濃度和活力較高的微生物制劑以便菌體能夠較好地投入到生產(chǎn)應用當中。國內(nèi)外對于微生物制劑的保質(zhì)技術的研究主要集中于雙歧桿菌凍干粉、微膠囊化有益菌微生物制劑等方面，而對于延長由蛭弧菌制得的微生物制劑的保質(zhì)期技術目前尚為欠缺，且主要集中于用冷凍干燥或包埋等方法，但是這些方法制得的微生物制劑的保質(zhì)期短，而且固定化的蛭弧菌微生物制劑將難以發(fā)揮其對于細菌的裂解作用，存在一定的局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法。該方法彌補了蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期普遍較短的缺陷。
[0004]本發(fā)明的另一目的在于提供所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法的應用。
[0005]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):一種提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法，包括以下步驟:
[0006]( I)制備蛭弧菌微生物制劑；
[0007](2)在蛭弧菌微生物制劑中加入不同種類和/或不同濃度的保護劑。
[0008]所述的蛭弧菌優(yōu)選為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS02，為2009年8月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209170 ;對所述的蛭弧菌進行進行負染后于電子顯微鏡下觀察形態(tài)可知:BDS02呈單細胞，弧形，大小為0.65 X 0.2 μ m,端生鞭毛，鞭毛長度為1.8 μ m ;所述蛭弧菌BDS02用雙層平板培養(yǎng)的方法于28°C培養(yǎng)四天可形成直徑I~2mm的透明圓形卩遼菌斑；
[0009]所述的蛭弧菌微生物制劑優(yōu)選通過以下步驟獲得:
[0010]①宿主菌濃縮液的制備:挑取大腸桿菌單菌落(大腸桿菌E.coli，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號為GIM1.355),接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)液離心，棄上清，每IOOmL培養(yǎng)液收集的沉淀用2~3mL DNB (dilutednutrient broth)液體培養(yǎng)基懸浮,得到宿主菌濃縮液,4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0011]②蛭弧菌微生物制劑的制備:按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養(yǎng)基的體積比1: 1:50的比例進行混合，恒溫培養(yǎng)，每24h添加一次宿主濃縮液，培養(yǎng)48h，得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液離心，取上清液，過濾，濾液使用質(zhì)量體積比(g/mL) 1.5%鹽度的滅菌蒸餾水調(diào)整其濃度，最終蛭弧菌微生物制劑的終濃度為101°~IO11PFU (plaque-forming unit)/mL;即為蛭弧菌微生物制劑來進行后續(xù)的加速試驗；
[0012]所述的蛭弧菌優(yōu)選為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS02，為2009年8月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209170 ；
[0013]步驟①中所述的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基優(yōu)選為營養(yǎng)肉湯18g/L，pH7.2，121°C高壓滅菌15min后保存?zhèn)溆茫?br> [0014]步驟①中所述的培養(yǎng)的條件優(yōu)選為200rpm、28°C培養(yǎng)18h ；
[0015]步驟①中所述的離心的條件優(yōu)選為4°C、6000rpm離心20min ；
[0016]步驟②中所述的恒溫培養(yǎng)的條件優(yōu)選為230rpm、28°C培養(yǎng)；
[0017]步驟②中所述的將培養(yǎng)液離心的條件優(yōu)選為6000rpm、4°C離心20min ；
[0018]步驟②中所述的過濾優(yōu)選為用0.45 μ m醋酸纖維素膜進行過濾；
[0019]步驟①和②中所述的DNB液體培養(yǎng)基，優(yōu)選通過如下步驟制備:稱取0.8g/L的營養(yǎng)肉湯，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.lg/L的酵母提取物，15g/L海水晶,用蒸懼水溶解混勻，調(diào)pH值至7.2~7.6，121 °C 0.1MPa條件下處理20min保存?zhèn)溆茫?br> [0020]步驟②中所述的質(zhì)量體積比(g/mL) 1.5%鹽度的滅菌蒸餾水優(yōu)選用海水晶制備得到；
[0021]步驟②中所述的蛭弧菌微生物制劑的終濃度優(yōu)選為6.4X1010~7.2X 1010pfu/mL ；
[0022]步驟(2)中所述的保護劑優(yōu)選為谷氨酸鈉、蔗糖、甘油、內(nèi)消旋肌醇、棉子糖和葡萄糖中的至少一種；
[0023]步驟(2)中所述的保護劑優(yōu)選為谷氨酸鈉、蔗糖和甘油中的至少一種；
[0024]步驟(2 )中所述的保護劑優(yōu)選為終質(zhì)量體積比1%~25%谷氨酸鈉、終質(zhì)量體積比1%~25%蔗糖和終體積百分比5%~30%甘油中的至少一種；
[0025]步驟(2)中所述的保護劑優(yōu)選為終質(zhì)量體積比5%谷氨酸鈉、終質(zhì)量體積比5%蔗糖和終體積百分比15%甘油中的至少一種；
[0026]步驟(2)中所述的保護劑更優(yōu)選為終質(zhì)量體積比5%谷氨酸鈉和終質(zhì)量體積比5%蔗糖；
[0027]步驟(2)中所述的保護劑的篩選方法，包括如下步驟:
[0028]( I )將上述制備好的蛭弧菌微生物制劑與不同種類和/或不同濃度的保護劑混合，得到混合液；
[0029]( II )將混合液置于梯度溫度下進行加速試驗；
[0030](III)定期取樣，檢測混合液中蛭弧菌微生物制劑的濃度；
[0031](IV)運用阿倫尼烏斯方程及步驟(III)記錄的數(shù)據(jù)計算出蛭弧菌微生物制劑的保質(zhì)期，通過比對保質(zhì)期來確定保護劑的效果；當保質(zhì)期越長，保護劑效果越好；保質(zhì)期越短，保護劑效果越差；
[0032]步驟(I )中所述的保護劑優(yōu)選為谷氨酸鈉、蔗糖、甘油、內(nèi)消旋肌醇、棉子糖和葡萄糖中的至少一種；
[0033]步驟(I )中所述的保護劑優(yōu)選為終質(zhì)量體積比5%~25%谷氨酸鈉、終質(zhì)量體積比5%~25%蔗糖和終體積百分比5%~25%甘油中的至少一種；[0034]步驟(I )中所述的保護劑優(yōu)選為終質(zhì)量體積比5%谷氨酸鈉、終質(zhì)量體積比5%蔗糖和終體積百分比15%甘油中的至少一種；
[0035]步驟(I )中所述的保護劑更優(yōu)選為終質(zhì)量體積比5%谷氨酸鈉和終質(zhì)量體積比5%蔗糖；
[0036]步驟(I )中所述的混合液優(yōu)選為將蛭弧菌微生物制劑與保護劑按照體積比1:(I~5)進行混合得到；
[0037]步驟(II)中所述的梯度溫度優(yōu)選為25°C、37°C、45°C、55°C、65°C、75°C、85°C、95 °C ；
[0038]步驟(II)中所述的加速試驗是加速時間的長短隨溫度的升高而遞減；
[0039]步驟(III)中所述的定期取樣的檢測間隔時間優(yōu)選如表1所示。
[0040]表1不同的溫度下取樣檢測間隔時間及取樣次數(shù)
[0041]
【權利要求】
1.一種提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)制備蛭弧菌微生物制劑； (2)在蛭弧菌微生物制劑中加入不同種類和/或不同濃度的保護劑； 所述的蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS02，為2009年8月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209170 ； 所述的保護劑為谷氨酸鈉、蔗糖、甘油、內(nèi)消旋肌醇、棉子糖和葡萄糖中的至少一種。
2.根據(jù)權利要求1所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法，其特征在于: 所述的保護劑為谷氨酸鈉、蔗糖和甘油中的至少一種。
3.根據(jù)權利要求1所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法，其特征在于:所述的保護劑為終質(zhì)量體積比5%~25%谷氨酸鈉、終質(zhì)量體積比5%~25%蔗糖和終體積百分比5%~25%甘油中的至少一種。
4.根據(jù)權利要求1所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法，其特征在于:所述的蛭弧菌微生物制劑通過以下步驟獲得: ①宿主菌濃縮液的制備:挑取大腸桿菌單菌落，接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)液離心，棄上清，每IOOmL培養(yǎng)液收集的沉淀用2~3mL DNB液體培養(yǎng)基懸浮，得到宿主菌濃縮液，4°C保存?zhèn)溆茫? ②蛭弧菌微生物制劑的制備:按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養(yǎng)基的體積比1: 1:50的比例進行混合，恒溫培養(yǎng)，每24h添加一次宿主濃縮液，培養(yǎng)48h，得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液離心，取上清液，過濾，濾液使用質(zhì)量體積比1.5%鹽度的滅菌蒸餾水調(diào)整其濃度，最終蛭弧菌微生物制劑的終濃度為101°~10nPFU/mL ;即為蛭弧菌微生物制劑來進行后續(xù)的加速試驗。
5.根據(jù)權利要求4所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法，其特征在于: 步驟①中所述的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯18g/L，pH7.2，121°C高壓滅菌15min后保存?zhèn)溆茫? 步驟①中所述的培養(yǎng)的條件為200rpm、28°C培養(yǎng)18h ； 步驟①中所述的離心的條件為4°C、6000rpm離心20min ； 步驟②中所述的恒溫培養(yǎng)的條件為230rpm、28°C培養(yǎng)； 步驟②中所述的將培養(yǎng)液離心的條件為6000rpm、4°C離心20min ； 步驟②中所述的過濾為用0.45 μ m醋酸纖維素膜進行過濾； 步驟①和②中所述的DNB液體培養(yǎng)基，通過如下步驟制備:稱取0.8g/L的營養(yǎng)肉湯，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.lg/L的酵母提取物，15g/L海水晶，用蒸餾水溶解混勻，調(diào)pH值至7.2~7.6，121 °C 0.1MPa條件下處理20min保存?zhèn)溆茫? 步驟②中所述的質(zhì)量體積比1.5%鹽度的滅菌蒸餾水用海水晶制備得到。
6.根據(jù)權利要求1所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法，其特征在于:所述的保護劑的篩選方法，包括如下步驟: (1)將權利要求1中制備好的蛭弧菌微生物制劑與不同種類和/或不同濃度的保護劑混合，得到混合液； (2)將混合液置于梯度溫度下進行加速試驗； (3)定期取樣,檢測混合液中蛭弧菌微生物制劑的濃度；(4)運用阿倫尼烏斯方程及步驟(3)記錄的數(shù)據(jù)計算出蛭弧菌微生物制劑的保質(zhì)期，通過比對保質(zhì)期來確定保護劑的效果；當保質(zhì)期越長，保護劑效果越好；保質(zhì)期越短，保護劑效果越差； 步驟(1)中所述的保護劑為谷氨酸鈉、蔗糖、甘油、內(nèi)消旋肌醇、棉子糖和葡萄糖中的至少一種。
7.根據(jù)權利要求6所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法，其特征在于: 步驟(1)中所述的保護劑為谷氨酸鈉、蔗糖和甘油中的至少一種； 步驟(1)中所述的保護劑為終質(zhì)量體積比5%~25%谷氨酸鈉、終質(zhì)量體積比5%~25%蔗糖和終體積百分比5%~25%甘油中的至少一種； 步驟(2)中所述的梯度溫度為 25°C、37°C、45°C、55°C、65°C、75°C、85°C、95°C ； 步驟(1)中所述的混合液為將蛭弧菌微生物制劑與保護劑按照體積比1: (I~5)進行混合得到； 步驟(2)中所述的加速試驗是加速時間的長短隨溫度的升高而遞減； 步驟(3)中所述的混合液中蛭弧菌微生物制劑的濃度通過雙層平板檢測法進行檢測。
8.根據(jù)權利要求6所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法，其特征在于: 步驟(3)中所述的定期取樣的檢測間隔時間為對于25°C環(huán)境下的樣品，每12h檢測蛭弧菌微生物制劑的濃度，周期72h;對于37°C環(huán)境下的樣品，每8h檢測蛭弧菌微生物制劑的濃度，周期48h ;對于45°C環(huán)境下的樣品，每4h檢測蛭弧菌微生物制劑的濃度，周期24h ；對于55°C環(huán)境下的樣品，每40min檢測蛭弧菌微生物制劑的濃度，周期8h ;對于65°C環(huán)境下的樣品，每20min檢測蛭弧菌微生物制劑的濃度，周期2h;對于75°C環(huán)境下的樣品，每IOmin檢測蛭弧菌微生物制劑的濃度,周期Ih ;對于85°C環(huán)境下的樣品，每5min檢測蛭弧菌微生物制劑的濃度，周期30min ;對于95 °C環(huán)境下的樣品,每Imin檢測蛭弧菌微生物制劑的濃度，周期IOmin。
9.根據(jù)權利要求6所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法，其特征在于: 步驟(4)中所述的阿倫尼烏斯方程為:阿倫尼烏斯方程的指數(shù)定律k=e-E/KT，其對數(shù)形式為:logk=-E/2.303RT+logA ； 其中k為失活速度常數(shù)，E為表觀活化能，R為摩爾氣體常數(shù)，T為熱力學溫度，A為頻率因子；以混合液中蛭弧菌微生物制劑的初始濃度為Ctl，所測的蛭弧菌微生物制劑濃度為C，求出各溫度下保存不同時間后的相對活性；以lgt；對時間進行回歸分析，得出各溫度和保護劑下蛭弧菌微生物制劑的失活速度常數(shù)，將Igk對1/TX103進行回歸分析，得阿倫尼烏斯方程；此后，求出該種蛭弧菌微生物制劑在不同溫度下濃度降為原始濃度的1%、0.1%和0.01%時的保質(zhì)期。
10.權利要求1~9任一項所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期的方法在延長蛭弧菌微生物制劑保質(zhì)期上的應用。
【文檔編號】C12Q1/06GK103952308SQ201410143830
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權日:2014年4月10日
【發(fā)明者】蔡俊鵬, 孫秋平 申請人:華南理工大學