涉及mRNA翻譯增強因子的組合物和方法
【專利摘要】這里提供了mRNA翻譯增強因子(TEEs)，例如，SEQ?ID?Nos：1-35。還提供了包括一種或者一種以上這里例舉的具體TEEs或其變體、類似物或其功能性衍生物的翻譯增強聚核苷酸。進一步提供了包括這種TEEs或翻譯增強聚核苷酸的表達(dá)載體，以及含有這種載體的宿主細(xì)胞和表達(dá)系統(tǒng)。
【專利說明】涉及mRNA翻譯增強因子的組合物和方法
[0001]本申請是2008年12月11日遞交的申請?zhí)枮?00880126367.0，發(fā)明名稱為“涉及mRNA翻譯增強因子的組合物和方法”的分案申請。
[0002]優(yōu)先權(quán)文件的引用
[0003]根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)，本申請要求2007年12月11日遞交的美國臨時專利申請系列號61 / 007，440的優(yōu)先權(quán)。前述申請的申請日在此作為本申請的 優(yōu)先權(quán)日:，上述臨時專利申請公開的內(nèi)容在此通過引證全部并入本文。
【背景技術(shù)】
[0004]在真核生物中，翻譯過程開始于40S核糖體亞基招募之后，可以通過m7G封端結(jié)構(gòu)發(fā)生，或者通過封端獨立機制發(fā)生，其中所述m7G封端結(jié)構(gòu)是一種在mRNA的5’末端發(fā)現(xiàn)的修飾的核苷酸。通過封端獨立機制發(fā)生的翻譯過程被定義為翻譯過程的內(nèi)部啟動，可以通過多種不同的機制來調(diào)節(jié)。通過其它機制完成招募之后，40S核糖體亞基移動到一種啟動密碼子處，在這里，加入60S核糖體亞基，開始肽合成。包含位于mRNA5’和3’末端非編碼片段的序列因子能夠影響翻譯啟動的作用。能夠增強封端依賴性mRNA翻譯作用效果的序列因子被命名為翻譯增強因子(TEE)。[0005]一些翻譯增強因子(TEE)通過特定的機制增強翻譯啟動作用，所述機制包括與RNA的組成部分，包括40S核糖體亞基、18S核糖體RNA (rRNA)的堿基配對。一些翻譯增強因子(TEE)還可以起到和核糖體招募為點的作用，能夠促進翻譯的內(nèi)啟動；但是，絕大多數(shù)內(nèi)部核糖體進入位點(IRESe)不能起到翻譯增強因子(TEE)的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]在本領(lǐng)域內(nèi)存在對更多的翻譯增強因子(TEE)的需要，在生物技術(shù)和基因療法中，翻譯增強因子(TEE)能夠用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)。這里公開的內(nèi)容滿足了這一需要和其它需要。
[0007]在一個方面，這里提供了分離的或合成的聚核苷酸序列，這種聚核苷酸序列可以作用翻譯增強因子(TEE)并且包括至少一個mRNA翻譯增強因子(TEE)。所述聚核苷酸序列中存在的翻譯增強因子(TEE)由 RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO:1)或者 MSCSGCNGM WA (SEQ IDNO:2)、或者其基本上相同的序列組成。同樣，在這些聚核苷酸序列中可以包括每種翻譯增強因子(TEE)的一個以上拷貝(例如2個、5個、10個、25個、50個或者更多的拷貝)。
[0008]在一個實施方案中，翻譯增強因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO:3)或者R具S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO:4)、或者其基本上相同的序列組成。在這些序列中，Ri是缺失，如果存在的話，是A或者G A1是缺失，如果存在的話，是A、C或者G，優(yōu)選是A、C、或者G ;Si是缺失，如果存在的話是C或者G,優(yōu)選是C或者G W1是A或者C ；R2是缺失，如果存在的話，是A或者G，優(yōu)選是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的話，是A或者C，優(yōu)選是A或者C ；R3是缺失，如果存在的話，是A或者G，優(yōu)選是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優(yōu)選是缺失；并且，R5是缺失，如果存在的話，是A，優(yōu)選是缺失;M3是缺失，如果存在的話，是C或者A，優(yōu)選是C或者A ；S2是缺失，如果存在的話，是C或者G,優(yōu)選是C或者G ;S3是G或者C ；N2是G、C或者T ;M4是A或者C ；ff是缺失，如果存在的話是A或者T ；R6是缺失，如果存在的話是A。
[0009]在另一個實施方案中，翻譯增強因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4組成。在這個序列中，Rp R3和R4是缺失A1是A、C或者G5S1是C或者G5M1是A或者C5R2是A或者G并且，M2是A或者C。在另一個實施方案中，翻譯增強因子(TEE)由R具S2CS3GCN2GM4WR6組成。在這個序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的話是A或者C ;S2是C或者G ；S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ；ff是缺失，如果存在的話是A。
[0010]在一些實施方案中，聚核苷酸序列包括一種翻譯增強因子(TEE)，這種翻譯增強因子(TEE)具有的序列與SEQ ID NO:5-35所示序列有至少90%的一致性。在一些實施方案中，聚核苷酸序列包括一種翻譯增強因子(TEE)，這種翻譯增強因子(TEE)具有的序列與SEQ ID NO:5_35所不序列中的一種一致。
[0011]在一些聚核苷酸序列中，至少存在兩個拷貝的翻譯增強因子(TEE)。在一些聚核苷酸序列中，存在超過2個拷貝的翻譯增強因子。在一些或者其它實施方案中，所述聚核苷酸序列包括至少5個拷貝的翻譯增強因子(TEE)、至少10個拷貝的翻譯增強因子(TEE)、至少25個拷貝的翻譯增強因子(TEE)。
[0012]在一個相關(guān)方面，這里提供了用于在真核細(xì)胞中重組表達(dá)多肽的克隆或者表達(dá)載體。這種載體包括一種真核啟動子，這種真核啟動子與一種聚核苷酸序列可操作的相連，所述聚核苷酸序列包括至少一個這里公開的mRNA翻譯增強因子(TEE)。載體中存在的翻譯增強因子(TEE)由 RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO:1)或者 MSCSGCNGM WA(SEQ ID NO:2)、或者其基本上相同的序列組成。
[0013]在一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO:3)或者 R5M3S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO:4)、或者其基本上相同的序列組成。在這些序列中，R1是缺失，如果存在的話，是A或者G A1是缺失，如果存在的話，是A、C或者G，優(yōu)選是A、C、或者G A1是缺失，如果存在的話是C或者G，優(yōu)選是C或者G W1是A或者C ；R2是缺失，如果存在的話，是A或者G，優(yōu)選是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的話，是A或者C，優(yōu)選是A或者C ；R3是缺失，如果存在的話，是A或者G，優(yōu)選是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優(yōu)選是缺失；并且，R5是缺失，如果存在的話，是A，優(yōu)選是缺失;M3是缺失，如果存在的話，是C或者A，優(yōu)選是C或者A ；S2是缺失，如果存在的話，是C或者G,優(yōu)選是C或者G ;S3是G或者C ；N2是G、C或者T ;M4是A或者C ；ff是缺失，如果存在的話是A或者T ；R6是缺失，如果存在的話是A0
[0014] 在另一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4組成。在這個序列中,R1、R3和R4是缺失A1是A、C或者G J1是C或者G 是A或者C ;R2是A或者G并且，M2是A或者C。在另一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE)由R具S2CS3GCN2GM4WR6組成。在這個序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的話是A或者C ;S2是C或者G ;S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ；ff是缺失，如果存在的話是A。[0015]在一些載體中，這種翻譯增強因子(TEE)具有的序列與SEQ ID NO:5_35所示序列基本一致。在一些載體中，這種翻譯增強因子(TEE)具有的序列與SEQ ID NO:5-35所示序列中的一種一致。
[0016]在一些載體中，所述mRNA翻譯增強因子位于啟動子的3’端并且能夠與編碼所關(guān)心的多肽的第二聚核苷酸序列直接連接。這些載體中的一些進一步包括一種第二聚核苷酸序列，這種第二聚核苷酸序列能夠編碼所關(guān)心的多肽，這種所關(guān)心的多肽與mRNA翻譯增強因子可操作的相連。在一些載體中，mRNA翻譯增強因子位于第二聚核苷酸序列的5’前導(dǎo)序列中。這里進一步提供了 DNA疫苗，這種DNA疫苗包括一種載體，能夠表達(dá)這里描述的所關(guān)心的抗原。這里進一步提供了一種宿主細(xì)胞(即，真核宿主細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞)，這種宿主細(xì)胞被載體轉(zhuǎn)染。
[0017]在進一步的方面，這里提供了重組制備所關(guān)心的多肽的方法。這些方法包括，構(gòu)建一種表達(dá)載體，這種表達(dá)載體包括一種真核啟動子和至少一個拷貝(例如，1、2、3、4、5、10、25,50或更多拷貝)的mRNA翻譯增強因子，每個都與編碼所關(guān)心多肽的聚核苷酸可操作的相連。隨后，將所得表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進入真核宿主細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞中)，并且培養(yǎng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。在一個實施方案中，在載體中存在的mRNA翻譯增強因子(TEE)由RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO:1)或者 MSCSGCNGM WA(SEQ ID NO:2)、或者其基本上相同的序列組成。[0018]在一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO:3)或者 R5M3S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO:4)、或者其基本上相同的序列組成。在這些序列中，R1是缺失，如果存在的話，是A或者G A1是缺失，如果存在的話，是A、C或者G，優(yōu)選是A、C、或者G A1是缺失，如果存在的話是C或者G，優(yōu)選是C或者G W1是A或者C ；R2是缺失，如果存在的話，是A或者G，優(yōu)選是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的話，是A或者C，優(yōu)選是A或者C ；R3是缺失，如果存在的話，是A或者G，優(yōu)選是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優(yōu)選是缺失；并且，R5是缺失，如果存在的話，是A，優(yōu)選是缺失;M3是缺失，如果存在的話，是C或者A，優(yōu)選是C或者A ；S2是缺失，如果存在的話，是C或者G,優(yōu)選是C或者G ;S3是G或者C ；N2是G、C或者T ;M4是A或者C ；ff是缺失，如果存在的話是A或者T ；R6是缺失，如果存在的話是A0
[0019]在另一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4組成。在這個序列中,R1、R3和R4是缺失A1是A、C或者G J1是C或者G 是A或者C ;R2是A或者G并且，M2是A或者C。在另一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE)由R具S2CS3GCN2GM4WR6組成。在這個序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的話是A或者C ;S2是C或者G ;S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ；ff是缺失，如果存在的話是A。
[0020]這種翻譯增強因子(TEE)具有的序列與SEQ ID NO:5_35所示序列基本一致。在一些載體中，這種翻譯增強因子(TEE)具有的序列與SEQ ID NO:5-35所示序列中的一種一致。這些方法中的一些還可以進一步包括從宿主細(xì)胞或者從被培養(yǎng)宿主細(xì)胞周圍的培養(yǎng)基中純化表達(dá)的重組多肽。使用這里描述的方法可以生產(chǎn)多種所關(guān)心的多肽。例如，這里所描述的方法適用于許多在臨床上十分重要的治療劑蛋白質(zhì)。[0021]通過參考本發(fā)明說明書的其它部分和權(quán)利要求書，可以實現(xiàn)對本發(fā)明特點和優(yōu)勢
的進一步理解。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是一種示意圖，代表了翻譯增強正反饋載體以及不同的啟動子(PI)和轉(zhuǎn)錄增強子(P2)、轉(zhuǎn)錄因子(TF)基因和所關(guān)心的蛋白。
[0023]圖2是一種示意圖，代表了圖1所示的翻譯增強正反饋載體與一種第三蛋白阻礙宿主蛋白質(zhì)合成。
[0024]圖3顯示了與大小吻合的參照構(gòu)建物活性相比，5到25拷貝的各種翻譯增強因子在CHO細(xì)胞中翻譯增強作用的翻譯增強活性。
[0025]圖4顯示了從不同的翻譯增強因子(TEE)中衍生的一致性模體。
[0026]圖5顯示了相對于大小吻合的參照構(gòu)建物活性，根據(jù)模體序列I (SEQ ID NO:1)或者模體序列2 (SEQ ID NO:2)的合成序列的翻譯增強活性。
【具體實施方式】
[0027]1.概述
[0028]在這里公開的是一種新型的mRNA翻譯增強因子(TEE)。具體的說，如隨后實施例中詳細(xì)描述的，這里識別的是一些短核苷酸序列，這種短核苷酸序列能夠增強哺乳動物宿主細(xì)胞(例如，CHO和BHK細(xì)胞系)中的翻譯作用。這里公開的是來自這種短核苷酸序列的一致性模體或者翻譯增強因子。在一個實施方案中，模體I是RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO:1)，模體2是MSCSGCNGMWA(SEQ ID NO:2)。據(jù)顯示，在這些序列中，R代表A或者G ;M代表A或者C ;S代表G或者C ;W代表A或者U⑴；并且N代表A、G、C或者U⑴。
[0029]在其他的實施方案中，模體I是R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO:3)。在這一序列中，R1是缺失，如果存在的話，是A或者G A1是缺失，如果存在的話，是A、C或者G，優(yōu)選是A、C、或者G ;Si是缺失，如果存在的話是C或者G,優(yōu)選是C或者G W1是A或者C ；R2是缺失，如果存在的話，是A或者G，優(yōu)選是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的話，是A或者C，優(yōu)選是A或者C ；R3是缺失，如果存在的話，是A或者G，優(yōu)選是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優(yōu)選是缺失。在另一個實施方案中，模體I是R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO:3)，其中札、R3、R4 是缺失，N1 是 A、C 或者 G J1 是 C 或者G W1是A或者C ；R2是A或者G并且M2是A或者C。
[0030]在另一個實施方案中，模體2是R具S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO:4)。在此序列中，R5是缺失，如果存在的話，是A，優(yōu)選是缺失；M3是缺失，如果存在的話，是C或者A，優(yōu)選是C或者A ；S2是缺失，如果存在的話，是C或者G，優(yōu)選是C或者G ;S3是G或者C ;N2是G、C或者T ;M4是A或者C ；ff是缺失，如果存在的話是A或者T ；R6是缺失，如果存在的話是A。在另一個實施方案中，模體2是R具S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO:4)。在此序列中，R5和R6是缺失;M3是缺失，如果存在的話是A或者C ;S2是C或者G ;S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ；ff是缺失，如果存在的話是A。
[0031]此外，這里公開了根據(jù)一致性模體合成的其他一些具體序列(例如，SEQ ID NOs:5-35)。這些合成的序列不表示在用于識別模體序列的序列中。這些合成的序列顯示增強的翻譯活性。包含一個或者多個這些序列拷貝的聚核苷酸序列能夠提高翻譯作用25倍。
[0032]這里公開了翻譯增強子，這種翻譯增強子是分離的或者基本上純的多聚核苷酸(例如，DNA)，包括至少一個這里公開的mRNA翻譯增強因子(TEE)的一種或者一種以上拷貝。當(dāng)與一種編碼所關(guān)心多肽的多聚核苷酸可操作的相連時，這種多聚核苷酸可以起到翻譯增強子的作用。示例性的翻譯增強因子(TEE)顯示在SEQ ID NOS:1-35中。請注意，盡管這里描述的翻譯增強因子(TEE)處于脫氧核糖核苷酸序列中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易理解，翻譯增強因子(TEE)或者包括所述翻譯增強因子(TEE)的多聚核苷酸還可以包括相應(yīng)的核糖核苷酸序列。這里還提供了克隆載體或者表達(dá)載體，所述載體包括這里公開的翻譯增強因子(TEE)或者翻譯增強子多聚核苷酸，以及懷有這些載體的宿主細(xì)胞。這里進一步提供了使用這種翻譯增強因子(TEE)、所述翻譯增強子多聚核苷酸和所述表達(dá)載體來增強翻譯作用并產(chǎn)生所需多肽(例如，一種治療劑蛋白)的方法。
[0033]除非另有陳述，這里公開的方法使用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)方法、細(xì)胞生物學(xué)方法、生物化學(xué)方法和免疫學(xué)方法，這些方法包括在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的范圍內(nèi)。這些技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)文獻中有很好的闡述，例如，下列參考文獻描述了示范性的方法:Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press (3rded.，2001) ；Brent et ah, Current Protocolsin Molecular Biology (分子生物學(xué)現(xiàn)有方案)，John Wiley&Sons，Inc.(Ringbou ed.，2003);和 Freshney，Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique (動物細(xì)胞培養(yǎng):基礎(chǔ)技術(shù)手冊)，Wiley-Liss, Inc.(4thed.,2000).[0034]2.定義
[0035]本說明書并不局限于這里描述的具體的工藝、方案和試劑，可以存在變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，這里使用的術(shù)語只起到描述具體的實施方案的目的，并不打算作為對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍有所附權(quán)利要求書來描述。
[0036]如這里使用的，除非上下文另有明確定義，否則單數(shù)形式“一種(a)” “一個(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)意義。因此，例如，“一種細(xì)胞”包括這種細(xì)胞的復(fù)數(shù)形式，提到“一種蛋白”包括一種或一種以上的蛋白質(zhì)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等同物，以此類推。
[0037] 除非另有定義，否則所有這里使用的科學(xué)技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的意義。下列參考文獻向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供了許多這里所公開術(shù)語的通用定義:Academic Press Dictionary of Science and Technology (學(xué)術(shù)出版社的科學(xué)技術(shù)詞典)，Morris (Ed.)，Academic Press (學(xué)術(shù)出版社)(lsted.，1992)；Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (生物化學(xué)和分子生物學(xué)牛津詞典)，Smith et al.(Eds.)，Oxford University Press (牛津大學(xué)出版社)(revised ed., 2000) ；Encyclopaedic Dictionary of Chemistry (化學(xué)百科全書詞典)，Kumar(Ed.), Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002) ；Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology (微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典)，Singleton et al.(Eds.)，John Wiley&Sons (3rded., 2002) ；Dictionary of Chemistry (化學(xué)詞典)，Hunt (Ed.),Routledge (lsted.，1999) dictionary of Pharmaceutical Medicine (藥物醫(yī)學(xué)辭典)，Nahler (Ed.), Springer-Verlag Telos (1994) ；Dictionary of Organic Chemistry (有機化學(xué)詞典)，Kumar and Anandand(Eds.), Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002)；and A Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference), Martin and Hine(Eds.),Oxford University Press (4thed., 2000).這里提供了專用于本發(fā)明公開內(nèi)容的術(shù)語的進一步的介紹。
[0038]這里使用的術(shù)語“試劑”包括任何物質(zhì)、分子、因子、化合物、單位或者他們的結(jié)合。他包括但不局限于，例如，蛋白質(zhì)、多肽、小有機分子、多聚糖、多聚核苷酸等等。他可以是一種天然產(chǎn)物、一種合成的化合物、或者一種化學(xué)化合物，或者兩種或更多種物質(zhì)的結(jié)合。除非另有規(guī)定，術(shù)語“試劑”、“物質(zhì)”和“化合物”可以互換使用。
[0039]這里使用的術(shù)語“作用子”是指一種DNA單元，能夠編碼單一多肽或者蛋白質(zhì)。術(shù)語“翻譯單元”是指一種DNA片段，在此片段中，能夠發(fā)生RNA的合成。
[0040]術(shù)語“DNA疫苗”是指一種DNA，這種DNA可以被引入到一種宿主細(xì)胞或者組織中，并且在其中通過細(xì)胞進行表達(dá)，從而產(chǎn)生一種信使核糖核酸(mRNA)分子，信使核糖核酸(mRNA)分子隨后被翻譯,從而產(chǎn)生一種DNA編碼的疫苗抗原。
[0041]術(shù)語“所關(guān)心的基因”包括一種作用子、一種開放閱讀框(ORF)或者一種密碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物(所關(guān)心的蛋白質(zhì))的多聚核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物(所關(guān)心的蛋白質(zhì))的生產(chǎn)可以通過翻譯增強因子(TEE)調(diào)節(jié)。所關(guān)心的基因的實施例包括編碼治療劑蛋白質(zhì)的基因、編碼營養(yǎng)蛋白質(zhì)的基因和編碼工業(yè)有效蛋白質(zhì)的基因。所關(guān)心的基因還可以包括報道基因或者可選擇的標(biāo)記物基因，例如，增強綠色熒光的蛋白質(zhì)(EGFP)、熒光素酶基因(Renilla 或者 Photinus)。[0042]表達(dá)作用是一種過程，通過這種過程由DNA產(chǎn)生蛋白質(zhì)。該過程包括基因轉(zhuǎn)錄變成mRNA和隨后的mRNA翻譯變成一種多肽。
[0043]這里使用的術(shù)語“內(nèi)源性”是指一種通常發(fā)現(xiàn)在野生型宿主體內(nèi)的基因，而這里使用的術(shù)語“外源性”是指通常不能在野生型宿主體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的基因。
[0044]這里使用的“宿主細(xì)胞”涉及一種活細(xì)胞，在這種活細(xì)胞中，異源多聚核苷酸序列能夠被引入或者已經(jīng)被引入。所述活細(xì)胞包括經(jīng)過培養(yǎng)的細(xì)胞和活組織內(nèi)部的細(xì)胞。向細(xì)胞中引入異源多聚核苷酸序列的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，例如，轉(zhuǎn)染方法、電穿孔方法、磷酸鈣沉淀、微量注射法、轉(zhuǎn)化方法、病毒傳染法、和/或其他方法。通常，所述被引入細(xì)胞中的異源多聚核苷酸序列是一種可復(fù)制的表達(dá)載體或者克隆載體。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞可以被設(shè)計并在其染色體或者基因組上合成一種需要的基因。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的許多宿主細(xì)胞都可以被使用(例如，CHO細(xì)胞)作為宿主。例如，參見SambiOoket al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室操作指南)，ColdSpring Harbor Press (冷泉港出版社)(3red., 2001) JPBrent et al,Current Protocolsin Molecular Biology (分子生物學(xué)現(xiàn)有方案)，John Wiley&Sons, Inc.(ringbou ed.,2003).。在一些實施方案中，所述宿主細(xì)胞是一種真核細(xì)胞。
[0045]這里使用的術(shù)語“同系物”是指一種序列，這種序列與參照序列(例如，這里公開的特異性mRNA翻譯增強因子)具有基本上一致的結(jié)構(gòu)(例如，核苷酸序列)。通常，所述同系物能夠維持增強所關(guān)心的基因編碼的mRNA翻譯作用的能力。通過在如上所述的參照序列上制造突變，在表達(dá)載體上適當(dāng)?shù)奈恢貌迦胪蛔冃蛄胁⑦M行活性篩選同系物，所述表達(dá)載體包括一種啟動子，所述啟動子可操作的與一種報道基因或者所關(guān)心的基因相連接。然后，可以將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，從而檢測基因編碼的蛋白質(zhì)的翻譯作用。如果報道基因的翻譯與在參照增強子序列控制的情況下報道基因的翻譯作業(yè)相同的話，突變序列就是一種功能性的同系物。
[0046]術(shù)語"誘導(dǎo)劑"是用來指那些從一種可誘導(dǎo)翻譯的調(diào)節(jié)因子來影響翻譯的一種化學(xué)的、生物學(xué)的或物理的試劑。作為對誘導(dǎo)劑的響應(yīng)，從該元件的翻譯通常從頭開始或提高表達(dá)的基本的或組成水平。誘導(dǎo)劑可以是，例如，細(xì)胞遭受一種應(yīng)激狀態(tài)，例如，一種熱或冷沖擊，一種毒劑例如一種重金屬離子，或一種營養(yǎng)，激素，生長因子，等等的缺乏；或者可以是一種化合物，這種化合物是那些影響細(xì)胞的生長或者分化狀態(tài)的物質(zhì)，例如一種激素或者一種生長因子。
[0047]慣用語"分離的或者純化的多聚核苷酸"意思是包含一個多聚核苷酸序列(例如，DNA)，這個多聚核苷酸序列是從自然存在的有機體的基因組中立即連接的序列的兩頭分離到的。純化的多聚核苷酸可以是一種雙鏈或者單鏈的寡聚核苷酸；結(jié)合進載體的一種多聚核苷酸片段；一種被插入到真核的或者原核生物的基因組中的片段；或者是用作探針的一種片段，慣用語"基本上純的，"當(dāng)指一種多聚核苷酸時，意思是該分子已經(jīng)與其他的伴隨的生物組分分離開的，所以，一般地，在一個樣品中它至少有百分之85或者更大的百分比。
[0048] 術(shù)語“核苷酸序列”，“核酸序列”，“核酸”，或者“多聚核苷酸序列”，指的是一種脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸聚合物，它是單鏈的或者是雙鏈的形式，并且除非另外限定，包含那些以類似于自然地存在核苷酸的方式雜交到核酸中的已知的自然的核苷酸的類似物。核苷酸序列可以是，例如，原核生物的序列，真核生物的信使核糖核酸序列，來自真核生物的信使核糖核酸的互補DNA序列，來自真核生物的脫氧核糖核酸的基因組脫氧核糖核酸序列(例如，哺乳動物脫氧核糖核酸)，和合成的脫氧核糖核酸或者核糖核酸序列，但并不限于這些。
[0049]術(shù)語“啟動子”意思是一種能夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄并且是在轉(zhuǎn)錄的起始的核苷酸序列。各種各樣的啟動子序列在本領(lǐng)域中是已知的。這些因子可以包含，但不局限于，TATA-盒子，CCAAT-盒子，噬菌體核糖核酸聚合酶特異的啟動子(例如，T7，SP6，和T3啟動子)，一種SPl位點，和一種環(huán)AMP響應(yīng)因子。如果該啟動子是可誘導(dǎo)的類型，則它的活性隨誘導(dǎo)劑而增加。
[0050]五個主要的引物或者未翻譯的區(qū)域(5'引物，5'引物序列或者5' UTR)是一種特殊的的信使核糖核酸(mRNA)和編碼它的脫氧核糖核酸的片段。它起始于+1位點(轉(zhuǎn)錄開始的位置)并且剛好在編碼區(qū)域的起始密碼子(通常是AUG)前結(jié)束。在細(xì)菌中，它可能包含通常所說的Shine-Delgarno序列的一種核糖體結(jié)合部位(RBS)。5'引物可能是一百或更長的核苷酸，并且3，UTR可能更長(直至幾千個K堿基長)。
[0051]術(shù)語“可操作地連接”或者“可操作地聯(lián)系”指的是遺傳因子之間功能的連接，它們以一種那些能使它們進行它們正常的功能的方式來連接。例如，當(dāng)一個基因的轉(zhuǎn)錄在啟動子的控制之下它可操作地連接到該啟動子上并且產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是正確地被轉(zhuǎn)換為由該基因正常地編碼的蛋白質(zhì)。同樣地，如果它允許上調(diào)由該基因轉(zhuǎn)錄的信使核糖核酸的翻譯，翻譯增強因子可操作地與所關(guān)心的基因相聯(lián)系。
[0052]適合于定向連接反應(yīng)的核苷酸序列，例如，多酶連接子，是那些提供了位點或者將一個多聚核苷酸序列定向連接成載體的一種表達(dá)載體的一個區(qū)域。一般地，一種定向多酶連接子是一種核苷酸序列，它定義為兩個或更多限制性核酸內(nèi)切酶識別序列，或者限制位點。當(dāng)限制分裂時，這兩個位點產(chǎn)生粘性末端這樣多聚核苷酸序列可以連接到表達(dá)載體上。在一種實施方案中，當(dāng)限制分裂時，這兩個限制酶切位點提供了粘性末端也就是說非互補的并且因此允許定向插入一種多聚核苷酸序列到盒子中。例如，適合于定向連接的核苷酸序列可以包含一種核苷酸序列，它定義為多次定向克隆方法。適合于定向連接的核苷酸序列的位置定義為多限制酶切位點，它稱為一個多克隆位點。
[0053]對治療來說的術(shù)語“患者”指的是分類為哺乳動物的任何動物，例如，人和非人的哺乳動物。非人類的動物的實例包含狗，貓，牛，馬，綿羊，豬，山羊，兔，等等。除了注解的時候外，術(shù)語“病人”或者“患者”在這里可互換使用。在一種實施方案中，患者是人。
[0054]轉(zhuǎn)錄因子指的是那些要求開始或者調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的任何多肽。例如，這些因子包含，但不局限于，c-Myc, c-Fos, c-Jun, CREB, cEts, GATA, GAL4, GAL4 / Vpl6, c-Myb, MyoD,NF-κ B，細(xì)菌噬菌體-特異核糖核酸聚合酶，Hif-Ι，和TRE。編碼這些因子的序列的實例包含，但不局限于，基因銀行登記號 K02276 (c-Myc)，K00650 (c-fos)，BC002981 (c-Jun)，M27691(CREB)，X14798 (cEts)，M77810(GATA)，K01486 (GAL4)，AY136632 (GAL4 / Vp16)，M95584(c-Myb)，M84918(MyoD)，2006293A (NF-κ B)，NP853568(SP6RNA 聚合酶)，AAB28111 (T7RNA 聚合酶)，NP523301 (T3RNA 聚合酶)，AF364604 (HIF-1)，and X63547 (TRE)。
[0055]一種“基本上相同的”核苷酸或者氨基酸序列指的是一種核苷酸或者氨基酸序列，它包含一種序列，其至少90%的序列與通過在這里所描述的眾所周知的程序(例如，BLAST)使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)來測定的對照序列相同。這些序列同一性可以是至少95%，至少98%，和至少99%。在一些實施方案中，患者序列具有同對照序列相比大致一樣的長度，那就是說，那就是說，由大致一樣數(shù)量的連續(xù)的氨基酸殘基(對于多肽序列)或者核苷酸殘基(對于多聚核苷酸序列)組成。
[0056]序列同一性可以很容易地用本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的各種各樣的方法來確定。例如，BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用缺省字長(W) 11，期望值(E)10，M=5，N=-4，來對兩條鏈作比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用缺省字長(W)3，期望值(E)10JPBL0SUM62評分矩陣(參見 Henikoff&HenikofT，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915 (1989))。序列同一性的百分比通過在一個比較窗口上比較兩個最佳地-定位序列來確定，為了這兩個序列最佳的定位在這里比較窗口中多聚核苷酸序列部分與對照序列(它不包含增加的部分或者刪除部分)相比可能包含增加的部分或者刪除部分(也就是，缺口)。百分比的計算由位點的數(shù)目來確定，在這些位點處存在于這兩個序列中的相同的核酸堿基或者氨基酸殘基來得到匹配位點的數(shù)目，將匹配位點的數(shù)目除以比較窗口中總的位點數(shù)目并且將結(jié)果乘以100來得到序列同一性的百分比。
[0057]術(shù)語“翻譯增強因子(TEE) ”指的是那些增加由信使核糖核酸產(chǎn)生的多肽或者蛋白質(zhì)的數(shù)量，高于由于單獨的帽子結(jié)構(gòu)的翻譯水平的順式活性序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的TEE的實例包含Gtx同源結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的5'引物中的序列(Chappell等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOl =9590-9594, 2004) ? 另外，在這里所公開的新的 TEE，例如，SEQ ID NO:1-35。除非另作說明，TEE指的既是信使核糖核酸序列中的翻譯增強因子也是脫氧核糖核酸序列中相應(yīng)的編碼序列因子。
[0058]“翻譯增強子多聚核苷酸”或者“翻譯增強子多聚核苷酸序列”是包含一種或多種這里所示例的特異的TEE(也就是，SEQ ID NO:1-35)或者它們的變體，同源物或者功能衍生物的多聚核苷酸。一種特異的TEE的一個或者多拷貝可以存在于該多聚核苷酸中。翻譯增強子多聚核苷酸中的TEE可以組成一個或者多個序列片段。一個序列片段可以懷有一種或多種這里所示例的特異的TEE，每隔TEE均已一個或者多個拷貝的形式存在。當(dāng)多重序列片段存在于一種翻譯增強子多聚核苷酸中時，他們可以是同源的或者異源的。因此一種翻譯增強子多聚核苷酸中的多重序列片段可以懷有相同的或者不同的類型的在這里所示例的特異的TEE，每一個特異的TEE的拷貝份數(shù)是相同的或者不同的，并且/或者每個序列片段內(nèi)的TEE是相同的或者不同的組成。
[0059]術(shù)語“治療”或者“減輕”包含化合物或者藥劑的給藥患者來防止或者延緩一種疾病(例如，一種心臟機能障礙)的癥狀，并發(fā)癥，或者生化的征候，減輕這些癥狀或者阻止或者抑制該疾病，狀態(tài)或者病癥的進一步的發(fā)展。需要治療的患者包含已經(jīng)遭受該疾病或者病癥以及那些有該病癥傾向的或者那些將預(yù)防該病癥的病人。
[0060]治療可以在該疾病后顯現(xiàn)預(yù)防(預(yù)防或者延緩該疾病的發(fā)病，或者預(yù)防它的臨床的或者臨床癥狀不顯的癥狀的顯現(xiàn))或者治療的抑制或者減輕癥狀。在心臟重塑和/或心力衰竭的治療中，一種治療劑可以直接減少該疾病的病狀，或者致使該疾病對其他的治療劑的治療更敏感。
[0061]術(shù)語“載體”或者“構(gòu)造”指的是多聚核苷酸序列因子以一種固定的組織類型排列以致與這些因子可操作地連接的基因/基因產(chǎn)物的表達(dá)可以預(yù)見地控制。一般地，他們是可傳染的多聚核苷酸序列(例如，質(zhì)?；蛘卟《?，一種外來的脫氧核糖核酸片段可以接合到這些多聚核苷酸序列中以便將外來的脫氧核糖核酸引入到宿主細(xì)胞來加速它的復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄。
[0062]克隆載體是是一種脫氧核糖核酸序列(一般為一種質(zhì)?；蛘呤删w)，它能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，并且它具有一個或者少量的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點。一種外來的脫氧核糖核酸片段可以在這些位點接合進該載體以便該片段的復(fù)制和克隆。該載體可以包含一種或多種標(biāo)記來用于識別轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。例如，標(biāo)記可以提供了四環(huán)素或者氨芐青霉素抗性。
[0063]表達(dá)載體類似于克隆載體但是它在轉(zhuǎn)化進入宿主后能夠誘導(dǎo)那些已經(jīng)克隆到該載體中的脫氧核糖核酸的表達(dá)。被克隆的脫氧核糖核酸通常受某些調(diào)節(jié)的序列例如啟動子或者增強子的控制(也就是，可操作的聯(lián)系到)。啟動子序列可以是結(jié)構(gòu)的，可誘導(dǎo)的或者可抑制的。
[0064]表達(dá)載體類似于克隆載體但是它在轉(zhuǎn)化進入宿主后能夠誘導(dǎo)那些已經(jīng)克隆到該載體中的脫氧核糖核酸的表達(dá)。被克隆的脫氧核糖核酸通常受某些調(diào)節(jié)的序列例如啟動子或者增強子的控制(也就是，可操作地連接到)。啟動子序列可以是結(jié)構(gòu)的，可誘導(dǎo)的或者可抑制的。
[0065]II1.翻譯增強子多聚核苷酸和重組載體
[0066] 在這里提供了分離或者基本上純化的作為翻譯增強子功能的多聚核苷酸。這些翻譯增強子多聚核苷酸包含治這里所公開的特異的信使核糖核酸翻譯增強子因子(TEE)或者它們的變體，同源物或者功能性的衍生物。翻譯增強子多聚核苷酸可以包含一種或多種序列片段，這些序列片段包含一致的Motifl (SEQ ID NO:1)，Motif2 (SEQ ID NO:2),Motifla(SEQ ID NO:3)，或者Motif2a(SEQ ID NO:4)。一些翻譯增強子多聚核苷酸可以包含一種或多種序列片段，這些序列片段包含如SEQ ID NO:5-35所示的特異的信使核糖核酸TEE的一個。如下面的實例所證明的，那些懷有這些信使核糖核酸TEE中的一個的載體中所關(guān)心的多肽的表達(dá)導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量顯著的增加。除了如SEQ ID NO:135所示的信使核糖核酸TEE之外，信使核糖核酸TEE也可以包含序列，這些序列基本上和這些例證序列的一個一致并且可以保持在宿主細(xì)胞中所關(guān)心的一種可操作地連接的基因的表達(dá)增強的基本的功能特性。
[0067]翻譯增強子多聚核苷酸中的序列片段可以包含如SEQ ID NO:1_35所示的僅僅一個特異的信使核糖核酸TEE或者幾個信使核糖核酸TEE。存在于一種序列片段中的每一個特異的信使核糖核酸TEE，該序列片段中只能僅有該信使核糖核酸TEE的一個拷貝。替代地，每一個信使核糖核酸TEE的多拷貝可以存在于各自的序列片段中。一般地，翻譯增強子多聚核苷酸中不同的信使核糖核酸TEE因子可以是操作上連接的彼此靠近或者被那些長度I到大約100核苷酸不等的間隔核苷酸序列分開。一些翻譯增強子多聚核苷酸包含僅僅一個序列片段。其它的翻譯增強子多聚核苷酸包含大量的序列片段。在后面的實施方案中，該序列片段可以是同源的或者異源的。[0068]因此，一些實施方案涉及一種翻譯增強子多聚核苷酸序列片段，它包含一種信使核糖核酸TEE序列，這些信使核糖核酸TEE序列與如SEQ ID NO: 1-35所示的序列的一個一樣或者基本上一致。其它的實施方案涉及一種翻譯增強子多肽序列片段，它包含如SEQ IDNO: 1-35所示的一種特異的信使核糖核酸TEE的2，3，4，5，10，25，50或更多拷貝。在一些實施方案中，該翻譯增強子多聚核苷酸涉及一種序列片段，它包含超過一個(例如，2，3,4,5，或更多)如SEQ ID NO:1-35所示的不同的信使核糖核酸TEE或者它們的變體或者同源物。在這些實施方案中，每一個特異的信使核糖核酸TEE可以以一種或多種拷貝(例如，2，3，4，5，10，25或更多拷貝)的形式存在。在其它的實施方案中，該翻譯增強子多聚核苷酸包含超過一個上面注解的序列片段。不同的序列片段可以按照特異的信使核糖核酸的類型和每個特異的信使核糖核酸TEE所懷有的拷貝數(shù)目來一致。替代地，多重序列片段可以在特異的信使核糖核酸TEE的類型和/或每個特異的信使核糖核酸TEE的拷貝數(shù)目上有所不同。在任何實施方案中，除了如SEQ ID NO:1-35所示的信使核糖核酸TEE外，這些特異的TEE的變體或者帶有基本上一致的序列的同源物也是能使用的。
[0069]在此公開的特異的信使核糖核酸TEE或者翻譯增強子多聚核苷酸可用于構(gòu)造重組克隆載體或者表達(dá)載體。這些載體對于表達(dá)所關(guān)心的多肽或者蛋白質(zhì)是非常有用的，例如，一種治療的蛋白質(zhì)。他們還可以用于治療的應(yīng)用例如脫氧核糖核酸疫苗或者基因治療。重組載體可以由一種質(zhì)粒，病毒或者其他的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的載體通過插入或者結(jié)合這里所描述的特異的信使核糖核酸TEE或者翻譯增強子多聚核苷酸的一個或者多個來構(gòu)建。這些載體的實例在下面的實施例中會討論到。一般地，該載體包含一種適合于表達(dá)一種宿主細(xì)胞(例如，哺乳動物宿主細(xì)胞)中所關(guān)心的多肽的啟動子。在該載體中，一種包含TEE的序列是可操作地連接到該啟動子，例如，在3'到該啟動子。序列片段包含如上所述的一種TEE或者一種翻譯增強子多聚核苷酸。該載體另外可以懷有一種適合于編碼所關(guān)心的多肽的多聚核苷酸序列的定向連接的核苷酸的序列。例如，一種多酶連接子可以用于克隆該多聚核苷酸序列以便該克隆序列可操作地連接到該啟動子和包含TEE的序列并且置于該啟動子和包含TEE的序列的控制之下。多酶連接子是那些可以有一系列的三或更多間距小的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列的多聚核苷酸序列(參見，例如，Sambrook等，supra)。在一些實施方案中，如實施例中所闡述的，該載體允許多聚核苷酸序列克隆進該載體某一位置以便TEE存在于編碼所關(guān)心的多肽的轉(zhuǎn)錄信使核糖核酸的5'引物端。
[0070]除了啟動子和包含TEE的序列之外，在這里所描述的一些重組載體進一步地包含所關(guān)心的一種基因或者編碼所關(guān)心的一種蛋白質(zhì)或者一種多肽的多聚核苷酸。所關(guān)心的基因或者多聚核苷酸序列是可操作的連接到一種啟動子序列和TEE，這種啟動子序列和TEE促進了宿主細(xì)胞中插入的多聚核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄效率。真核生物的信使核糖核酸的翻譯在AUG密碼子處開始，AUG編碼信使核糖核酸的甲硫氨酸。因此，啟動子和所關(guān)心的基因之間的連接將不會包含任何用于甲硫氨酸的插入密碼子。這些密碼子的存在可能引起融合蛋白質(zhì)的形成(如果AUG密碼子在作為所關(guān)心的基因的相同閱讀框位置)或者縮氨酸的形成，這樣或者終止上游的可信的起始密碼子或者重疊該基因，但在不同的閱讀框中。在一些實施方案中，編碼一種蛋白質(zhì)的所關(guān)心的基因包含5'引物和3'未翻譯的(UTR)序列。在其它的實施方案中，輸出轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的該5'引物和/或3'未翻譯的區(qū)域已經(jīng)先于所關(guān)心的的基因的克隆存在于該載體中。在這些實施方案中，至少一個TEE位于該5'引物和/或該3'未翻譯的區(qū)域。
[0071]一般地，該翻譯增強子位于轉(zhuǎn)錄啟動子和AUG密碼子之間。相對于該啟動子和所關(guān)心的的基因的帽子位點TEE的精確位置不是關(guān)鍵性的；然而，該精確位置可能影響效率。例如，一些TEE當(dāng)位于編碼信使核糖核酸的5'引物中，或者3'未翻譯的區(qū)域中可以增強翻譯。在一些實施方案中，TEE位于所關(guān)心的的基因或者順反子的5'前導(dǎo)序列中。在這些實施方案中，增強子因子位于翻譯起始位點內(nèi)大約1-500個核苷酸，特別地是位于翻譯起始位點內(nèi)大約1-100或者大約1-50個核苷酸。
[0072]通過并入上面描述的的翻譯增強子多聚核苷酸，重組載體可以有如SEQ ID NO:1-35所示的一種或多種該特異的翻譯增強子因子。對于任何這些特異的增強子因子，該載體可以懷有僅僅一個該增強子因子的拷貝或者相同增強子因子的多個拷貝。例如，為了增加由一種聯(lián)合順反子的多肽表達(dá)，如SEQ ID NO: 1-35所示的特異的TEE的2，5，10，20，35，50或者75個拷貝的串聯(lián)體可以存在于一些重組表達(dá)載體中。其它的載體有多重序列片段，這些多重序列片段可以獨立地包含一種或多種在這里所示例的特異的TEE序列。
[0073]另外，重組或者表達(dá)載體可以包含輔助的序列因子。例如，載體可以包含一種復(fù)制的起點，和特異的標(biāo)記，這些標(biāo)記允許轉(zhuǎn)染的或者轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型選擇。存在于載體實施方案其他因子的變化取決于宿主細(xì)胞類型，但通常包含涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯的開始和轉(zhuǎn)錄的終止序列信號。翻譯增強子序列也可能存在。載體還可以編碼序列，該多腺苷酸化作用包含帶有相同轉(zhuǎn)錄單位，控制因子例如核糖體結(jié)合部位，和多腺苷酸化作用位點，被那些允許在宿主細(xì)胞中克隆，表達(dá)，和轉(zhuǎn)化的相同的或者不同的啟動子，序列輔助的轉(zhuǎn)錄單位所控制的輔助的轉(zhuǎn)錄單位。在一些實施方案中，該載體還可以包含編碼一種分子標(biāo)記的多聚核苷酸，該標(biāo)記可以便于從那些不表達(dá)所報道的基因的宿主細(xì)胞中分離那些表達(dá)該報道基因的宿主細(xì)胞。
[0074]在一些實施方案中，重組載體打算用于在真核生物的宿主細(xì)胞中表達(dá)所關(guān)心的蛋白質(zhì)。如下面所詳細(xì)描述的，這些包含各種各樣的哺乳動物細(xì)胞以及昆蟲細(xì)胞或者植物細(xì)胞。在一些實施方案中，提供了脫氧核糖核酸疫苗，它表達(dá)來自這里所公開的表達(dá)載體的一種靶子抗原。適合用于真核生物中的大量載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已經(jīng)知道的。實例包含用于哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.263:3521,1988);用于昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的baculo病毒衍生的載體；及其他如Botstein等，Miami Winter Symp.19:265,1982 ；Broach Cell28:203,1982 ；Bollon 等，J.Cin.Hemato1.0ncol.10:39,1980 ;和細(xì)胞生物學(xué):一種綜論，Goldstein和Prescott (eds.)，學(xué)術(shù)出版社公司，美國(1980)描述的用于真核生物的表達(dá)的載體。在一些實施方案中，該翻譯增強子因子或者多聚核苷酸結(jié)合進脫氧核糖核酸構(gòu)造設(shè)計用于同源重組。這些構(gòu)造的描述，例如，Capecchi, TIG5:70,1989 ；Mansour eta /.,自然 336:348,1988 ;Thomas et al,細(xì)胞 51:503,1987 ；and Doetschman et al,自然 330:576,1987。
[0075]為了所關(guān)心的蛋白質(zhì)的載體表達(dá)，信使核糖核酸TEE或者翻譯增強子多聚核苷酸一般存在于可操作地連接到調(diào)節(jié)因子例如如上所述的一種啟動子的載體中。取決于所關(guān)心的特殊蛋白質(zhì)和使用的載體/宿主系統(tǒng)，許多不同的啟動子可以用于重組載體中。能被使用的啟動子的實例包含老鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子(Hamer等，J.Mo1.Appl.Gen.1:273，1982);皰疹病毒的快速的早期和TK啟動子(Yao等，J.Virol.69 =6249-6258,1995)；SV40早期啟動子(Benoist等自然290:304-310，1981);和人CMV啟動子(Boshart等細(xì)胞41 =521-530,1985) ;CaMV的35S核糖核酸和19S核糖酸啟動子(Brisson等，自然，310:511，1984 ;0dell等，自然，313:810，1985);來自玄參花葉病毒(FMV)的全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物啟動子(GoWda等，J.Cell Biochem., 13D =301,1989)和來自煙草花葉病毒的外殼蛋白啟動子(Takamatsu等，EMBO J.6:307，1987)?？捎糜跇?gòu)造重組表達(dá)載體的輔助的啟動子包含來自核酮糖雙磷酸鹽羧化酶(ssRUBISCO)的小亞基的松的-可誘導(dǎo)的啟動子(Coruzzi等，EMBOJ.，3 =1671,1984 ;和fcoglie等，科學(xué)，224 =838,1984);甘露堿合成酶基因啟動子(Velten等，EMBO J.，3:2723,1984);胭脂堿合成酶(NOS)啟動子(ShaW 等，Nucl.Acids Res.，12:7831-46,1984);章魚堿合成酶(OCS)啟動子 Koncz 等，EMBO J.2:1597-603，1983);和熱休克啟動子，例如，大豆 hspl7.5-E 或者 hspl7.3B (Gurley 等，Mo1.Cell.Biol.，6:559,1986 ；Severin 等，Plant Mo1.Biol.，15:827,1990)。
[0076]啟動子可以既包含結(jié)構(gòu)的也可以包含可誘導(dǎo)的自然的啟動子以及設(shè)計的啟動子。CaMV啟動子是結(jié)構(gòu)的啟動子的實例。為使其最有用，可誘導(dǎo)的啟動子將I)在誘導(dǎo)物不存在時提供低的表達(dá)；2)在誘導(dǎo)物存在時提供了高的表達(dá)；3)使用那些不干擾植物的正常的生理學(xué)的誘導(dǎo)程序；和4)對其他的基因的表達(dá)無效。
[0077]在一些實施方案中，該重組載體可以選擇性地包含一種可選擇的標(biāo)記。該標(biāo)記一般地編碼一種性狀或者一種允許選定區(qū)域的表現(xiàn)型，或者用于包含該標(biāo)記的宿主細(xì)胞篩選。在一種實施方案中，該標(biāo)記基因是一種抗生素抗性基因由此合適的抗生素可用于從那些沒有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞之中篩選轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。合適的可選擇的標(biāo)記的實例包含腺苷脫氨酶，二氫葉酸還原酶，潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶，胸苷激酶，黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和氨基苷3'-氧-磷酸轉(zhuǎn)移酶11(卡那霉素，新霉素和G418抗性)。其他的合適的標(biāo)記將是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，例如，熒光標(biāo)記例如GUS報道基因(UidA)，熒光素酶或者GFP基因。
[0078] IV.用于提聞所關(guān)心的多妝的廣量的宿主細(xì)胞[0079]翻譯增強子多聚核苷酸和有關(guān)的載體在各種各樣的工業(yè)和醫(yī)療的應(yīng)用中是有用的。在一些實施方案中，提供了使用這些表達(dá)載體/宿主細(xì)胞體系用于表達(dá)治療的蛋白質(zhì)或者工業(yè)的公用事業(yè)在增加的水平上的蛋白質(zhì)的用法。例如，可以用載體表達(dá)的治療的蛋白質(zhì)可以包含治療的抗體例如赫賽汀，來自各種各樣的病原體的多肽抗原例如細(xì)菌或者病毒(例如，大腸桿菌，銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌，瘧疾，艾滋病病毒，狂犬病病毒，HBV,和巨細(xì)胞病毒)引起的疾病，及其他蛋白質(zhì)例如乳鐵傳遞蛋白，硫氧還蛋白和β-caseinvaccine。其他的合適的蛋白質(zhì)或者多肽適當(dāng)包含,例如,營養(yǎng)地重要的蛋白質(zhì)；發(fā)育增進因素；用于植物早開花的蛋白質(zhì)；在某些環(huán)境條件下給植物提供保護的蛋白質(zhì)，例如，對于金屬或者其他的有毒物質(zhì)有抗性的蛋白質(zhì)，例如除草劑或者殺蟲劑；給予溫度極限耐受性應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)；給予真菌，細(xì)菌，病毒，昆蟲和線蟲抗性的蛋白質(zhì)；特效的商業(yè)價值的蛋白質(zhì)，例如，涉及代謝途徑的酶，例如EPSP合成酶。
[0080]在這里所描述的懷有所關(guān)心的基因的重組載體和信使核糖核酸TEE或者增強子多聚核苷酸可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法引入到合適的宿主細(xì)胞中。例如，載體可以通過磷酸鈣共同沉淀，通過傳統(tǒng)的機械的程序例如微量注射或者電轉(zhuǎn)化，通過脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒插入，和通過病毒載體的方法轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。這些方法全都是眾所周知的并且本領(lǐng)域技術(shù)人員熟練操作，，例如，Brent等，分子生物學(xué)通用操作規(guī)程，JohnWiley&Sons,公司(ringbou 等，2003);和 Weissbach&Weissbach,植物分子生物學(xué)方法，學(xué)術(shù)出版社，紐約，VIII節(jié)，421-463頁，1988。懷有該轉(zhuǎn)染的重組載體的宿主細(xì)胞可以使用載體上的選定區(qū)域標(biāo)記來確定和分離。大量受體細(xì)胞可以在選擇含有包含載體的細(xì)胞的培養(yǎng)基中生長。這些細(xì)胞可以直接使用或者該表達(dá)重組蛋白質(zhì)可以按照傳統(tǒng)方法例如抽提，沉淀，色譜法，親合方法，電泳等等來純化。使用的正確的程序取決于產(chǎn)生的特殊蛋白質(zhì)和利用的的特殊的載體/宿主表達(dá)體系。
[0081]在一種實施方案中，用于表達(dá)該重組載體的宿主細(xì)胞是真核生物的細(xì)胞。真核生物的載體宿主系統(tǒng)，和哺乳動物表達(dá)體系，允許適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)哺乳動物蛋白質(zhì)的翻譯后修飾存在，例如，適當(dāng)?shù)倪M行主要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，糖基化作用，磷酸化作用和有益地表達(dá)產(chǎn)物的分泌。所以，真核細(xì)胞例如哺乳動物細(xì)胞可以是用于所關(guān)心的的一種多肽的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞系的實例包含 CHO，BHK, HEK293, VERO, HeLa, COS, MDCK, NSO 和 W138。
[0082] 在一些實施方案中，使用設(shè)計的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)，這些哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)利用重組病毒或者病毒因子來指導(dǎo)所關(guān)心的的蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如，當(dāng)使用腺病毒表達(dá)載體時，與TEE或者翻譯增強子多聚核苷酸一起的所關(guān)心的蛋白質(zhì)的編碼序列可以連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物，例如，延遲的啟動子和分成三部分的前導(dǎo)序列。然后這些嵌合的基因可以通過體外或者體內(nèi)重組被插入到腺病毒基因組中。病毒的基因組的非必要的區(qū)域中插入將產(chǎn)生一種重組病毒，它有活力并且能夠在受感染宿主中表達(dá)所關(guān)心的多肽(例如，see Logan&Shenk, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:3655-3659,1984) 0 替代地，牛痕病毒
7.5K啟動子可以被使用，(例如，參見，Mackett等，Proc.Natl.Natl.Acad.Sc1.美國，79:7415-7419，1982 ；Mackett 等，J.Virol.49:857-864,1984 ；Panicali 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 79:4927-4931,1982)。特別有興趣的是基于牛乳頭狀瘤病毒的載體，它能夠復(fù)制作為超染色體因子(Sarver等，Mo1.Cell.Biol.1:486,1981)。通過在質(zhì)粒中包含一種可選擇的標(biāo)記這些載體能被用于穩(wěn)定的表達(dá)，例如新的基因。替代地，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可以修改用作一種能夠引入并且指導(dǎo)所關(guān)心的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體(Cone&Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6349-6353,1984)。高水平表達(dá)也可以使用可誘導(dǎo)的啟動子，包括但不限于，金屬硫蛋白HA啟動子和熱休克啟動子來完成。
[0083]用于重組載體表達(dá)的宿主細(xì)胞還可以是酵母?？梢允褂冒Y(jié)構(gòu)的或者可誘導(dǎo)的啟動子的大量載體。參見，例如，Brent等,分子生物學(xué)通用操作規(guī)程,John Wiley&Sons,公司(ringbou等,2003);和酵母的分子生物學(xué)，Strathem等(eds.),冷泉港出版(1982)?？梢允褂靡环N結(jié)構(gòu)的酵母啟動子例如ADH或者LEU2或者一種可誘導(dǎo)的啟動子例如GAL。替代地，可以使用載體促進外來脫氧核糖核酸序列整合進入到酵母染色體中。
[0084]如果使用植物表達(dá)載體，所關(guān)心的的基因的表達(dá)可以由大量啟動子的任何一個來推動。例如，可以使用病毒啟動子例如CaMV的35S核糖核酸和19S核糖核酸啟動子(Brisson等，自然310-511-514，1984)或者煙草花葉病毒的外殼蛋白啟動子(Takamatsu等，EMBO J.,6 =307311,1987) ο替代地，可以使用植物啟動子例如RUBISC0的小亞基(Coruzzi 等，EMBO J.3:16711680,1984 ;和 fcoglie 等，科學(xué) 224:838-843,1984)或者熱休克啟動子(Gurley 等，Mo1.Cell.Biol.，6:559-565,1986)。
[0085]可 用于帶有重組載體的所關(guān)心的蛋白質(zhì)的表達(dá)的一種替代的表達(dá)體系是昆蟲體系。在這樣的一種體系中，苜猜尺蠖核型多角體病毒(AcNPV)被用作一種表達(dá)外來基因的載體。該病毒生長在草地貪夜蛾細(xì)胞中。綁定多肽編碼序列的核苷酸-鋅指可以克隆進該病毒的不重要的區(qū)域并且置于AcNPV啟動子(例如，多角體蛋白啟動子))的控制之下。綁定多肽編碼序列的核苷酸-鋅指的成功插入將引起多角體蛋白基因的失活和非封閉的重組病毒(也就是，通過多角體蛋白基因用于編碼缺乏蛋白質(zhì)外衣的病毒)的產(chǎn)生。然后這些重組病毒用于感染細(xì)胞，在這些細(xì)胞中，插入基因得到表達(dá)。參見，例如，Smith等J.Biol.46:584,1983 ;和 Smith，美國專利號 4，215，051)。
[0086]一旦重組載體被引入合適的宿主細(xì)胞，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可以按照常用方法例如抽提，沉淀，色譜法，親和層析，電泳等等來純化。使用正確的方法既取決于產(chǎn)生的特殊蛋白質(zhì)又取決于利用的特殊的表達(dá)體系。對于長期的，高產(chǎn)率的重組蛋白質(zhì)，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。勝于使用包含復(fù)制起點的載體，宿主細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化帶有允許穩(wěn)定的整合載體進入宿主染色體的載體。帶有穩(wěn)定地整合的編碼所關(guān)心的蛋白質(zhì)的多聚核苷酸的宿主細(xì)胞可以逐漸形成中心，該中心可以依次克隆并且擴大為細(xì)胞系。例如，隨著外來脫氧核糖核酸的進入設(shè)計的細(xì)胞可以允許在一種增菌培養(yǎng)基中生長1-2日，然后轉(zhuǎn)到一種選擇培養(yǎng)基中。
[0087]V.治療的應(yīng)用
[0088]進一步地提供了載體體系，這些載體體系可以用于各種各樣的治療的應(yīng)用。例如，用于蛋白質(zhì)的治療的表達(dá)的一種載體可以由上面描述的帶有一種信使核糖核酸TEE或者翻譯增強子多聚核苷酸和編碼治療的蛋白質(zhì)的一種多聚核苷酸構(gòu)成。其他的實例包含用于疫苗中的載體以便可以實現(xiàn)增加抗原產(chǎn)量。
[0089]疫苗通?？梢杂梢环N表達(dá)載體組成，在這里疫苗抗原的表達(dá)是由于一個或多個翻譯增強子因子(例如，SEQ ID NOs:1-35)的存在而增強的。在一些實施方案中，脫氧核糖核酸疫苗可以傳遞和表達(dá)多于一個抗原。除了編碼該疫苗抗原和該翻譯增強子因子的序列之外，脫氧核糖核酸疫苗載體一般地也包含一種用于在真核生物的細(xì)胞中有活性的轉(zhuǎn)錄開始的啟動子。這些脫氧核糖核酸疫苗載體可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法來生成。例如，用于給定抗原的脫氧核糖核酸疫苗的制造和使用方法的描述見，例如，Gurunathan 等，Ann.Rev.Tmmunol., 18:927,2000 ；Krieg, Biochim.Biophys.Acta., 1489:107, 1999 ；Cichutek, Dev.Biol.Stand., 100:119,1999 ；Davis, Microbes Infect., 1:7,1999 ;和 Leitner,疫苗，18:765,1999。
[0090]上面描述的任何載體可以用于表達(dá)脫氧核糖核酸疫苗中的一種疫苗抗原?？捎糜诮Y(jié)構(gòu)的脫氧核糖核酸疫苗的輔助載體可以包含病毒載體例如ALVAC (—種金絲雀痘病毒)，MVA ( —種牛痘變體)，和ADV5 (腺病毒5)載體，以及質(zhì)粒載體例如pUC19 (ATCC#_37254)，pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pNGVL (國家的基因載體實驗室，密西根州大學(xué)，MI)，p414cyc(ATCC#_87380)，pBSL130(ATCC#_87145)，和 pECV25 (ATCC#_77187)?？梢杂糜谝呙巛d體的啟動子的實例包含，例如，SV40早期啟動子，巨細(xì)胞病毒快速的早期啟動子/增強子，和各種各樣的在這里所描述的真核生物的啟動子。
[0091]疫苗抗原的不同的系列可以由脫氧核糖核酸疫苗來表達(dá)。這些包含，例如，艾滋病病毒-1抗原，肝炎C病毒抗原，乙型肝炎病毒抗原，單純性皰疹病毒抗原，痘病毒抗原，流感病毒抗原，麻疹病毒抗原，登革熱病毒抗原，痢疾內(nèi)變形蟲抗原，塞姆利基森林病毒抗原，乳頭狀瘤病毒抗原，間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲抗原?？梢栽诿撗鹾颂呛怂嵋呙缰斜磉_(dá)的抗原的補充信息可以從網(wǎng)址DNAvaccine.com處獲得。
[0092]脫氧核糖核酸疫苗可用于使任何患者免疫以防止或者保護阻止病原體的傳染(例如，艾滋病病毒傳染)。這些患者包含人和非人的動物例如嚙齒動物(例如老鼠，家屬和豚鼠)，豬，小雞，雪貂，非人的靈長類。本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)了脫氧核糖核酸疫苗給藥到合適的患者的方法。參見，例如，Webster 等,Vacc, 12:14951498,1994 ；Bernstein 等，疫苗，17:1964,1999 ;Huang 等，Viral Immunol.，12:1,1999 ；Tsukamoto 等，病毒學(xué) 257:352，1999 ；Sakaguchi 等，疫苗，14:747,1996 ；Kodihalli 等，J.Virol.，71:3391,1997 ；Donnelly 等，疫苗，15 =865,1997 ;Fuller 等，疫苗，15 =924,1997 ;Fuller 等，免疫細(xì)胞生物學(xué)，75:389，1997 ；Le 等，疫苗，18:1893,2000 ；Boyer 等，J.1nfect.Dis.，181:476，2000。
[0093]除了增強通過使用在這里所描述的特殊的TEE或者信使核糖核酸翻譯增強子多聚核苷酸的疫苗抗原的表達(dá)之外，脫氧核糖核酸疫苗還可以用帶有一種輔助的合適的輔料配制，可以使用的輔料包含，例如，磷酸鋁或者鋁羥基磷酸物，單磷?；?脂質(zhì)體A，QS-21皂角苷，地塞米松，CpG脫氧核糖核酸序列，霍亂毒素，細(xì)胞因子或者趨化因子。這些輔料增強脫氧核糖核酸疫苗的免疫原性。制備這些改進的脫氧核糖核酸疫苗的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見，例如，Ulmer e / α /.,疫苗18:18, 2000 ;Schneerson等，J.1mmunol.147:2136-2140,1991 ；Sasaki 等，Immunol.65:3520-3528,1997 ； Lodme 11等，疫苗，18:10591066,2000 ;Sasali 等，J.Virol.72:4931，1998 ;Malone 等，J.Biol.Chem.269:29903,1994 ；Davis 等，J.1mmunol.15:870,1998 ；Xin 等，臨床免疫，92:90，1999 ；Agren 等，免疫細(xì)胞生物學(xué) 76:280，1998 ;和 Hayashi 等，疫苗，18:3097-3105, 2000。
[0094]在一些實施方案中，提供了用于增強治療各種各樣的疾病的治療的蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法。在這些方法 中，懷有翻譯增強子因子或者多聚核苷酸并且表達(dá)治療的蛋白質(zhì)的表達(dá)載體通過載體和靶細(xì)胞的相互作用，體外或者體內(nèi)轉(zhuǎn)染進入靶細(xì)胞。組合物以一足夠量給藥患者使得患者體內(nèi)引起治療性的響應(yīng)。在大量的文獻中這些基因治療方法已經(jīng)用于矯正獲得和繼承遺傳缺陷，癌，和病毒感染。參見，例如，Anderson，科學(xué)256 =808-813,1992 ；Nabel&Feigner, TIBTECH11:211-217,1993 ；Mitani&Caskey, TIBTECH11:162-166，1993 ；Mulligan,科學(xué) 926-932,1993 ；Dillon, TIBTECH11:167-175，1993 ；Miller,自然 357:455-460,1992 ；Van Brunt,生物技術(shù) 6:1149-1154,1998 ;Vigne 等，Restorative Neurol,和 Neurosc1.8:35-36,1995 ；Kremer&Perricaudet,Br.Med.Bull.51:31-44,1995 ；Haddada等，微生物學(xué)和免疫學(xué)中現(xiàn)行主題(Doerfler&Bohm eds.，1995) JPYu等，基因治療1:13-26，1994。
[0095]在這里所描述的治療的方法適合于治療各種各樣的疾病和病癥。這些包含各種各樣的器官系統(tǒng)的惡性腫瘤，例如，肺，胸部，淋巴的，胃腸的，和生殖-泌尿道。也適合于治療腺癌，包含惡性腫瘤例如大多數(shù)結(jié)腸癌，腎細(xì)胞癌，前列腺癌，肺的非小細(xì)胞癌，小腸的癌瘤，和食道癌。包含在這里所公開的一種信使核糖核酸TEE或者翻譯增強子多聚核苷酸的重組表達(dá)載體對治療非惡性的細(xì)胞-增生疾病例如牛皮癬，尋常天皰瘡，白塞氏綜合征，和類脂組織細(xì)胞增多病也是有用的。實質(zhì)上，任何用治療的蛋白質(zhì)可以治療或者改善的任何病癥被認(rèn)為是對用表達(dá)載體治療敏感的，該表達(dá)載體由于載體中翻譯增強子因子的存在而在增多的水平上表達(dá)該治療的蛋白質(zhì)。[0096]大量傳送方法可用于在這里所描述的實踐治療的方法。這些方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。非病毒載體傳送系統(tǒng)包含脫氧核糖核酸質(zhì)粒，裸露的核苷酸，和帶有一種運載工具例如脂質(zhì)體的核苷酸復(fù)合物。病毒載體傳送系統(tǒng)包含脫氧核糖核酸和核糖核酸病毒，它在傳送給細(xì)胞后有游離基因或者整合基因組。核苷酸的非病毒傳遞方法包含脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，微量注射，基因槍方法，病毒顆粒，脂質(zhì)體，免疫脂質(zhì)體，聚陽離子或者脂:酸共軛物，裸露的脫氧核糖核酸，人工的病毒粒子，和DNA的增強吸收藥劑。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的描述見，例如，美國專利號5，049，386，美國專利號4，946，787 ;和美國專利號4，897，355并且脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑是商業(yè)上銷售的(例如,Transfectam和Lipofectin)。適合于多聚核苷酸的有效的受體識別脂轉(zhuǎn)染的陽離子的和中性類脂包含那些，例如，W091 / 17424和W091 / 16024中所描述的?？梢詡魉偷郊?xì)胞(體外給藥)或者靶組織(體內(nèi)給藥)。
[0097]在許多基因治療應(yīng)用中，需要基因治療載體高度專一的傳送到一種特定的組織類型。一般地病毒載體通過病毒外表面上的病毒外殼蛋白表達(dá)配位體成為融合蛋白質(zhì)的方式改進以對給定的細(xì)胞有專一性。選擇的配位體對所關(guān)心的細(xì)胞上存在的已知的受體是有親和力的。例如，Han 等(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.92:9747-9751,1995)報道說莫洛尼鼠科的白血病毒可以改進來表達(dá)人heregulin融合到gp70，并且該重組病毒感染某些表達(dá)人表皮生長因子受體的人乳癌細(xì)胞。這個原則可以延至其他的表達(dá)一種配位體融合蛋白質(zhì)的病毒對和表達(dá)一種受體的靶細(xì)胞。例如，絲狀的噬菌體可以設(shè)計來顯示抗體片段(例如，F(xiàn)AB或者Fv)，這些抗體片段對于任何選擇的細(xì)胞的受體實際上有特殊的綁定親合力。盡管上面描述的申請首要對于病毒載體，相同原則可以被用于非病毒載體。這些載體可以被設(shè)計包含那些認(rèn)為有利于特定的靶細(xì)胞吸收的特殊的吸收序列。
[0098]表達(dá)載體通過給個體患者給藥傳送到體內(nèi)，一般地通過系統(tǒng)的給藥(例如,靜脈內(nèi)的，腹膜內(nèi)的，肌肉的，皮下的，或者顱內(nèi)的輸注)或者局部施用，如下所述。替代地，載體可以體外傳送給細(xì)胞，例如自個體患者的細(xì)胞外植體(例如,淋巴細(xì)胞,骨髓抽出物,組織切片)或者萬能供血者造血干細(xì)胞，然后通常在選擇并入載體的細(xì)胞后將該細(xì)胞植入到患者體內(nèi)。對于診斷，研究，或者對于基因治療(例如，通過轉(zhuǎn)染的細(xì)胞再輸注進入宿主生物體)的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染對本領(lǐng)域那些熟練的技術(shù)人員是眾所周知的。在一種實施方案中，細(xì)胞可以從患者體內(nèi)分離，用核苷酸(基因或者互補DNA)轉(zhuǎn)染，并且再注回到患者體內(nèi)(例如患者)。適合于體外轉(zhuǎn)染的各種各樣的細(xì)胞類型是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見，例如，F(xiàn)reshney等，動物細(xì)胞培養(yǎng)，一種基本技術(shù)指南(第三版，1994)和為了評述怎樣分離和培養(yǎng)來自患者的細(xì)胞在這里列舉的對照)。
[0099]實施例
[0100]提供下列實施例作為進一步闡述，但并不限制其范圍。其他的變形對于本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講是顯而易見的并且包括在本發(fā)明所附的權(quán)利要求保護的范圍內(nèi)。
[0101]實施例1識別翻譯增強子的IH反饋載體體系
[0102]TEE的識別包括一種雙重的單作用子正反饋載體的使用:一種是編碼Gal4VP16轉(zhuǎn)錄因子的順反子，另一種是編碼Renilla熒光素酶的順反子。兩種順反子包含帶有4拷貝的上游活化序列(UAS)的一種最小的啟動子，這種啟動子當(dāng)綁定到Gal4VP16上增強了轉(zhuǎn)錄。當(dāng)被引入細(xì)胞時，該最小的啟動子驅(qū)使信使核糖核酸和編碼蛋白質(zhì)極低的水平。那些可以增強翻譯進入Gal4VP16順反子的5'引物的序列驅(qū)使Gal4VP16信使核糖核酸的翻譯。然后Gal4VP16蛋白質(zhì)可以綁定這兩種啟動子增強轉(zhuǎn)錄，驅(qū)使它自己的轉(zhuǎn)錄和在兩個基因的啟動子中通過特異的結(jié)合部位的另一個順反子的轉(zhuǎn)錄從而開始正反饋環(huán)路。TEE從隨機的核苷酸序列庫中被識別。在一種實施方案中，僅僅使用編碼增強的GFP(EGFP)的順反子并且改善信噪比允許每個轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的單個庫質(zhì)粒的分離。確認(rèn)包括在正反饋體系和非放大載體體系兩者中的試驗。
[0103]圖表1闡述了一種示意圖，代表了翻譯增強正反饋載體以及不同的啟動子(PI)和轉(zhuǎn)錄增強子(P2)、轉(zhuǎn)錄因子(TF)基因和所關(guān)心的蛋白。轉(zhuǎn)錄因子基因和所關(guān)心的基因可以在相同的或者不同的質(zhì)粒上。對于選定區(qū)域的應(yīng)用，一種隨機的核苷酸序列(N)，η個核苷酸長度，存在于轉(zhuǎn)錄因子信使核糖核酸的5'引物中。起翻譯增強子因子(TEE)作用的序列將便于這個信使核糖核酸的翻譯。然后編碼的轉(zhuǎn)錄因子將綁定到兩個基因的啟動子中的位點并且增強它們的轉(zhuǎn)錄。在一種具體實施方案中，該構(gòu)造表達(dá)兩個信使核糖核酸:一個編碼所關(guān)心的蛋白質(zhì)，它可以是一種報道的蛋白質(zhì)；另一個編碼一種轉(zhuǎn)錄因子。兩個信使核糖核酸的轉(zhuǎn)錄都是通過最小的啟動子驅(qū)動的但可以通過經(jīng)由位于兩個基因的啟動子中的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來增強。少量轉(zhuǎn)錄因子信使核糖核酸由最小的啟動子表達(dá)但是這個信使核糖核酸的翻譯被編碼轉(zhuǎn)錄因子的信使核糖核酸的5'引物中的障礙所阻斷。這個障礙可以是一種穩(wěn)定的莖-圈結(jié)構(gòu)和/或上游AUG起始密碼子。這些轉(zhuǎn)錄因子的合成取決于編碼這個因子的信使核糖核酸中翻譯增強子的存在。
[0104]圖2闡述了翻譯增強子驅(qū)使的正反饋載體與一種第三蛋白阻礙宿主蛋白質(zhì)合成。開頭兩個基因(轉(zhuǎn)錄因子基因和所關(guān)心的基因)除了所有三種信使核糖核酸包含在它們的5'引物中包含一種球座之外與圖1中的是相同的。通過阻斷宿主信使核糖核酸翻譯并且減少與它們的競爭第三蛋白質(zhì)(例如，輪狀病毒NSP3蛋白質(zhì))將增強開頭兩個編碼的信使核糖核酸的翻譯。第三基因在啟動子Ρ3的轉(zhuǎn)錄控制之下，啟動子Ρ3是一種結(jié)構(gòu)的啟動子或者一種可誘導(dǎo)的啟動子。Ρ3也可以包含啟動子因子Pl和Ρ2。對于選定區(qū)域的應(yīng)用，對于所關(guān)心的基因的信使核糖核酸和第三蛋白質(zhì)將包含一種已知的ΤΕΕ，同時該轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)环N隨機的核苷酸序列。在這個方案中，TEE抵抗第三蛋白質(zhì)的活性。對于一種蛋白質(zhì)生產(chǎn)應(yīng)用，所有三個基因可以包含一種已知的抵抗第三蛋白質(zhì)活性的TEE。該三個基因可以在一個，兩個，或者三個不同的質(zhì)粒上。
[0105]使用正反饋體系來識別TEE的更詳細(xì)的步驟在前面已經(jīng)描述過，例如，PCT出版物W02007 / 025008。
[0106]實施例2 —致的翻譯增強子模體的識別
[0107]使用如上所述的一種雙重的單作用子正反饋載體系統(tǒng)，那些在中國倉鼠卵巢(CHO)及其他細(xì)胞系，包含BHK(小型的倉鼠腎)細(xì)胞中起翻譯增強子作用許多短的核苷酸序列被識別。這些翻譯增強子因子(TEE)長度范圍在七個到十二個不等。如圖3所示，這些TEE的多拷貝在CHO細(xì)胞中增強了蛋白質(zhì)產(chǎn)量直到25倍。在每一個實施例中，在熒光蟲熒光素酶順反子的5'引物中至少有5個相同的TEE連接的拷貝。第一個結(jié)構(gòu)是不包含TEE的大小對比對照。結(jié)構(gòu)被短暫地轉(zhuǎn)染的進CHO細(xì)胞并且在2日后試驗。翻譯效率涉及大小對比對照結(jié)構(gòu)的活性。在圖3中，頂端13條信號號分別低于相應(yīng)的對照條信號的由13個不同的TEE的5個拷貝得到的結(jié)果。其次的兩個條信號顯示了 5個或者15個拷貝的另一個TEE的翻譯增強活性。底下的條信號闡明了當(dāng)使用5-25個拷貝時又一個TEE序列的翻譯增強活性。
[0108]這些TEE的幾個顯示了序列相似性，并且被公認(rèn)的一致的模體由這些TEE來識別(參見圖4)。TEE模體的兩個實施方案的序列如下:RNSGAGMGRMR(SEQ ID N0:1)，和MSCSGCNGMWA (SEQ ID NO:2)。注意到在這些序列中，R表示A或者G，M表示A或者C，S表示G或者C, W表示A或者U,以及N表示A, G, C或者U。
[0109]在另一個實施方案中，模體Ia序列是模體I是R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ IDNO:3)。在這一序列中，Rl是缺失，如果存在的話，是A或者G ；N1是缺失，如果存在的話，是A、C或者G，優(yōu)選是A、C、或者G;S1是缺失，如果存在的話是C或者G，優(yōu)選是C或者G ;M1是A或者C ；R2是缺失，如果存在的話，是A或者G,優(yōu)選是A或者G,并且，Rl和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的話，是A或者C，優(yōu)選是A或者C ；R3是缺失，如果存在的話，是A或者G，優(yōu)選是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優(yōu)選是缺失。在另一個實施方案中，模體 I 是 R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO:3)，其中 R1、R3、R4 是缺失，NI是A、C或者G ;S1是C或者G ;M1是A或者C ;R2是A或者G并且M2是A或者C。
[0110]在另一個實施方案中，模體2a序列R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO:4)。在此序列中，R5是缺失，如果存在的話，是A，優(yōu)選是缺失;M3是缺失，如果存在的話，是C或者A，優(yōu)選是C或者A ；S2是缺失，如果存在的話，是C或者G，優(yōu)選是C或者G ;S3是G或者C ;N2是G、C或者T ;M4是A或者C ；ff是缺失，如果存在的話是A或者T ；R6是缺失，如果存在的話是A。在另一個實施方案中，模體2是R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO:4)。在此序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的話是A或者C ;S2是C或者G ;S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ;W是缺失，如果存在的話是A。
[0111]實施例3合成的信使核糖核酸翻譯增強子因子的活性
[0112]基于上述注釋的一致模體，合成大略相當(dāng)于模體I和2的各種各樣的特異的TEE序列并且試驗翻譯增強活性(參見表格I的SEQ ID NO:5-35)。包含試驗序列的脫氧核糖核酸片段由兩個重疊，互補的寡聚核苷酸彼此合成以及退火后生成。退火的寡聚核苷酸在每個末端有未配對的核苷酸，它對使用EcoRl以及BamHl.克隆進載體提供了粘末端。該片段在如實施例1中所述的正反饋表達(dá)載體中被克隆進熒光素酶報道基因信使核糖核酸的5'引物。包含模體序列的Renilla熒光素酶結(jié)構(gòu)然后短暫地轉(zhuǎn)染進CHO細(xì)胞。3日后對細(xì)胞試驗這些測試序列增強翻譯的能力。一種對比對照(對照)質(zhì)粒在克隆區(qū)域中包含polyA。報道基因多肽的翻譯效率上TEE的效果如圖5所示。
[0113]結(jié)果表明一致的模體是可預(yù)計相當(dāng)于這些的模體的一個的一種TEE的翻譯增強活性的。也如同該圖中顯示的，基于模體I的TEE序列比那些基于模體2的TEE序列往往引起更高的增強翻譯水平。
[0114]表1相當(dāng)于一致的模體I (Ml)和2 (M2)
[0115]在這里所描述的新的翻譯增強子可以有各種各樣的實際的和工業(yè)的應(yīng)用。例如，他們可以最小化與工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)有關(guān)的成本并且減少藥劑成本。較高的蛋白質(zhì)濃度還可以便于蛋白質(zhì)提純。另外，這些翻譯增強子增強子可以實現(xiàn)那些由于弱的蛋白質(zhì)表達(dá)而不可能的過程，例如從一種脫氧核糖核酸疫苗中表達(dá)足夠的抗原來產(chǎn)生一種免疫反應(yīng)。這些可用于顯著地提高哺乳動物細(xì)胞中特殊蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。例如，許多治療的蛋白質(zhì)在CHO細(xì)胞中被表達(dá)以確保正確的翻譯后過程，CHO細(xì)胞是最常使用的用于大規(guī)模生產(chǎn)治療的蛋白質(zhì)。除工業(yè)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)之外，翻譯增強子在各種各樣的載體體系中有潛在的使用。例如，為了研究目的，蛋白質(zhì)治療的表達(dá)，和脫氧核糖核酸疫苗，為了增強抗原產(chǎn)量。
[0116]盡管本發(fā)明說明書包含了具體實施方案并參照其優(yōu)選的實施方案進行了描述，但這些并不應(yīng)被認(rèn)為是本發(fā)明要求保護的范圍或者任意可以要求保護的范圍的限制，這只是對特定實施方案特點的描述。本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，在不脫離這里描述的本發(fā)明的意思的情況下，在形式和細(xì)節(jié)上，本發(fā)明可以存在多種變化。在本發(fā)明說明書中描述的某些特點以及相互獨立的實施方案還可以被結(jié)合到一個實施方案中。反之，單一實施方案所具有的各種特點可以分別被結(jié)合在多個實施方案中或者結(jié)合在任意合適的子結(jié)合中。此外，盡管上面描述的特點以結(jié)合的方式發(fā)揮作用或者最初以結(jié)合的方式要求保護，但在某些情況下，可以從這種要求保護的結(jié)合中刪除一種或一種以上特點，并且要求保護的結(jié)合可以包括一種亞結(jié)合或者亞結(jié)合的變體。本發(fā)明的范圍被隨后的權(quán)利要求書定義。
[0117] 在說明書中引用的所有的出版物、數(shù)據(jù)庫、GenBank序列、專利和專利申請通過引證在此全部并入本文，如同其中每個都被分別地特定的顯示通過引證并入本文。
【權(quán)利要求】
1.一種分離的多核苷酸序列包含至少一種信使核糖核酸翻譯增強因子(TEE)，在這里TEE 由 R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO:3)或者 R5M3S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID N0:4)、或者其基本上相同的序列組成，其中,R1是缺失，如果存在的話，是A或者G A1是缺失，如果存在的話，是A、C或者G，優(yōu)選是A、C、或者G A1是缺失，如果存在的話是C或者G，優(yōu)選是C或者G !M1是A或者C ；R2是缺失，如果存在的話，是A或者G,優(yōu)選是A或者G,并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的話，是A或者C，優(yōu)選是A或者C ；R3是缺失，如果存在的話，是A或者G，優(yōu)選是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優(yōu)選是缺失；并且，R5是缺失，如果存在的話，是A，優(yōu)選是缺失；M3是缺失，如果存在的話，是C或者A，優(yōu)選是C或者A ；S2是缺失，如果存在的話，是C或者G，優(yōu)選是C或者G ;S3是G或者C ;N2是G、C或者T ;M4是A或者C ；ff是缺失，如果存在的話是A或者T ；R6是缺失，如果存在的話是A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的多聚核苷酸序列，在這里TEE由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4組成。在這里R1, R3和R4是缺失的A1是A，C或G A1是C或者G W1是A或者C ;R2是A或者G并且M2是A或者C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的多聚核苷酸序列，在這里TEE由R具S2CS3GCN2GM4WR6組成，在這里R5和R6是缺失;M3是缺失，如果存在的話是A或者C ;S2是C或者G ;S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T越是六或者C;W是缺失，如果存在的話是A。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3中任意一項的分離的多聚核苷酸序列，在這里翻譯增強因子(TEE)具有的序列與SEQ ID NO:5-35組成的序列群中選擇的一個序列有至少90%的一致性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3中任意一項的分離的多聚核苷酸序列，在這里翻譯增強因子(TEE)具有的序列與從SEQ ID NO:5-35組成的序列群中選擇的一個序列相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3中任意一項的分離的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少2個拷貝。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3中任意一項的分離的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少5個拷貝。
8.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3中任意一項的分離的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少10個拷貝。
9.用于在真核細(xì)胞中重組表達(dá)多肽的載體，這種載體包括一種真核啟動子，這種真核啟動子與一種多聚核苷酸序列可操作的相連，所述聚核苷酸序列包括至少一個這里公開的mRNA翻譯增強因子(TEE)，在這里TEE是從權(quán)利要求1，2或者3的TEE中選擇的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，在這里信使核糖核酸增強因子組成的序列與從SEQ IDNO:5-35組成的序列群中選擇的一個序列實際上是相同的。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，在這里信使核糖核酸增強因子組成的序列與從SEQ IDNO:5-35組成的序列群中選擇的一個序列是相同的。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，在這里信使核糖核酸增強因子位于3’引物端并且適合定向連接編碼所關(guān)心的多肽的第二段多聚核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，進一步包含編碼所關(guān)心的多肽的第二段多聚核苷酸序列，這個多聚核苷酸序列可操作地連接到信使核糖核酸增強因子。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，在這里信使核糖核酸增強因子位于第二段多聚核苷酸序列的5’引物序列。
15.—種DNA疫苗包含根據(jù)權(quán)利要求9的載體。
16.—種真核宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染根據(jù)權(quán)利要求9的載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，在這里宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
18.用于重組的生產(chǎn)一種多肽的方法包含: (i)構(gòu)建一種表達(dá)載體，這種表達(dá)載體包括一種真核啟動子和mRNA翻譯增強因子，每個都與編碼所關(guān)心多肽的聚核苷酸可操作的相連，在這里TEE是從權(quán)利要求1，2或者3的TEE中選擇的。 (?)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體計入真核宿主細(xì)胞；并且 (iii)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染帶有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；從而生產(chǎn)多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求 18的方法，在這里信使核糖核酸增強因子組成的序列與從SEQIDNO:5-35組成的序列群中選擇的一個序列實際上是相同的。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，在這里信使核糖核酸增強因子組成的序列與從SEQIDNO:5-35組成的序列群中選擇的一個序列是相同的。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，進一步包含純化的重組多肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，在這里宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，在這里多肽是治療的蛋白質(zhì)。
【文檔編號】C12N15/113GK103911378SQ201410144264
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2007年12月11日
【發(fā)明者】V·P·莫羅, G·M·伊德爾曼, 周偉 申請人:斯克利普斯研究所