一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法，該方法綜合采用了微濾澄清純化法，超濾濃縮純化法，重復(fù)洗濾法等一系列工藝，最大限度的增大了PRRSV的回收效率，降低了純化成本。以本發(fā)明制備的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒濃縮液成品尤其適用于制備疫苗，以本發(fā)明制備的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒濃縮液成品制備的疫苗相對于現(xiàn)有技術(shù)的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒疫苗而言安全性高、純凈度高、均一性好、免疫效果好。同時(shí)，本發(fā)明工藝簡便、成本較低，具有突出的推廣前景。
【專利說明】一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病毒純化方法，尤其涉及一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法。
【背景技術(shù)】 [0002]豬繁殖與呼吸障礙綜合征又稱豬藍(lán)耳病，是一種危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病。2006年夏秋季，我國南方部分省份發(fā)生豬“高熱病”疫情，農(nóng)業(yè)部積極組織科研人員聯(lián)合攻關(guān)，確定豬藍(lán)耳病變異病毒為主要病原，定名為“高致病性豬藍(lán)耳病”。直至今日，疫病形勢依然嚴(yán)峻，同其他病毒性疾病一樣，目前尚無有效的治療性藥物用于藍(lán)耳病的治療，免疫接種是防制該病的最有效方法，目前商品化的藍(lán)耳病疫苗主要是由經(jīng)典株制備的弱毒活疫苗和由變異株制備的滅活苗，其安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原純凈性，滅活工藝及佐劑等因素的影響。商品化疫苗如果直接以細(xì)胞繁殖的病毒液進(jìn)行成品苗的生產(chǎn)，會(huì)受到細(xì)胞破碎產(chǎn)物，培養(yǎng)基成分，細(xì)胞代謝產(chǎn)物等雜質(zhì)的影響，致使疫苗免疫動(dòng)物后易發(fā)生過敏反應(yīng)，發(fā)熱反應(yīng)等副作用。所以，提高病毒滴度和抗原純凈性是提升疫苗質(zhì)量基本途徑。
[0003]中空纖維膜過濾技術(shù)屬于切向流過濾技術(shù)(Tangential Flow Filtration, TFF)的范疇，又稱錯(cuò)流過濾(Cross-Flow Filtration, CFF):料液以一定的流速在膜的上表面循環(huán)，小于膜孔徑的物質(zhì)可以透過膜到透過端，而大于膜孔徑的物質(zhì)會(huì)被膜截留，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的濃縮以及不同物質(zhì)的分級(jí)分離。
[0004]和傳統(tǒng)的平板膜包相比，中空纖維柱具有纖維管狀的開放式流道結(jié)構(gòu)，無篩網(wǎng)的管狀流道結(jié)構(gòu)避免了料液的無規(guī)則劇烈湍流，因此具有更低的剪切力，溫和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脫落和蛋白的聚集，有利于保護(hù)病毒的完整性，防止病毒顆粒聚集的同時(shí)有助于雜蛋白的透過和去除。
[0005]目前，對于豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PPRSV)的中空纖維澄清純化及濃縮工藝尚無報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒疫苗均一性差、免疫效果差等技術(shù)問題，提供一種使用微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法，該方法通過微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)，過程如下:
[0009]I系統(tǒng)的組裝
[0010]無菌條件下，將微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)按照組裝要求進(jìn)行組裝。在微濾澄清純化系統(tǒng)中可安裝無菌0.45 μ m或0.65 μ m、完整無損的中空纖維微濾膜,在超濾濃縮純化系統(tǒng)中可安裝無菌100KD或300KD、完整無損的中空纖維超濾膜。[0011]2系統(tǒng)完整性檢測
[0012]壓力保持法檢測系統(tǒng)的完整性。
[0013]3系統(tǒng)的處理
[0014]3.1清洗及滅菌
[0015]將0.5M NaOH溶液注滿純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐，浸泡處理20min，開啟循環(huán)泵300rpm，進(jìn)行純化系統(tǒng)的清洗及滅菌處理30min。 [0016]3.2水洗及通量檢測
[0017]滅囷結(jié)束后，排盡系統(tǒng)內(nèi)的NaOH溶液。將無囷超純水注?兩系統(tǒng)的進(jìn)料--!，開啟循環(huán)泵，300rpm循環(huán)30min，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的液體，如此反復(fù)水洗，直至純化系統(tǒng)內(nèi)PH為7.0左右。
[0018]3.3PBS 處理
[0019]水洗結(jié)束后，棄盡最后一次超純水。將0.1M PBS溶液注滿進(jìn)料罐，開啟循環(huán)泵300rpm循環(huán)沖洗20min。
[0020]上述所述技術(shù)方案中，步驟3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、滅菌作用，也可選用50%~80%的酒精溶液，或采用蒸汽滅菌的方式進(jìn)行系統(tǒng)滅菌。
[0021]一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法，該方法通過微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟:
[0022]I)將無菌的吐溫20按0.5%~10%(v/v)的比例加入豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)病毒液中，振蕩處理；
[0023]2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐中，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間后經(jīng)0.45或0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾，收集透過液待用；
[0024]3)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過液，得到第一洗濾液待用；
[0025]4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過液，得到第二洗濾液待用；
[0026]5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過液，得到第三洗濾液待用；
[0027]6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液；
[0028]7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，經(jīng)100KD或300KD中空纖維超濾柱進(jìn)行過濾處理，棄去透過液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為初級(jí)濃縮病毒液；
[0029]8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的初級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，棄去透過液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為二級(jí)濃縮病毒液；
[0030]9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的二級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間，棄去洗濾液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為三級(jí)濃縮病毒液；
[0031]10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的三級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間，棄去洗濾液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
[0032]將上述制備的病毒濃縮液成品保存于_20°C。
[0033]上述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法，采用的是二步純化法，第一步通過較大孔徑的澄清純化濾膜過濾病毒液，除去毒液中的細(xì)胞碎片；第二步通過較小孔徑的澄清純化濾膜洗濾第一步的濾過液，達(dá)到除去病毒液中的吐溫20、小分子蛋白，細(xì)胞代謝產(chǎn)物的小分子物質(zhì)等雜質(zhì)及實(shí)現(xiàn)濃縮病毒等目的。
[0034]上述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法中，步驟I)所述的振蕩處理時(shí)間優(yōu)選為IOmin ;步驟I)所述的比例優(yōu)選為5% ;步驟2)所述的微濾的濾膜孔徑優(yōu)選為0.65 μ m ;步驟7)所述的超濾濾膜孔徑優(yōu)選為300KD ;步驟2、3、4、5、7、8、9、10中所述的開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間的操作條件均優(yōu)選為500rpm循環(huán)30min ;利用該方法制備的病毒濃縮液成品用于制備疫苗；上述所述病毒澄清純化及濃縮方法，步驟2)中透過液的體積可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，優(yōu)選為透過液體積達(dá)到原液的90% ;步驟7)中的濃縮倍數(shù)可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整，優(yōu)選為濃縮10倍以上。
[0035]上述技術(shù)方案中，步驟I)所述的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒液是指制備得到的病毒原液，未經(jīng)稀釋處理；步驟I)加入吐溫20起到乳化作用，能夠有效避免病毒粒子聚集成團(tuán)，從而提升后續(xù)過濾效率。
[0036]所述微濾澄清純化系統(tǒng)是指GE公司制造的FlexStand中空纖維澄清純化系統(tǒng)；所述微濾膜可以選自GE公司制造的、型號(hào)為CFP-6-D-9A，CFP-4-E-9A的Xample微濾柱膜；所述超濾膜可以選自GE公司制造的、型號(hào)為UFP-300-C-9A，UFP-100-C-9AXample的超濾柱膜。
[0037]上述制備的病毒濃縮液檢測方法如下:
[0038]對純化濃縮工藝過程中的病毒樣品進(jìn)行病毒滴度及蛋白濃度進(jìn)行檢測，以分析濃縮工藝的有效性。其中病毒滴度的檢測方法為:
[0039]以TCID5tl法對各樣品的病毒滴度進(jìn)行檢測，純化有效的判定標(biāo)準(zhǔn)為:濃縮純化及重復(fù)洗濾的洗濾液檢測不出存活病毒；濃縮液的病毒回收率在80%以上。
[0040]蛋白含量的測定方法為:
[0041]以蛋白濃度測定試劑盒對濃縮病毒液的蛋白殘存量進(jìn)行測定，可溶性蛋白的殘存量應(yīng)低于原液可溶性蛋白的10%,表明工藝有效。
[0042]以上對本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
進(jìn)行了詳細(xì)說明。本發(fā)明的純化方法綜合采用了微濾澄清純化法，超濾濃縮純化法，重復(fù)洗濾法等一系列工藝，最大限度的增大了 PPRSV的回收效率，降低了純化成本。以本發(fā)明制備的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒濃縮液生產(chǎn)的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒疫苗相比于現(xiàn)有生產(chǎn)方式生產(chǎn)的疫苗，具有純凈度高，安全性高，均一性好、免疫效果好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，本發(fā)明工藝簡便、成本較低，具有突出的規(guī)?；瘧?yīng)用前
旦
-5^ O
【具體實(shí)施方式】
[0043]實(shí)施例所用儀器型號(hào)如下:
[0044]FlexStand中空纖維澄清純化系統(tǒng)；
[0045]Xample 微濾柱:CFP-6-D_9A (0.65 μ m)，CFP-4-E-9A (0.45 μ m)；
[0046]Xample 超濾柱:UFP-300-C_9A (300KD)，UFP-100-C-9A (100KD)；
[0047]上述儀器均購自GE公司。
[0048]實(shí)施例所用試劑如下:[0049]IOOL豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒液，107-3TCID50/ml,由本公司生產(chǎn)；
[0050]豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體檢測試劑盒，購自愛德士公司；
[0051]0.5M NaOHlOOL ；
[0052]無菌0.1M PBS100L ；
[0053]無菌高純水100L。
[0054]吐溫20，分析純。
[0055]實(shí)施例1
[0056]I操作流程
[0057]1.1前處理
[0058]1.1.1系統(tǒng)的 組裝
[0059]無菌條件下，將澄清純化系統(tǒng)和濃縮系統(tǒng)按照組裝要求進(jìn)行組裝。在澄清系統(tǒng)中可安裝無菌0.65 μ m、完整無損的中空纖維微濾膜，在濃縮系統(tǒng)中安裝孔徑為300KD的無菌中空纖維超濾膜。
[0060]1.1.2系統(tǒng)完整性檢測
[0061]壓力保持法檢測純化系統(tǒng)的完整性。
[0062]1.1.3系統(tǒng)的處理
[0063]清洗及滅菌:
[0064]將0.5M NaOH溶液注滿系統(tǒng)的進(jìn)料罐，浸泡處理20min，開啟循環(huán)泵300rpm，進(jìn)行系統(tǒng)的清洗及滅菌處理30min。
[0065]水洗及通量檢測:
[0066]滅囷結(jié)束后，排盡系統(tǒng)內(nèi)的NaOH溶液。將無囷超純水注?兩系統(tǒng)的進(jìn)料--!，開啟循環(huán)泵，300rpm循環(huán)30min，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的液體，如此反復(fù)水洗，直至系統(tǒng)內(nèi)PH為7.0左右。
[0067]PBS 處理:
[0068]水洗結(jié)束后，棄盡最后一次超純水。將0.1M PBS溶液注滿進(jìn)料罐，開啟循環(huán)泵300rpm循環(huán)沖洗20min。
[0069]1.2病毒的澄清純化
[0070]1.2.1病毒液的處理
[0071]將5L無菌吐溫20加入100L豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PPRSV)病毒液中，振蕩處理lOmin。
[0072]1.2.2病毒液的澄清
[0073]澄清純化系統(tǒng)處理完畢后，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的PBS溶液，將振蕩處理后的病毒液，注入澄清純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐中，開啟循環(huán)泵，500rpm循環(huán)30min,經(jīng)0.65 μ m中空纖維微濾柱進(jìn)行過濾純化處理，收集透過液90L，進(jìn)料罐內(nèi)存留截留液10L。
[0074]1.2.3截留液的洗濾
[0075]第一次洗濾:
[0076]將IOL無菌的0.1M PBS加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵500rpm循環(huán)30min，收集透過液10L，記為洗濾液I。
[0077]第二次洗濾:
[0078]將IOL無菌的0.1M PBS加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵500rpm循環(huán)30min,收集透過液10L，記為洗濾液2。
[0079]第三次洗濾:
[0080]將IOL無菌的0.1M PBS加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵500rpm循環(huán)30min,收集透過液10L，記為洗濾液3。
[0081]1.2.4病毒液的收集
[0082]將上述澄清純化過程所收集的透過液及三次洗濾液混合均勻，得到混合液120L。
[0083]1.2.5初級(jí)濃縮
[0084]濃縮系統(tǒng)處理完畢后，將混合液注入濃縮系統(tǒng)的進(jìn)料罐，開啟循環(huán)泵，500rpm循環(huán)30min,經(jīng)300KD中空纖維超濾柱進(jìn)行純化處理,棄去透過液,進(jìn)料罐中剩余截留液10L,記為初級(jí)濃縮病毒液。
[0085]1.2.6濃縮液的洗濾
[0086]第一次洗濾:
[0087]將10L0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的初級(jí)濃縮液中，重懸，開啟循環(huán)泵，500rpm循環(huán)30min，棄去透過液10L， 進(jìn)料罐中剩余截留液10L，記為二級(jí)濃縮病毒液。
[0088]第二次洗濾:
[0089]將10L0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的二級(jí)濃縮液，重懸，開啟循環(huán)泵，500rpm循環(huán)30min，棄去洗濾液10L，進(jìn)料罐中剩余截留液10L，記為三級(jí)濃縮病毒液。
[0090]第三次洗濾:
[0091]將10L0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的三級(jí)濃縮液，重懸，開啟循環(huán)泵，500rpm循環(huán)30min，棄去洗濾液10L，進(jìn)料罐中剩余截留液10L，即為病毒濃縮液成品。
[0092]1.2.7病毒液的收集
[0093]將經(jīng)過上述處理后的得到的病毒濃縮液成品進(jìn)行收集，保存于-20°C。
[0094]2有效性檢測
[0095]對純化濃縮工藝過程中的病毒樣品進(jìn)行病毒滴度及蛋白濃度進(jìn)行檢測，以分析濃縮工藝的有效性。
[0096]其中病毒滴度的檢測方法為:
[0097]將濃縮后病毒用細(xì)胞維持液做10倍系列稀釋，取KT1~10,10個(gè)稀釋度接種96孔培養(yǎng)板Marc-145細(xì)胞單層，每個(gè)稀釋度重復(fù)8孔，每孔0.1ml，5%C02、37°C培養(yǎng)120小時(shí)，觀察細(xì)胞病變(CPE)，計(jì)算TCID5tlt5檢測結(jié)果證實(shí)，濃縮液每0.1ml病毒含量IO7 tlTCID5ci，濃縮階段的洗濾液無效價(jià)，病毒回收率接近100%。
[0098]蛋白含量的測定方法為:
[0099]取各樣品以BCA蛋白濃度試劑盒進(jìn)打測定，結(jié)果顯不，可溶性蛋白殘存率為9.3%。
[0100]3疫苗制備
[0101]以上述工藝制備的病毒濃縮液作為原料，進(jìn)一步制備疫苗，其工藝步驟如下:
[0102]將純化濃縮的PRRSV病毒液以0.01M的PBS按照濃縮倍數(shù)進(jìn)行稀釋。將稀釋后的病毒液與純化前的病毒液分別以體積比1:1與5%蔗糖脫脂乳穩(wěn)定劑進(jìn)行混合并分裝凍干，20頭份/瓶，分別記為PRRSV活疫苗1、PRRSV活疫苗2。
[0103]4疫苗安全檢驗(yàn)
[0104]以上述工藝制備的PPRSV滅活疫苗1，PPRSV滅活疫苗2，無菌0.1M PBS溶液作為實(shí)驗(yàn)材料；取20日齡PPRSV抗體陰性健康易感仔豬15頭作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。具體操作步驟如下:
[0105]4.1動(dòng)物分組
[0106]將15頭仔豬隨機(jī)分為3組，每組5頭。
[0107]4.2疫苗免疫 [0108]以0.01M PBS將疫苗進(jìn)行溶解，Iml/頭份。
[0109]頸部注射兩種疫苗及PBS于實(shí)驗(yàn)用仔豬，如下操作:
[0110]第一組，每頭仔豬頸部肌肉注射4ml PPRSV活疫苗1，共5頭；
[0111]第二組，每頭仔豬頸部肌肉注射4ml PPRSV活疫苗2，共5頭；
[0112]第三組，每頭仔豬頸部肌肉注射4ml PBS，共5頭。
[0113]疫苗免疫后連續(xù)觀察28天。
[0114]4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0115]免疫后，各組仔豬均無不良反應(yīng)，注射部位吸收良好。
[0116]5疫苗效力檢驗(yàn)
[0117]5.1仔豬免疫試驗(yàn)
[0118]以PPRSV活疫苗I，PPRSV活疫苗2，無菌0.1M PBS溶液作為實(shí)驗(yàn)試劑，取30日齡PPRSV抗體陰性健康易感仔豬15頭作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:
[0119]5.1.1試驗(yàn)動(dòng)物分組
[0120]將15頭仔豬隨機(jī)分為3組，每組5頭。
[0121]5.1.2疫苗免疫
[0122]頸部肌肉注射兩種疫苗及PBS于試驗(yàn)用仔豬，如下操作:
[0123]第一組，每頭仔豬頸部肌肉注射Iml PPRSV活疫苗1，共5頭；
[0124]第二組，每頭仔豬頸部肌肉注射Iml PPRSV活疫苗2，共5頭；
[0125]第三組，每頭仔豬頸部肌肉注射Iml PBS，共5頭。
[0126]5.1.3采血及抗體檢測
[0127]免疫之前及免疫后每周采血一次，共6次，分離血清，用于血清抗體檢測；每周測
量體重。
[0128]5.1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0129]I)三組動(dòng)物免疫攻毒后增重?zé)o明顯差異。
[0130]2)免疫后I個(gè)月內(nèi)，PRRSV活疫苗I組仔豬抗體轉(zhuǎn)陽時(shí)間明顯早于PRRSV活疫苗2組；免疫后期抗體水平差異不明顯。
[0131]綜上所述，利用本發(fā)明純化得到的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒濃縮純化液成品適用于制備豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒疫苗，其安全性良好、免疫效力顯著。
[0132]實(shí)施例2
[0133]I)將無菌吐溫20按10%(v/v)的比例加入豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PPRSV)病毒液中，振蕩處理；
[0134]2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐中，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間后經(jīng)0.45 μ m中空纖維微濾柱微濾，收集透過液待用；
[0135]3)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過液，得到第一洗濾液待用；
[0136]4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過液，得到第二洗濾液待用；
[0137]5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過液，得到第三洗濾液待用；
[0138]6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液；
[0139]7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，經(jīng)100KD中空纖維超濾柱進(jìn)行過濾處理，棄去透過液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為初級(jí)濃縮病毒液；
[0140]8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的初級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，棄去透過液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為二級(jí)濃縮病毒液；
[0141]9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的二級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間，棄去洗濾液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為三級(jí)濃縮病毒液；[0142]10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的三級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間，棄去洗濾液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
[0143]實(shí)施例3
[0144]I)將無菌吐溫20按0.5%(v/v)的比例加入豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PPRSV)病毒液中，1000rpm振蕩處理IOmin ；
[0145]2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐中，開啟循環(huán)泵以500rpm的條件循環(huán)30min,而后經(jīng)0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾,收集透過液待用；
[0146]3)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵以500rpm的條件循環(huán)30min，收集透過液，得到第一洗濾液待用；
[0147]4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過液，得到第二洗濾液待用；
[0148]5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過液，得到第三洗濾液待用；
[0149]6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液；
[0150]7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮系統(tǒng)的進(jìn)料罐，開啟循環(huán)泵以500rpm的條件循環(huán)30min,經(jīng)100KD中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾處理,棄去透過液,收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為初級(jí)濃縮病毒液；
[0151]8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的初級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵以500rpm的條件循環(huán)30min,棄去透過液,收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為二級(jí)濃縮
病毒液；
[0152]9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的二級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵以500rpm的條件循環(huán)30min,棄去洗濾液,收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為三級(jí)濃縮
病毒液；
[0153]10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的三級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵以500rpm的條件循環(huán)30min，棄去洗濾液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。[0154]以上對本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。 凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法，其特征在于使用微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)，并包括以下步驟: 1)將無菌的吐溫20按0.5%~10%(v/v)的比例加入豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)病毒液中，振蕩處理； 2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐中，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間后經(jīng)0.45或0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾,收集透過液待用； 3)以l:l(v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過液，得到第一洗濾液待用； 4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過液，得到第二洗濾液待用； 5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過液，得到第三洗濾液待用； 6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液； 7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，經(jīng)100KD或300KD中空纖維超濾柱進(jìn)行過濾處理，棄去透過液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為初級(jí)濃縮病毒液； 8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的初級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，棄去透過液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為二級(jí)濃縮病毒液； 9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的二級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間，棄去洗濾液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為三級(jí)濃縮病毒液； 10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的三級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間，棄去洗濾液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法，其特征在于步驟I)所述的振蕩處理時(shí)間為lOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法，其特征在于步驟I)所述的比例為5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法，其特征在于步驟2)所述的微濾的濾膜孔徑為0.45或0.65 μ m,較優(yōu)的為0.65 μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法，其特征在于步驟7)所述的超濾濾膜孔徑為300KD。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法，其特征在于步驟2、3、4、5、7、8、9、10中所述的開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間的操作條件均為500rpm循環(huán)30mino
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6所述的一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒純化方法，其特征在于利用該方法制備的病毒濃縮液用于制備疫苗。
【文檔編號(hào)】C12N7/02GK103937754SQ201410145400
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】米娜, 吳全忠, 李倬, 丁旭娜, 呂茂杰, 楊保收, 梁武, 李守軍 申請人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司