豬流行性腹瀉病毒熒光定量pcr檢測方法及其引物的制作方法
【專利摘要】一種生物【技術領域】的豬流行性腹瀉病毒熒光定量PCR檢測方法及其引物，通過PCR擴增、克隆獲得陽性重組質(zhì)粒，然后以已知濃度的目的基因作為模板進行熒光定量PCR反應，作出標準曲線圖以及標準曲線，用于測算出待測樣品中的病毒含量；通過樣品檢測結果與標準曲線對比，確定樣品中試劑的目的基因拷貝數(shù)，同時也可以作為實驗室檢測PEDV增殖曲線的一種手段。該方法適用于病毒樣品的臨床檢測，檢測只需在2小時內(nèi)即可完成，大大縮短了檢測時間，能為我國PEDV疫情的防控起到很好的應用作用。
【專利說明】豬流行性腹瀉病毒熒光定量PCR檢測方法及其引物
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種生物基因檢測【技術領域】的方法及檢測引物，具體是一種豬流行性腹瀉病毒N基因Taq Man-MGB熒光定量PCR檢測方法及其引物。
【背景技術】
[0002]豬流行性腹?寫病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)是一種對豬群具有強感染性的病毒，可引起豬群出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐、厭食消瘦的癥狀，尤其對初生仔豬的發(fā)病率和致死率可達90-100%。該病毒引起的豬流行性腹瀉病(Porcine epidemicdiarrhea, PED)1971年首次在比利時爆發(fā)，之后在捷克、中國、韓國、越南及美國等國家均有爆發(fā)。自2010年10月以后，由新的流行株所引起的PED開始在我國和美國等地爆發(fā)，給我國和世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。因此建立快速、靈敏、成本低又操作方便的檢測方法十分必要。
[0003]PEDV編碼四種結構蛋白，分別為纖突⑶蛋白、小膜(E)蛋白、膜內(nèi)蛋白(M)和核衣殼(N)蛋白，其中N蛋白是長度為441個氨基酸，可以廣泛磷酸化，是病毒核糖核蛋白的組成部分，含有3個相對保守的結構域，有6-7個潛在的磷酸化位點。N蛋白的主要功能是在病毒RNA合成過程中發(fā)揮重要作用，可以參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄，它能與細胞膜和磷脂結合，促進病毒核心的形成以及病毒RNA的組裝。由于N蛋白高度保守，且隨著病毒復制過程表達量較高，在豬感染PEDV的早期，即可以檢測到針對N蛋白的抗體。因此N蛋白所有這些特征使得病毒得到準確和盡早診斷提供了可能，可以利用N蛋白來建立針對PEDV分子生物學診斷技術。目前已經(jīng)建立了許多PEDV的熒光定量PCR檢測法，但均與本方法有所不同。
[0004]中國專利文獻號CN103667531A公開(公告)日2014.03.26，公開了一種豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的0RF3保守基因序列為參考，設計、優(yōu)化出一對特異的PCR引物，建立一種快速定量檢測豬流行性腹瀉病毒的SYBRGreenI實時熒光PCR方法。該方法檢測靈敏度比RT-PCR高100倍，并且避免了常規(guī)PCR電泳檢測所帶來的高污染率。因此，該方法具有快速、靈敏、特異、重復性好和能定量檢測等優(yōu)點，該方法可用于豬場PEDV快速檢測。但該技術假陽性率較高，敏感性較低，精確性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，提出一種豬流行性腹瀉病毒熒光定量PCR檢測方法及其引物，根據(jù)豬流行性腹瀉病毒的N基因序列設計引物，通過對熒光定量(RT-PCR)反應條件的優(yōu)化，具有較好的特異性和重復性，比普通PCR檢測方法敏感794倍的同時可以廣泛用于PEDV的快速檢測。
[0006]本發(fā)明可以相對定量地檢測目的基因，該方法適用于病毒樣品的臨床檢測，能為我國PEDV疫情的防控起到很好的應用作 用。由于探針法熒光定量PCR方法的假陽性率低于SYBRGreen染料法，檢測結果更加準確。可以通過樣品檢測結果與標準曲線對比，確定樣品中試劑的目的基因拷貝數(shù)，同時也可以作為實驗室檢測PEDV增殖曲線的一種手段。
[0007]該方法能夠同時適用與對PEDV流行株與經(jīng)典毒株的檢測。該引物的擴增產(chǎn)物為169bp的引物對，并以此設計熒光探針寡核苷酸序列。根據(jù)設計的引物及探針，建立并優(yōu)化熒光定量PCR方法，并通過構建陽性質(zhì)粒，設置標準品為IO9-1O3拷貝數(shù)加至反應體系中，擴增得到標準曲線，標準曲線的線性良好，并且所得的相關系數(shù)為0.999。通過進一步驗證，發(fā)現(xiàn)該方法特異性、敏感性及重復性結果較好。說明該方法在臨床應用上能夠有更高的準確性。同時，與傳統(tǒng)的TCID5tl法測定病毒增殖曲線相比，本方法所測定的PEDV增殖曲線符合病毒增殖規(guī)律，可以作為一種快速的測定增殖曲線的方法。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0009]本發(fā)明涉及一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的引物，包括如Seq ID N0.1所示的上游引物序列PEDV-Pl^BSeq ID N0.2所示的下游引物序列PEDV-P2及如Seq ID N0.3所示的探針PEDV-MGB。
[0010]本發(fā)明涉及一種豬流行性腹瀉病毒熒光定量PCR檢測方法，PCR擴增、克隆獲得陽性重組質(zhì)粒，然后以已知濃度的目的基因作為模板進行熒光定量PCR反應，作出標準曲線圖以及標準曲線，用于測算出待測樣品中的病毒含量。
[0011]所述的PCR擴增、克隆是指:采用上述上、下游引物進行PCR擴增目的片段，鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物，克隆到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選挑取陽性克隆。
[0012]所述的標準曲線是指質(zhì)粒濃度與Ct值的比例曲線，該標準曲線通過以下步驟獲得:由質(zhì)粒提取試劑盒提取重`組質(zhì)粒，用紫外分光光度計測定0D260nm值，并將質(zhì)粒濃度換算成拷貝數(shù)/ μ L，對模板進行定量RT-PCR反應，并在每一循環(huán)的延伸溫度結束時采集熒光信號進行實時檢測；最后進行熔解曲線分析PCR擴增產(chǎn)物的特異性。
[0013]所述的模板是指:已知病毒拷貝數(shù)的標準DNA模板，經(jīng)10倍系列稀釋，且同一稀釋梯度做重復孔對照，優(yōu)選為每個模板濃度做3個重復，取平均值計算變異系數(shù)。
[0014]所述的熒光定量PCR反應體系總體積為25μ L，包括:10XEX TaqBuffer (Mg2+plus) 2.5 μ L,dNTP Mixture (各 2.5mM) 2.5 μ L、250 μ M 的上、下游引物各 I μ L、5U/ μ L 的 Ex Taq0.2 μ L、IOpmoI/ μ L 的探針 0.5 μ L、質(zhì)粒模板 I μ L、DEPC 水 16.3 μ L。
[0015]所述的熒光定量PCR反應條件如下:94°C預變性2min，再以40個循環(huán)進行PCR擴增，每循環(huán)以94°C變性20s，50。。延伸20s，最后72°C延伸IOmin0
技術效果
[0016]本發(fā)明檢測樣本病毒滴度在IO6-1Oa 1TCID5tl之間，Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)之間呈現(xiàn)很好的線性關系，相關系數(shù)R2=0.999。以不同病毒(豬輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒由本發(fā)明室采集保存，豬瘟病毒疫苗株和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒疫苗株均購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所)的DNA作為模板，同時設陰性和陽性對照，進行熒光定量PCR檢測。結果顯示只有陽性對照出現(xiàn)擴增曲線，其他均未出現(xiàn)擴增曲線，表明該方法特異性強。在同一反應體系進行批間重復，每個樣品3個重復，Ct值(即每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))變異系數(shù)分別為:0.94%,0.72%,0.54%，均小于5%。表明誤差都非常小，擴增效率穩(wěn)定。
[0017]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的技術效果在于，可以相對定量地檢測目的基因，由于探針法熒光定量PCR方法的假陽性率低于SYBR Green染料法，檢測結果更加準確?？梢酝ㄟ^樣品檢測結果與標準曲線對比，確定樣品中試劑的目的基因拷貝數(shù)，同時也可以作為實驗室檢測PEDV增殖曲線的一種手段。該方法適用于病毒樣品的臨床檢測，能為我國PEDV疫情的防控起到很好的應用作用。本發(fā)明采用TaqMan熒光定量PCR，相比普通PCR檢測方法特異性高，假陽性低，擴增與檢測一步完成，不易污染，不需要對產(chǎn)物進行電泳等后期處理，操作更簡便，檢測只需在2小時內(nèi)即可完成，大大縮短了檢測時間。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明熒光定量PCR擴增動力學曲線示意圖。
[0019]圖2為本發(fā)明熒光定量PCR標準曲線示意圖。
[0020]圖3為本發(fā)明普通PCR檢測方法電泳圖；
[0021]圖中M:分子量標準DL2000 ;1_7泳道從左到右依次加入模板病毒的毒價分別為ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、102、IO1TCID50O
[0022]圖4為本發(fā)明PEDV N基因熒光定量PCR方法特異性實驗示意圖。
【具體實施方式】
[0023]下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1
[0024]I)設計、合成引物和探針
[0025]根據(jù)本發(fā)明室保存的PEDV毒株HLJ/2011的N基因序列，比對GenBank中PEDVCV777、fcl/87、CH/S、ZJCZ4、CHGD1、BJ-2012-1毒株的N基因設計特異性引物，擴增目的片段大小為169bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0026]上游引物如Seq ID N0.1所示，下游引物如Seq ID N0.2所示。
[0027]2) N基因的克隆
[0028]待VERO細胞長到單層約90%密度時，將培養(yǎng)基棄去并用PBS溶液漂洗2次，按照Μ0Ι: 0.5的量將PEDV-HLJ/2011病毒液加入T25培養(yǎng)瓶中，并補充含10 μ g/mL胰酶的無血清DMEM培養(yǎng)基至lmL。將培養(yǎng)瓶放入37°C培養(yǎng)箱中孵育2h，在孵育過程中每隔15min輕輕晃動培養(yǎng)瓶，待孵育結束后加入4mL細胞維持液(含有10 μ g/mL胰酶、2%的DMEM)后繼續(xù)培養(yǎng)約4-5d，每天觀測細胞病變(CPE)情況，待80%的VERO細胞出現(xiàn)CPE后，將培養(yǎng)瓶放入-80°C冰箱，反復凍融3次后，將病毒液取出，以9000g離心5min，取上清_80°C保存?zhèn)溆?。病毒RNA提取按照Q丨AGEN RNeasy?試劑盒的說明書，將250 μ L已離心好的病毒液上清進行總RNA提取。
[0029]按照ThermoReverAid First strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的說明書反轉(zhuǎn)錄，總cDNA樣品保存至-80°C。采用25 μ L的PCR反應體系，反應條件為:94°C預變性2min，再以40個循環(huán)進行PCR擴增， 每循環(huán)以94°C變性20s，50°C延伸20s，最后72°C延伸lOmin。PCR擴增完成后，取10 μ L產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物用Omega瓊脂糖核酸凝膠回收試劑盒純化回收，克隆到PMD18-T載體并轉(zhuǎn)化到DH5 α平板，藍白斑篩選挑取陽性克隆，并進行測序鑒定。
[0030]3)標準曲線的建立
[0031]重組質(zhì)粒由質(zhì)粒提取試劑盒提取，用紫外分光光度計定量，標準品系列稀釋為終濃度在1.53X IO9-1O3拷貝數(shù)/μ L。定量RT-PCR反應體系為25yL，包括:10XEX TaqBuffer (Mg2+plus) 2.5 μ L,dNTP Mixture (各 2.5mM) 2.5 μ L、250 μ M 的上、下游引物各 I μ L、5U/ μ L 的 Ex Taq0.2 μ L、IOpmoI/ μ L 的探針 0.5 μ L、質(zhì)粒模板 I μ L、DEPC 水 16.3 μ L。
[0032]在每一循環(huán)的延伸溫度結束時采集熒光信號進行實時檢測。最后進行熔解曲線分析PCR擴增產(chǎn)物的特異性。每個模板濃度做3個重復，取平均值計算變異系數(shù)，實驗均設陰性對照。
[0033]將計算好拷貝數(shù)的標準DNA模板以10倍系列稀釋，同一稀釋梯度做重復孔對照，進行實時定量PCR擴增，該方法可以檢測到的最低濃度為IOtl lTCID5ci病毒滴度。在稀釋的線性濃度范圍內(nèi)，模板量與對應的Ct值相應之間線性相關，相關系數(shù)為0.999。Ct值分別為27.28,24.32，20.63，17.16，14.08，10.76，7.15，標準曲線的斜率為-3.358，截距為 37.49，直線方程為 Y=-3.358LogX+37.49。
[0034]3)敏感性試驗
[0035]普通PCR最低能檢測到IO3TCID5tl病毒滴度(圖3)，而熒光定量方法能檢測的最低模板量為10°_ 1TCID5tl病毒滴度，比普通PCR檢測方法敏感794倍。
[0036]4)特異性試驗
[0037]利用本發(fā)明建立的實時定量PCR檢測方法，分別檢測了 PEDV、PRRSV疫苗株、TGEV疫苗株、CFSV疫苗株，PoRV疫苗株。結果顯示只有豬流行性腹瀉病毒(PEDV)毒株呈陽性反應，其它病毒均呈陰性(圖4)。
[0038]5)穩(wěn)定性試驗
[0039]取拷貝數(shù)為107，IO6, IO5的模板分別做3次重復試驗，無論是批內(nèi)還是批間Ct值變異系數(shù)均小于5%，說明該方法具有較好的重復性(見下表)。
[0040]熒光定量PCR方法重復性實驗結果
【權利要求】
1.一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的引物，其特征在于，包括如Seq ID N0.1所示的上游引物序列PEDV-Pl^BSeq ID N0.2所示的下游引物序列PEDV-P2及如Seq ID N0.3所示的探針PEDV-MGB。
2.一種豬流行性腹瀉病毒熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，通過PCR擴增、克隆獲得陽性重組質(zhì)粒，然后以已知濃度的目的基因作為模板進行熒光定量PCR反應，作出標準曲線圖以及標準曲線，用于測算出待測樣品中的病毒含量。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增、克隆是指:采用根據(jù)權利要求I所述上、下游引物進行PCR擴增目的片段，鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物，克隆到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選挑取陽性克隆。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征是，所述的標準曲線是指質(zhì)粒濃度與Ct值的比例曲線，該標準曲線通過以下步驟獲得:由質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，用紫外分光光度計測定0D260nm值，并將質(zhì)粒濃度換算成拷貝數(shù)/μ L，對模板進行定量RT-PCR反應，并在每一循環(huán)的延伸溫度結束時采集熒光信號進行實時檢測。
5.根據(jù)權利要求2或4所述的方法，其特征是，所述的標準曲線為:Y=-3.358LogX+37.49，其中:Y表示Ct值，X表示病毒數(shù)量，單位為拷貝數(shù)/mL。
6.根據(jù)權利要求2或4所述的方法，其特征是，所述的模板是指:已知病毒拷貝數(shù)的標準DNA模板，經(jīng)10倍系列稀釋，且同一稀釋梯度做重復孔對照。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征是，每個模板濃度做3個重復，取平均值計算變異系數(shù)。
8.根據(jù)權 利要求2所述的方法，其特征是，所述的熒光定量PCR反應體系總體積為25 μ L,包括:10XEX Taq Buffer (Mg2+plus) 2.5 μ L, dNTP Mixture (各 2.5mM) 2.5 μ L、250 μ M 的上、下游引物各 I μ L、5U/ μ L 的 Ex Taq0.2 μ L、IOpmoI/ μ L 的探針 0.5 μ L、質(zhì)粒模板 I μ L、DEPC 水 16.3 μ Lo
9.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征是，所述的熒光定量PCR反應條件如下:94°C預變性2min，再以40個循環(huán)進行PCR擴增，每循環(huán)以94°C變性20s，50°C延伸20s，最后72°C延伸IOmin0
【文檔編號】C12N15/11GK103866050SQ201410146551
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權日:2014年4月14日
【發(fā)明者】楊志彪, 侯怡軒, 謝春, 趙玉婷, 袁聰俐, 崔立, 華修國 申請人:上海交通大學