一種高通量篩選cyp450酶抑制藥物的試劑盒及其研究方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高通量篩選CYP450酶抑制藥物的試劑盒及其研究方法，屬于藥物安全評(píng)價(jià)領(lǐng)域。試劑盒盒體內(nèi)包括：NADPH再生系統(tǒng)，0.1M磷酸鹽緩沖液，六種混合探針底物；六種混合探針底物的代謝產(chǎn)物；20mg/ml小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒體。通過將NADPH再生系統(tǒng)、六種酶底物和不同濃度的藥物相混合，再與小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒體共孵育于37℃水浴中，LC-MS/MS檢測(cè)六種代謝產(chǎn)物的量來判斷藥物對(duì)CYP450酶活性的抑制作用，計(jì)算IC50值。本試劑盒具有簡單、準(zhǔn)確、穩(wěn)定和方便的優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種高通量篩選CYP450酶抑制藥物的試劑盒及其研究方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高通量篩選CYP450酶抑制藥物的試劑盒及其研究方法，屬于藥物安全評(píng)價(jià)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞色素P450 (CYP450)屬于一種血紅蛋白類酶，廣泛存在于生物體，是微粒體混合功能氧化酶系中最重要的一族氧化酶，分布在多種組織，器官，相對(duì)分子質(zhì)量50kDa，在波長450nm處有最大吸收峰。它參與的生化反應(yīng)有脂肪酸、固醇類生物合成和類固醇激素等內(nèi)源性底物的氧化代謝、外源物和大部分藥物的生物氧化等；它使進(jìn)入機(jī)體的外源物經(jīng)代謝后向兩個(gè)方向發(fā)展:代謝活化和代謝解毒，代謝活化后的產(chǎn)物有較強(qiáng)的毒性，甚至產(chǎn)生致畸、致癌效應(yīng)。
[0003]細(xì)胞色素P450作為和藥物代謝相關(guān)的重要酶類，在藥物代謝中起著相當(dāng)重要的作用，對(duì)其代謝的研究將有助于新藥的開發(fā)，并能幫助人們更加清楚的認(rèn)識(shí)藥物的代謝途徑，減少新藥在人體內(nèi)的副作用，增加藥物療效。醫(yī)藥機(jī)構(gòu)已經(jīng)證明導(dǎo)致死亡的主要原因就是不良藥物相互作用，當(dāng)兩種或更多藥物聯(lián)合使用時(shí)，改變其中一個(gè)藥物的效應(yīng)或毒性導(dǎo)致發(fā)生不良藥物相互作 用。美國的一項(xiàng)研究表明，住院患者的嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生率為6.7%，因藥物相互作用的致死率已排名住院患者死亡原因的第4-5位，近20年內(nèi)，美國FDA先后將已批準(zhǔn)上市的13種新藥從市場(chǎng)撤出，其最主要的原因就是出現(xiàn)了嚴(yán)重的藥物代謝性相互作用。所以，如果一個(gè)藥物對(duì)細(xì)胞色素P450產(chǎn)生抑制，在聯(lián)合用藥的過程中，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素P450對(duì)另一藥物的代謝受阻，從而產(chǎn)生毒性，危害身體，這就是嚴(yán)重的藥物代謝的相互作用之一，因而在前期研發(fā)過程中，研究化合物對(duì)細(xì)胞色素P450是否有抑制相當(dāng)重要，對(duì)于藥物的臨床應(yīng)用有重要的意義。
[0004]由于組合化學(xué)的出現(xiàn)和和快速發(fā)展，使得合成大量有潛在臨床治療功能的化合物速度也大為提高了。然而評(píng)估這些化合物缺乏相應(yīng)的快速檢測(cè)試劑盒和技術(shù)支持，使科研人員需要自制或自配相關(guān)試劑和微粒體，酶抑制的研究方法也不統(tǒng)一和規(guī)范，有對(duì)單個(gè)酶的，也有對(duì)多個(gè)酶的，所有這些對(duì)于沒有經(jīng)過藥物代謝研究培訓(xùn)的醫(yī)務(wù)人員，開展相關(guān)藥物相互作用評(píng)價(jià)工作會(huì)很難，即使做了也經(jīng)常浪費(fèi)大量人力、物力和時(shí)間之后，卻會(huì)因試劑配制不正確、操作不規(guī)范，計(jì)算不專業(yè)等原因?qū)е聼o法獲得準(zhǔn)確的藥物相互作用的信息，從而低估藥物在臨床應(yīng)用時(shí)的相互作用風(fēng)險(xiǎn)，潛在危害較大。而且國內(nèi)外的酶活性檢測(cè)試劑盒主要是對(duì)單個(gè)酶活性影響的檢測(cè)，而且通常使用熒光定量、HPLC檢測(cè)或ELISA檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)靈敏度低，誤差較大，操作復(fù)雜，而且遠(yuǎn)不能滿足高通量快速篩選的要求，對(duì)于評(píng)價(jià)藥物臨床相互作用的風(fēng)險(xiǎn)數(shù)據(jù)不全面，不能模擬真正人體用藥之后整體的情況，因此本領(lǐng)域特別需要有一套全面評(píng)價(jià)藥物相互作用的試劑盒和技術(shù)方法，能夠快速簡單評(píng)價(jià)藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)，特別能夠滿足沒有相關(guān)代謝專業(yè)基礎(chǔ)的科研工作者的藥物評(píng)價(jià)的需要，根據(jù)試劑盒說明書操作即可完成評(píng)價(jià)任務(wù)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種高通量篩選CYP450酶抑制藥物的試劑盒及其研究方法，試劑盒提供包裝盒及完整的試劑搭配，能夠利用試劑盒的使用說明書快速而準(zhǔn)確的進(jìn)行藥物相互作用研究，利用高通量的LC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)各代謝產(chǎn)物的量，計(jì)算IC5tl值，評(píng)價(jià)藥物對(duì)各CYP450酶抑制作用。本檢測(cè)試劑盒及其研究方法主要是為藥物早期篩選和臨床用藥相互作用研究提供技術(shù)支持，特別是為那些剛接觸藥物代謝研究的科研工作者，臨床醫(yī)務(wù)工作者提供了藥物評(píng)價(jià)的物質(zhì)和技術(shù)支持，將可大大縮短研究時(shí)間，提高工作效率，推動(dòng)我國在臨床用藥領(lǐng)域的研發(fā)工作，對(duì)于提高人們的生活質(zhì)量，推動(dòng)醫(yī)學(xué)模式、治療方式及用藥結(jié)構(gòu)改革起到巨大的推動(dòng)作用。
[0006]為了解決現(xiàn)有試劑盒和技術(shù)研究所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案:根據(jù)試劑盒說明書配制NADPH再生系統(tǒng)，通過將不同濃度藥物、混合底物和肝微粒體共同孵育后，利用LC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)FDA推薦的六個(gè)代謝產(chǎn)物，IC50值的計(jì)算根據(jù)GraphPadPrism 5 Project軟件進(jìn)行。IC5(I>50 μ mol/L說明藥物對(duì)CYP450酶無抑制作用，無藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)，IO〈 IC 5(|〈 5 O μ mo I / L說明藥物是弱抑制劑，藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)較小，1<IC50<10 μ mol/L說明藥物是中等抑制劑，IC50<1 μ mol/L說明藥物是強(qiáng)抑制劑，中等和強(qiáng)抑制劑具有藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)一步研究和關(guān)注。.[0007]技術(shù)方案具體實(shí)施:
[0008](a)本發(fā)明試劑盒具有NADPH再生系統(tǒng)=NADPH再生系統(tǒng)包括A液:2.5mmol/LNADPNa2,10U/mL6_磷酸葡萄糖脫氫酶,20mmol/L氯化鎂，B液:50mmol/L6_磷酸葡萄糖。0.lmol/L磷酸緩沖液包括29g磷酸氫二鈉，2.96g磷酸二氫鈉，42.5g氯化鈉，11.8g氯化鉀溶解于I升蒸餾水中。然后通過吸取50 μ LA液+10 μ LB液+180 μ L0.lmol/L磷酸緩沖液作為NADPH再生系統(tǒng)。
[0009](b)本發(fā)明試劑盒具有混合底物和肝微粒體:混合探針底物在250 μ L孵育系統(tǒng)終濃度為非那西丁(5(^11101/1)，咪達(dá)唑侖(2.5 4 11101/1)，甲苯磺丁脲(120 μ mol/L)，右美沙芬(5 4!1101/1)，安非他酮(25 411101/1)，美芬妥英(5(^11101/1)。小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒體在250 μ L孵育系統(tǒng)中蛋白終濃度為0.4mg/ml。試劑盒說明書也提供系列藥物在250 μ L孵育系統(tǒng)合理配制的建議終濃度:0.05、0.15、0.5、1.5、5、15、50、100 μ mol/L,最終
2.5 μ L混合探針底物+2.5 μ L系列藥物濃度+5 μ L20mg/ml小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒體與NADPH再生系統(tǒng)共孵育于37°C水浴中l(wèi)h。
[0010](C)試劑盒說明書提供建立能同時(shí)檢測(cè)六個(gè)代謝產(chǎn)物的LC-MS/MS方法，通過檢測(cè)六個(gè)代謝產(chǎn)物的量來評(píng)價(jià)藥物對(duì)CYP450酶活性的抑制作用:孵育Ih后，用3倍(甲醇:乙腈=1:1)沉淀蛋白，渦旋震蕩2分鐘，14000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清進(jìn)樣于LC-MS/MS，檢測(cè)六種酶代謝產(chǎn)物的量。液相條件:以流動(dòng)相A (含0.1%甲酸和5mM甲酸銨的純水)和B (乙腈)梯度洗脫:30%B (0min)，85%B (1.5-4.5min),30%B (4.6min);柱溫 25°C，流速為
0.35mL.min-1,運(yùn)行時(shí)間5min ;進(jìn)樣體積10 μ L。質(zhì)譜條件:以ESI源正離子MRM方式檢測(cè)，毛細(xì)管溫度320°C，毛細(xì)管電壓+4000V，霧化電壓25psi，干燥氣流速10L/min，其它質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。
[0011] 表1代謝產(chǎn)物的離子對(duì)[0012]
【權(quán)利要求】
1.一種高通量篩選CYP450酶抑制藥物的試劑盒，其組成為=NADPH再生系統(tǒng)；0.1mol/L磷酸鹽緩沖液；混合探針底物；混合探針底物的代謝產(chǎn)物；肝微粒體；所述六種混合探針底物為:非那西丁(5mmol/L),咪達(dá)唑侖(250 μ mol/L),甲苯磺丁脲(12mmol/L),右美沙芬(500 μ mol/L),安非他酮(2.5mmol/L),美芬妥英(5mmol/L);所述六種混合探針底物的代謝產(chǎn)物:撲熱息痛(I μ g/ml), 1-羥基咪達(dá)唑侖(I μ g/ml),4-羥基甲苯磺丁脲(I μ g/ml),右啡燒(I U g/ml),羥基安非他酮(I μ g/ml),4-羥基美芬妥英(I μ g/ml)。
2.按權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于=NADPH再生系統(tǒng)包括A液:2.5mmol/LNADPNa2,10U/mL6-磷酸葡萄糖脫氫酶,20mmol/L氯化鎂，B液:50mmol/L6-磷酸葡萄糖。
3.按權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于:0.lmol/L磷酸緩沖液組成是29g磷酸氫二鈉，2.96g磷酸二氫鈉，42.5g氯化鈉，11.Sg氯化鉀，最終溶解于I升蒸餾水中。
4.按權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于:肝微粒體可以是小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒體中的一種，其濃度為20mg/ml。
5.一種CYP450酶抑制藥物的研究方法，其特征在于包括如下步驟: 1)通過配制245μ L孵育的NADPH再生反應(yīng)體系包括50 μ LA液+10 μ LB液+2.5 μ L混合探針底物+2.5 μ L系列藥物濃度+180 μ L0.lmol/L磷酸緩沖液預(yù)孵育于37°C水浴中5min,再加入20mg/ml小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒體5 μ L,孵育Ih ;所述2.5 μ L混合探針底物在250 μ L孵育系統(tǒng)終濃度為非那西丁(50 μ mol/L),咪達(dá)唑侖(2.5 μ mol/L),甲苯磺丁脲(120 μ mol/L),右美沙芬(5 μ mol/L),安非他酮(25 μ mol/L),美芬妥英(50 μ mol/L)； 2)然后，按體積比為 甲醇:乙腈=1:1的比例配置蛋白沉淀液，用3倍體積的蛋白沉淀液沉淀蛋白，渦旋震蕩2分鐘，14000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清進(jìn)樣于LC-MS/MS，計(jì)算系列藥物濃度對(duì)六種酶的抑制百分率，由GraphPad Prism 5軟件繪制抑制曲線并計(jì)算IC5tl值。
6.按權(quán)利要求5的研究方法，其特征在于:250μ L NADPH再生反應(yīng)體系中NADPNa2終濃度為0.5mmol/L,6-磷酸葡萄糖脫氫酶的終濃度為2U/mL，氯化鎂的終濃度為4mmol/L，6-磷酸葡萄糖的終濃度為lOmmol/L。
7.按權(quán)利要求5的研究方法，其特征在于:系列藥物濃度在250μ L孵育系統(tǒng)終濃度為0.05,0.15,0.5、1.5、5、15、50、100ymol/L，再加一個(gè) Control 組，藥物溶解的有機(jī)相用乙腈溶解，最終整個(gè)孵育體系乙腈的比例控制在1%以下即可，甲醇或二甲基亞砜溶解有機(jī)相比例應(yīng)控制在1%。以下。
8.按權(quán)利要求5的研究方法，其特征在于:小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒體在250μ L孵育系統(tǒng)中蛋白終濃度為0.4mg/ml。
9.按權(quán)利要求5的研究方法，其特征在于:LC-MS/MS的檢測(cè)方法包括: O液相條件:以流動(dòng)相A (含0.1%甲酸和5mM甲酸銨的純水)和B (乙腈)梯度洗脫:30%B (Omin),85%B (1.5-4.5min)，30%B (4.6min);柱溫 25°C，流速為 0.35mL.mirT1，運(yùn)行時(shí)間5min ;進(jìn)樣體積10 μ L ； 2)質(zhì)譜條件:以ESI源正離子MRM方式檢測(cè)，毛細(xì)管溫度320°C，毛細(xì)管電壓+4000V，霧化電壓25psi,干燥氣流速10L/min,其它質(zhì)譜分析參數(shù)見表1, 表1代謝產(chǎn)物的離子對(duì)
10.按權(quán)利要求5的研究方法，其特征在于:由公式I計(jì)算不同濃度藥物作用下的相對(duì)酶活性:
Erel (%) =Ci (n)/Ci (O) X 100% (I) 式中Erel為相對(duì)酶活性，Ci (η)為不同濃度藥物組測(cè)得的代謝產(chǎn)物生成量，Ci (O)為空白對(duì)照組的代謝產(chǎn)物生成量。以相對(duì)酶活性Erel為縱坐標(biāo)，藥物濃度的Log值為橫坐標(biāo)，由GraphPad Prism 5軟件繪制抑制曲線并計(jì)算IC5tl值。IC5(I>50 μ mol/L說明藥物對(duì)CYP450酶無抑制作用，10〈IC5Q〈50 μ mol/L說明藥物是弱抑制劑，1<IC50<10 μ mol/L說明藥物是中等抑制劑，IC5(I〈1 μ mol/L說明藥物是強(qiáng)抑制劑，IC5(I〈10 μ mol/L時(shí)即表明藥物在臨床應(yīng)用時(shí)有可能產(chǎn)生藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/32GK103937869SQ201410146681
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月13日
【發(fā)明者】李海山, 韓輝, 艾文超, 李蕾, 陳會(huì)明 申請(qǐng)人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院