枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH（G665A）及應用，枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH（G665A），是SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明所構(gòu)建的包含有枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH（G665A）的工程菌生物安全，遺傳背景清晰、包含的突變基因yvrH（G665A）可以大幅提高枯草芽孢桿菌合成核黃素的能力，可在搖瓶發(fā)酵條件下，提高核黃素積累水平15%以上。
【專利說明】枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH及應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)與分子生物學領域，具體地涉及一種枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH (G665A)及該基因編碼的氨基酸序列及應用。
【背景技術(shù)】
[0002]以細菌為宿主菌的基因工程菌具有發(fā)酵周期短、原料要求簡單、成熟的基因工程技術(shù)等優(yōu)點。在芽孢桿菌屬中，包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)在內(nèi)的許多菌株具有可靠的安全性。傳統(tǒng)菌株選育發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌的突變株能夠過量合成葉酸、腺苷、肌苷、鳥苷、核黃素等一系列嘌呤途徑代謝中間產(chǎn)物或該途徑的衍生代謝產(chǎn)物，目前成為選育高產(chǎn)核苷類代謝產(chǎn)物重要出發(fā)菌株。作為模式菌株，目前對其生理生化特性及遺傳背景已經(jīng)有了比較深入的了解，相關(guān)的分子生物學方法和基因操作技術(shù)都比較成熟，也有利于通過理性代謝工程及系統(tǒng)生物學手段來選育核苷類代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌種。如核黃素。核黃素(分子式C17H2tlO6N4, IUPAC中文名:7，8_ 二甲基-10- (I’-D-核糖基)-異咯嗪)是人體必需的13種維生素之一，為黃素酶類的輔酶組成部分，在生物體內(nèi)主要以黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在。它作為黃素蛋白的輔酶參與機體組織呼吸鏈電子傳遞及氧化還原反應，在呼吸和生物氧化中起著重要的作用。[0003]雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)(two-componentsignal-transduction system)普遍存在于細菌，是細胞感應各種各樣的環(huán)境刺激和做出相應反饋的重要機制。該機制同樣存在于低等真核生物和低等植物中。典型的雙組分系統(tǒng)通常包括兩個部分，組氨酸蛋白激酶(Sensor kinase)和反應調(diào)節(jié)蛋白(response regulator)。其中組氨酸蛋白激酶感應不同類型的信號(環(huán)境變化)，并通過磷酸轉(zhuǎn)移反應調(diào)控反應調(diào)節(jié)蛋白的功能。通常，磷酸化后的反應調(diào)節(jié)蛋白可以做為轉(zhuǎn)錄增強子或抑制子直接結(jié)合至受其調(diào)節(jié)的基因的啟動子區(qū)域，影響這些被調(diào)芐基因的表達水平，進而使細胞對外界的信號做出正確的生理反應。該系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)各種各樣的細胞過程，比如適應性和滲透性等行為，是允許細胞的基因網(wǎng)絡對于不同的外界環(huán)境做出適應和維持細胞生存能力的重要機制。
[0004]在枯草芽孢桿菌中，參與細胞膜和細胞壁合成調(diào)控的yvrGH系統(tǒng)在細胞生理活動中發(fā)揮重要作用。按照組氨酸磷酸化基序(motif)周圍的氨基酸序列進行分類，yvrG屬于類別Class IIIA，該激酶N-端包含了兩個跨膜區(qū)域，為膜蛋白。而yvrH屬于Class OmpR 類別。YvrGH 系統(tǒng)正調(diào)控 7 個轉(zhuǎn)錄單位(wprA, wapA-yxxG, dltABCDE, sunA,sunT-bdbA-yolJ-bdbB, yvrl-yvrHa 和 sigX-risX),負調(diào)控 IytABC 操縱子。敲除實驗發(fā)現(xiàn)，該雙組分系統(tǒng)的失活可導致細胞對抗生素和抗菌劑敏感性的提高。
[0005]目前，尚未有枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH(G665A)用于核黃素高產(chǎn)菌種的選育的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種能夠提高枯草芽孢桿菌核黃素合成能力的枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供一種枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH所編碼的氨基酸序列。
[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供一種包含有枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH的工程菌。
[0009]本發(fā)明的第四個目的是提供包含有枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH的工程菌的應用。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0011]枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH (G665A)，所述突變基因yvrH(G665A)序列是用SEQ ID N0.1所示。
[0012]枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH (G665A)所編碼的氨基酸序列，所述氨基酸序列是用SEQ ID N0.2所示。
[0013]包含有枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH (G665A)的工程菌。
[0014]包含有枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH (G665A)的工程菌在產(chǎn)核黃素的應用。
[0015]本發(fā)明所構(gòu)建的包含有枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH (G665A)的工程菌生物安全，遺傳 背景清晰、包含的突變基因yvrH (G665A)可以大幅提高枯草芽孢桿菌合成核黃素的能力，可在搖瓶發(fā)酵條件下，提高核黃素積累水平15%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1 為工程菌株 B.subtilis RCU B.subtilis RC2 和 B.subtilis RC3 核黃素合成水平發(fā)酵驗證。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，下述實施例是為了使本領域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但對本發(fā)明不作任何限制。
[0018]本發(fā)明所用到的原始菌株B.subtilisl68 來源為 BGSC(Bacillus Genetic StockCenter, http://www.bgsc.0rg/)。本發(fā)明所用到的原始質(zhì)粒pUC18購買于生工生物工程(上海)股份有限公司(http://www.sangon.com/)。
[0019]本發(fā)明所用到的核黃素標準品從Sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)購買,所用限制性內(nèi)切酶、去磷酸化酶、DNA連接酶等分子生物學試劑從Thermo 公司購買(http://www.thermoscientificbi0.com/fermentas)。所用其他生化試劑從生工生物工程(上海)股份有限公司購買(http://www.sangon.com/)。
[0020]實施例1:無抗生素標記篩選枯草芽孢桿菌系統(tǒng)出發(fā)菌株B.subtilis BUK和基礎操作質(zhì)粒pss的構(gòu)建
[0021]本發(fā)明中所用到的枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株B.subtilis BUK來源于B.subtilisl68,基礎操作質(zhì)粒pSS來源于pUC18，二者詳細構(gòu)建過程可參考公開發(fā)表文獻
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[0022]本發(fā)明對該基礎操作質(zhì)粒pSS的構(gòu)建方法以及抗性基因的選擇不做限定。[0023]實施例2:工程菌株B.subtilis RCl和B.subtilis RC2構(gòu)建過程
[0024](I)向菌株B.subtilis BUK基因組上無痕引入基因突變ribC* (G596A)操作流程如下:
[0025]利用ribC*-F-U、ribC*-F-L和 ribC*-B-U、ribC*-B-L兩對引物，以 B.subtilisl68基因組為模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增分別得到大小為894bp和928bp的上下游同源臂ribC*-F和ribC*-B。ribC*-F的PCR片段經(jīng)切膠回收后，使用Thermo Fastdigest AatII和XhoI雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pSS后得到質(zhì)粒pSS-ribO-F。ribO-B的PCR片段經(jīng)切膠回收后，使用Thermo Fast digest Sail和Seal雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pSS-ribC*-F后得到這質(zhì)粒pSS_ribC*-FB。將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒通過Spizizen轉(zhuǎn)化導入枯草芽孢桿B.subtilis BUK中，用含氯霉素LB固體培養(yǎng)基中篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。挑出的轉(zhuǎn)化子接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，200rpm震蕩培養(yǎng)6h (0D約為2)，并在五氟尿嘧啶基本培養(yǎng)基(添加終濃度為5 μ mol/L FMN)上挑出菌落，使用引物ribC*-F-U、ribC*-B-L進行PCR和測序驗證，得到ribC* (G596A)正確引入的陽性菌株B.subtilis RCl0
[0026](2)向菌株B.subtilis RCl基因組上無痕引入基因突變ribO* (G+39A)具體操作如下:
[0027]利用rib0*-F_U、rib0*-F-L和 rib0*-B_U、rib0*-B-L兩對引物，以 B.subtilisl68基因組為模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增分別得到大小為922bp和1234bp的上下游同源臂rib0*-F和rib0*-B。rib0*-F的PCR片段經(jīng)切膠回收后，使用Thermo Fastdigest AatII和XhoI雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pSS后得到質(zhì)粒pSS-ribO-F。ribO-B的PCR片段經(jīng)切膠回收后，使用Thermo Fast digest Sail和KpnI雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pSS-rib0*-F后得到這質(zhì)粒pSS-rib0*_FB。將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒通過Spizizen轉(zhuǎn)化導入枯草芽孢桿B.subtilis RCl中，用含氯霉素LB固體培養(yǎng)基中篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。挑出的轉(zhuǎn)化子接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，200rpm震蕩培養(yǎng)6h (0D約為2)，并在五氟尿嘧啶基本培養(yǎng)基(添加終濃度為5 μ mol/L FMN)上挑出菌落，使用引物rib0*-F-U、ribO-B_L進行PCR和測序驗證,得到ribO*正確引入的陽性菌株B.subtilisRC2。
[0028]實施例3:工程菌株B.subtilis RC3構(gòu)建(引入枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因 yvrH (G665A))
[0029]利用yvrH*-F_U、yvrH*-F-L和 yvrH*-B-U、yvrH*-B-L兩對引物，以 B.subtilisl68基因組為模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增分別得到大小為1067bp和849bp的上下游同源臂yvrH*_F和yvrH*_B。yvrH*_F的PCR片段經(jīng)切膠回收后,使用Thermo Fastdigest AatII和XhoI雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pSS后得到質(zhì)粒pSS-yvrH*_F。yvrH*_B的PCR片段經(jīng)切膠回收后，使用Thermo Fast digest Sail和KpnI雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pSS-yvrH*-F后得到質(zhì)粒pSS-yvrH*-FB。將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒通過Spizizen轉(zhuǎn)化導入枯草芽孢桿B.subtilis RC2中，用含氯霉素LB固體培養(yǎng)基中篩選重組成功的陽性克隆。將正確的陽性克隆接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，200rpm震蕩培養(yǎng)6h，并在五氟尿嘧啶基本培養(yǎng)基上挑出菌落使用引物yvrH*-F-U、yvrH*-B-L進行PCR和測序驗證，得到突變基因yvrH (G665A)正確引入的陽性菌株，即包含有枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH(G665A)的工程菌，命名為B.subtilis RC3，其中枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH (G665A)和所編碼的氨基酸序列分別用SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0030]LB液體培養(yǎng)基配方為:10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，調(diào)節(jié)pH至
7.5。0.1Mpa壓力下滅菌20min。LB固體培養(yǎng)基配方為:在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉(終濃度15g/L),0.1Mpa壓力下滅菌20min。五氟尿嘧唳基本培養(yǎng)基配方見表1:
[0031 ] 表1五氟尿嘧啶基本培養(yǎng)基配方
[0032]
【權(quán)利要求】
1.枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH，其特征是所述突變基因是SEQIDN0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH所編碼的氨基酸序列，其特征是所述氨基酸序列用SEQ ID N0.2所示。
3.包含有枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH的工程菌。
4.權(quán)利要求 3所述的包含有枯草芽孢桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)突變基因yvrH的工程菌在產(chǎn)核黃素的應用。
【文檔編號】C12N15/31GK103952417SQ201410150235
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】王智文, 王光路, 石婷, 陳濤, 趙學明 申請人:天津大學