一種鑒定煙草pvy抗性的分子標記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學領域，是一種鑒定煙草PVY抗性的分子標記，該分子標記含有SeqIDNo.1所示序列。本發(fā)明還涉及擴增該分子標記的引物、該分子標記和引物在煙草抗病資源篩選和抗病育種輔助選擇中的用途。本發(fā)明的分子標記將基因組DNA序列與煙草PVY抗性基因聯(lián)系起來，有利于煙草分子標記育種輔助選擇體系的建立；所述分子標記與煙草PVY抗性基因的緊密連鎖，連鎖距離為0.99cM。本發(fā)明的分子標記及分子標記擴增引物可以簡便、快速、高通量地應用于煙草育種實踐。
【專利說明】—種鑒定煙草PVY抗性的分子標記
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種分子標記，特別是涉及一種鑒定煙草PVY抗性的分子標記。本發(fā)明還涉及擴增該分子標記的引物、該分子標記和引物在煙草PVY抗病基因定位或煙草遺傳育種中的用途。
【背景技術】
[0002]馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)能侵染34個屬170多種植物，對茄科作物(如:煙草、馬鈴薯、辣椒、番茄等)危害較重。PVY侵染煙草的病害又稱為煙草脈斑病，是一種世界性的流行病害，由于缺乏抗病主栽品種和綜合防治措施難以落實，在我國煙區(qū)危害嚴重。PVY的侵染可使煙草產(chǎn)量減少7%-18%，產(chǎn)值減少11%-80%。1989年，煙草脈斑病導致加拿大煙草業(yè)直接經(jīng)濟損失達100萬美元。1993年脈斑病在我國山東煙區(qū)開始流行，到1998年成為第一大煙草病害。PVY在河南、陜西、黑龍江、遼寧、安徽、貴州和云南的局部煙區(qū)的危害嚴重，給煙葉生產(chǎn)帶來較大損失。
[0003]選育抗PVY的煙草品種是防治該病最經(jīng)濟有效的方法。美國G.Koellent對栽培種Virgin A的變種Virgin A Mutant (VAM)的研究后發(fā)現(xiàn)VAM的PVY的抗性主要是由隱性單基因(va)控制的，對PVY的多個株系、特別是壞死株系具有抗性。Noguchis S.等對VAM遺傳位點的研究后發(fā)現(xiàn)VAM對PVY的抗性是由于大段染色體缺失造成的。這個發(fā)現(xiàn)與VAM來源于X-射線突變體相吻合。是由于對PVY感病的基因缺失造成的。煙草育種利用的PVY抗性重要來源之一為VAM。
[0004]為選育抗病品種，國內(nèi)外鑒定出多個抗PVY的種質資源，如VAM、V.SCR等，并育成抗病白肋煙品種TN86、TN90和烤煙品種NC55、NC102等。大部分抗源的抗性表現(xiàn)為隱性基因(va)控制，是由于對PVY感病的基因缺失造成的。并開發(fā)出與Va位點相關的分子標記(RAPD、SCAR) (Noguchi S.,Mol Gen Genet, 1999, 262:822-829; Julio et al., TheorAppl Genet.2006，112(2):335-346.)?？緹煼N質 RY5 對 PVY 壞死株系(PVYn)的抗性符合孟德爾一對隱性基因控制的質量性狀的遺傳模型，已報道與抗病基因對應的顯性等位基因位點(Va)緊密連鎖的RAPD標記012V3695與SCAR標記PVY MEl (王貴等，分子植物育種，2012，10(1): 97-103)。文獻報道的RAI3D標記和SCAR標記，與PVY抗性的連鎖距離分別為2.1OcM和2.52cM。與PVY抗性的連鎖距離較遠，將導致利用標記數(shù)據(jù)判斷抗性表型誤差較大。RAPD標記存在擴增產(chǎn)物的特異性不高，非目標條帶干擾結果判斷、PCR擴增需要循環(huán)數(shù)多達45個循環(huán)等不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為克服現(xiàn)有分子標記的不足，本發(fā)明提出一種鑒定煙草PVY抗性的分子標記，采用與PVY隱性抗病基因本身序列及其側翼序列，開發(fā)的分子標記與PVY的抗性連鎖距離更近；PCR擴增條件更簡便。因此，利用本發(fā)明的分子標記判斷抗性表型更的準確性更高。利用本發(fā)明的煙草PVY隱性抗病基因的分子標記進行輔助選擇育種，對加快育種進程和提高我國煙草育種水平起到促進作用。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供一種可用于PCR擴增與煙草PVY隱性抗病基因緊密連鎖的分子標記的引物對，以及由該引物對擴增獲得的分子標記。
[0007]本發(fā)明的再一目的是提供上述分子標記在煙草PVY隱性抗病基因檢測的用途以及在煙草育種輔助選擇中的用途。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案:
[0009]一種鑒定煙草PVY抗性的分子標記，所述分子標記含有SeqID N0.1所示序列；優(yōu)選的所述分子標記具有Seq ID N0.1所示序列。
[0010]本發(fā)明還公開了一種擴增與鑒定煙草PVY抗性的分子標記的引物對，所述引物對的CF2含有Seq ID N0.2所示序列，GRll含有Seq ID N0.3所示序列；優(yōu)選的所述CF2具有Seq ID N0.2所示序列，GRll具有Seq ID N0.3所示序列；
[0011]Seq ID N0.2:5’ -TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT-3’ ；
[0012]Seq ID N0.3:5’ -GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT-3，。
[0013]本發(fā)明還公開了一種與煙草PVY隱性抗病基因緊密連鎖的分子標記，所述分子標記是由上述的引物 對以感PVY煙草基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴增得到的。
[0014]優(yōu)選的由上述引物對擴增得到的分子標記含有Seq ID N0.1所示序列。
[0015]在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標記(含有Seq ID N0.1所示核苷酸序列的DNA片段)為煙草基因組中含有Seq ID N0.1所示核苷酸序列的DNA片段，即包含的SeqID N0.1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列，優(yōu)選的，為煙草基因組中Seq ID N0.1的5’端和/或3’端的上下游序列。本領域技術人員可以理解，只要擴增或者檢測感PVY的煙草基因組DNA中的該分子標記，必然能夠檢測或擴增到含有SeqID N0.1所示的序列。SeqID N0.1的5’端和/或3’端的上下游序列的長度為適當長度，并不特別限定，例如，滿足分子標記的長度小于10，OOObp、小于5，OOObp、小于2，000bp、小于I, 200bp、小于I, 200bp、小于1，OOObp、或者小于800bp。
[0016]本發(fā)明還公開了本發(fā)明的分子標記的制備方法，包括下述步驟:使用感PVY的煙草的基因組DNA作為模板，以上述引物對進行PCR擴增，得到的446bp擴增產(chǎn)物即含有所述分子標記；優(yōu)選地，還包括將PCR擴增產(chǎn)物進行純化和測序的步驟。
[0017]對本領域技術人員而言，可以理解，也可以DNA化學合成的方法得到本發(fā)明的分子標記。
[0018]本發(fā)明還公開了所述分子標記的檢測方法，包括步驟:根據(jù)含有上述分子標記的核苷酸序列設計引物，以被檢測煙草基因組DNA為模板進行擴增，并判斷擴增產(chǎn)物中是否存在該分子標記。優(yōu)選的，所述引物為上述分別含有Seq ID N0.2和Seq ID N0.3的引物對。
[0019]例如，可以以被檢測煙草的基因組DNA為模板，以上述引物(Seq ID N0.2和SeqIDN0.3)進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物。可以將得到的擴增產(chǎn)物進行測序或者凝膠電泳。
[0020]本發(fā)明還公開了所述的分子標記在煙草種質PVY抗性鑒定中的用途。所述方法包括檢測本發(fā)明的分子標記或使用本發(fā)明中擴增分子標記的引物對的步驟。
[0021]本發(fā)明還公開了所述的分子標記在煙草育種輔助選擇中的用途。
[0022]本發(fā)明的分子標記可用于分子標記育種輔助選擇中，本領域技術人員可以理解，比如通過檢測是否存在本發(fā)明的分子標記來篩選煙草是否抗PVY(例如，可以參考，高藍，DNA分子標記在番爺遺傳育種研究中的應用，遺傳,2003, 25 (3):361-366)。所述檢測可以是PCR檢測的方法，具體地，可以使用上述的本發(fā)明的擴增分子標記的引物對。所述檢測還可以通過測序方法進行。該煙草育種輔助選擇方法具有簡便、快速、高通量的優(yōu)點。
[0023]由于采用以上技術方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于:
[0024]本發(fā)明提供了與煙草PVY隱性抗病基因緊密連鎖的分子標記，該分子標記將基因組DNA序列與煙草PVY隱性抗病基因聯(lián)系起來，有利于煙草分子標記育種輔助選擇體系的建立；所述分子標記與煙草PVY隱性抗病基因的遺傳緊密連鎖距離為0.99cM。與文獻已報道的相關分子標記相比，本發(fā)明所述分子標記是與特異抗病基因連鎖的分子標記，具有連鎖距離更近，檢測操作簡便，結果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點。本發(fā)明的分子標記及分子標記擴增引物可以簡便、快速、高通量地應用于煙草育種實踐和資源及品種鑒定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為引物CF2GR11在抗感品種間的多態(tài)性:分子標記引物(Seq ID N0.2和SeqID N0.3)對6個PVY抗性明確單株的擴增結果。其中:泳道M為Marker，其為IOObp DNALadder ;其分子量包括:1200bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、200bp、400bp、300bp、200bp以及IOObp。泳道陰性對照為水。
【具體實施方式】
[0026]本發(fā)明公開了一種引物對以及與煙草PVY隱性抗病基因緊密連鎖的分子標記PVYOl0利用本發(fā)明的引物對，以煙草基因組DNA為模板進行PCR，可以得到與煙草PVY隱性抗病基因緊密連鎖的分子標記，該分子標記在本發(fā)明中命名為分子標記PVY01。需要指出的是，本領域技術人員可以理解，除了通過上述PCR擴增獲得本發(fā)明的分子標記外，還可以通過化學合成獲得本發(fā)明的分子標記。
[0027]本發(fā)明的引物對分別含有序列表Seq ID N0.2和Seq ID N0.3所示序列，
[0028]Seq ID N0.2:5，-TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT-3，；
[0029]Seq ID N0.3:5’ -GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT-3，。
[0030]本領域技術人員熟知，在上述Seq ID N0.2和Seq ID N0.3所示序列中，可在其5’端或3’端分別增加I~10個堿基，所增加的堿基類型可根據(jù)煙草基因組DNA上與SeqIDN0.2和Seq ID N0.3相匹配區(qū)域的堿基類型并依據(jù)堿基配對原則來確定，由此得到的引物對與Seq ID N0.2和Seq ID N0.3的擴增產(chǎn)物基本相同(上游和下游引物之間的DNA序列相同)。因此，上述在Seq ID N0.2和SeqID N0.3的5，端或3’端分別增加I~10個堿基并能擴增得到基本相同DNA片段的引物對，均包括在本發(fā)明的引物對中。在本發(fā)明具體的實施方式中，本發(fā)明的引物對優(yōu)選為Seq ID N0.2和Seq ID N0.3所示序列。
[0031]優(yōu)選的PVYOl分子標記開 發(fā)方法如下:
[0032]煙草品種NC55、NC102、K326PVY 和 TN90 為抗 PVY 材料，Cokerl76、云煙 87、中煙100、紅花大金元和K326為感PVY材料，公眾可從云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院獲得。本發(fā)明將抗PVY的父本NC55和感PVY的母本Cokerl76的純合子雜交，獲得Fl代，再以Fl代自交產(chǎn)生F2代群體，共101個單株。[0033]pCR-Bluntll-TOPO 載體、農(nóng)桿菌 GV3101 購自 Invitrogen 公司。質粒 DNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA片段純化試劑盒購自QIAGEN公司。大腸桿菌(Escherichia coli) JM109 ；;反轉錄試劑盒、5’ 端 RACE 試劑盒、DNA Marker、Taq DNA 聚合酶、T4DNA聚合酶及T4DNA連接酶均購自大連寶生物公司。RNA提取試劑盒Trizol購自Invitrogen公司。其他化學試劑均為市售產(chǎn)品。
[0034]據(jù)文獻報道番茄和辣椒中eIF4E家族基因與PVY抗性相關，煙草與辣椒/番茄同屬茄科作物，因此我們推測煙草中的eIF4E基因也與PVY抗性相關。根據(jù)已發(fā)表文獻、Genbank數(shù)據(jù)庫的綜合分析，初步獲得煙草eIF4E家族7個基因成員的編碼序列，并進行系統(tǒng)進化分析。根據(jù)保守序列設計簡并引物，正向引物DegenerateP_F:5’-TGGACWTTYTGGTWYGATAA-3’，反向引物 DegenerateP_R:5’ -TCCTTCCAYTKYYTACCAATGC-3’。以 NC55 (染色體未知片段缺失賦予PVY抗性)和中煙100 (感PVY材料)的cDNA作為模板擴增eIF4E家族基因。結果表明，eIF4E-l基因的轉錄本僅在中煙100樣本中出現(xiàn)，這表明eIF4E_l基因可能與PVY抗性有關。由于eIF4E基因家族的成員較多，直接利用eIF4E-l基因的編碼區(qū)序列，不能設計特異擴增eIF4E-l的片段。本發(fā)明根據(jù)eIF4E-l基因的部分序列，通過5’端RACE獲得eIF4E_l基因起始密碼子上游的序列，包含本發(fā)明的分子標記(Seq ID N0.1)。根據(jù)eIF4E_l的基因組序列和eIF4E家族成員的序列，設計特異引物CF2GR11，檢測已知抗性的煙草材料的基因組DNA，驗證抗性是否與本發(fā)明的分子標記(Seq ID N0.1)有無吻合。結果表明:感病品種K326、云煙87和紅花大金元的eIF4E-l目標片段檢測為陽性，而抗病品種NC102、NC55、K326PVY的eIF4E_l目標片段檢測為陰性。6個品種對PVY的抗性與CF2GR11的PCR檢測結果吻合。因此，將CF2GR11特異擴增的eIF4E-l基因片段作為獲選分子標記，用于在抗性分離群體中驗證。
[0035]利用CF2GR11的引物對，對F2群體的101個單株進行PCR檢測和PVY抗性鑒定，得到基因型分型數(shù)據(jù)和PVY抗性數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析后，用Map Makerf.0軟件進行遺傳圖譜繪制，得到本發(fā)明所述的與PVY隱性抗病基因緊密連鎖的分子標記與抗性的遺傳距離。利用引物對進行抗PVY煙草育種輔助選擇和抗PVY煙草種質篩選。
[0036]下面通過具體實驗例并結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。以下實施例僅僅對本發(fā)明進行進一步的說明，不應理解為對本發(fā)明的限制。
[0037]實施例1:分子標記的制備
[0038]一、煙草RNA提取:
[0039](I)取IOOmg幼嫩葉片放入用DEPC水處理過的研缽；
[0040](2)加入1ml Trizol研磨成均漿，轉移至DEPC水處理過的EP離心管中，室溫靜置5min ；
[0041](3)加入0.2ml氯仿(三氯甲烷)，振蕩15sec，靜置3min ;
[0042](4) 12000rcf，4°C，離心 15min ；
[0043](5)轉移上清液(最多400ul)至新的EP管；
[0044](6)向上清液中加入0.5ml異丙醇，靜置IOmin ；
[0045](7) 12000rcf，4°C，離心 IOmin ；
[0046](8)棄異丙醇，用移液槍將殘余的異丙醇吸出丟棄，加入lml75%的乙醇清洗底部殘留物；[0047](9) 7500rcf，4°C，離心 2min ;
[0048](10)棄乙醇，用移液槍將殘余的乙醇吸出丟棄，室溫干燥2_3min ；
[0049](11)加入30ul DEPC H2O溶解沉淀塊，若不易溶解則放入55°C水浴鍋中水浴IOmin ；
[0050](12) _20°C短期保存，-80°C長期保存待用。
[0051]二、cDNA第一鏈的合成
[0052]使用Reverse Transcriptase M-MLV (Takara)進行模板 cDNA 的合成，取植物總 RNA 約 0.1 μ g-5 μ g, oligo (dT) 1550ng, IOmM dNTP mixl μ 1，用 DEPC 處理水補足至10 μ 1，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65°C加熱5min，冰浴lOmin，加入反應混合物 9μ I (5 Xreaction buf f er4 μ l,25mM MgC124y 1,0.1M DTT2 μ I，RNA 酶抑制劑 I μ 1)，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫2min，加入I μ I M-MLV ReverseTranscriptase,將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底,25°C保溫20min,然后42°C保溫70min，cDNA的合成完成，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0053]三、DNA提取
[0054]用常規(guī)CTAB法分別提取煙草基因組DNA，方法為:(1)稱取煙草葉片IOOmg左右置于1.5mL離心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末狀；(2)加入900 μ I預熱到65°C的2XCTAB 緩沖液(Tris-HCl pH7.5IOOmM, EDTA20mM, NaCl1.4M, CTAB2%)，65°C度水浴 20 分鐘后取出冷卻；(3)加入200 μ I氯仿一異戊醇混合液(24:1)搖勻，4°C離心10min (7200rpm)后轉移上清至1.5mL EP管；(4)再次加入200 μ I氯仿一異戊醇混合液(24:1)搖勻，4°C離心IOmin (7200rpm);(5)取出上清置于新的EP管中，加入1/10體積3M pH5.2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4°C離心20min (12000rpm) ； (6)棄上清，用75 %乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖液融解，放置一 20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0055]四、PCR擴增
[0056]PCR反應體系如下:總體積為20yL，其中50ng/yL DNA樣品2.5 μ L、10XPCRbuffer2.0μ L，dNTPsl.2μ L，引物對(Seq ID N0.2 和 Seq ID N0.3)各 1.5 μ L，Ex-Taq DNA酶0.3 μ L，ddH2012.6 μ L。所用試劑購自寶生物公司。
[0057]PCR反應程序如下:94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸60秒，運行35個循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。PCR擴增產(chǎn)物可以在4°C保存。
[0058]五、分子標記獲得
[0059]在Genbank中搜索獲得eIF4E基因家族成員的保守序列，根據(jù)煙草eIF4E基因家族成員的保守序列設計簡并引物，正向引物DegenerateP_F:5’ -TGGACWTTYTGGTWYGATAA-3’，反向引物 DegenerateP_R:5’ -TCCTTCCAYTKYYTACCAATGC-3’。以 NC55 (染色體未知片段缺失賦予PVY抗性)和中煙100 (感PVY材料)的cDNA作為模板擴增eIF4E家族基因。將擴增獲得約420bp的片段割膠回收，克隆到pMD18-T載體中，獲得重組載體。將該重組載體轉化到大腸桿菌JM109中。來源于NC55和中煙100的cDNA樣品，分別挑選陽性單克隆50個，培養(yǎng)獲得重組細胞。從重組細胞中提取質粒，米用M13通用引物(序列/[目息參考TaKaRa商品目錄)對克隆片段進行測序，將所得序列在Genbank中進行BLAST比對。結果顯示，eIF4E_l基因的轉錄本僅在感PVY的中煙100樣本中出現(xiàn)，eIF4E-l基因的轉錄本抗PVY的NC55樣本中缺失(表1)，這表明eIF4E-l基因可能與PVY抗性有關。[0060]表1抗感PVY煙草材料的eIF4E家族基因的轉錄本檢測
【權利要求】
1.一種鑒定煙草PVY抗性的分子標記，其特征在于:所述分子標記為Seq ID N0.1所示序列。
2.一種鑒定煙草PVY抗性的分子標記的制備方法，其特征在于:用感PVY的煙草的基因組DNA作為模板，以引物對進行PCR擴增，得到446bp擴增產(chǎn)物，將PCR擴增產(chǎn)物進行純化和測序即為所述分子標記； 所述引物對的引物1為Seq ID N0.2所示序列，引物2為Seq ID N0.3所示序列；
Seq ID N0.2: 5’ -TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT -3’ ；
Seq ID N0.3: 5 ’-GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT-3 ’。
3.根據(jù)權利要求1所述的鑒定煙草PVY抗性的分子標記在煙草育種輔助選擇或者煙草種質PVY抗性鑒定中的用途。
4.根據(jù)權利要求2所述的鑒定煙草PVY抗性的分子標記引物對在煙草育種輔助選擇或者煙草種質PVY抗性鑒定中的用途。
5.一種鑒定煙草PVY抗性的分子標記的檢測方法，其特征在于步驟為:根據(jù)Seq IDN0.1分子標記的核苷酸序列設計引物，以被檢測煙草基因組DNA為模板進行擴增，并判斷擴增產(chǎn)物中是否存在該分子標記。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898228SQ201410150470
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權日:2014年4月15日
【發(fā)明者】劉勇, 王丙武, 宋中邦, 高玉龍, 李文正, 謝賀, 楊大海, 陳學軍, 肖炳光 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院