一種赤水金釵石斛原生質(zhì)體分離、純化方法及專用試劑的制作方法
【專利摘要】一種赤水金釵石斛原生質(zhì)體分離、純化方法及專用試劑。包括試劑A和試劑B。試劑A由MES、KCl、Mannitol、CellulaseR10、PectolyaseY-23、BSA、CaCl2和ddH2O組成，試劑B（10ml）由MES、KCl、Mannitol、BSA、CaCl2、ddH2O按比組成。用該試劑制備原生質(zhì)體：1）在搖床上用溶液A黑暗處理金釵石斛葉片碎片4h左右即可釋放出葉片中的原生質(zhì)體；2）將1）獲得的原生質(zhì)體溶液過(guò)200目的細(xì)胞篩過(guò)濾，收集濾液離心3min，用溶液B溶解沉淀物，反復(fù)離心純化原生質(zhì)體；3）用FDA對(duì)所純化的原生質(zhì)體進(jìn)行活力檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】一種赤水金釵石斛原生質(zhì)體分離、純化方法及專用試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及用赤水金釵石斛的組培苗葉片獲取原生質(zhì)體的分離與純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金釵石斛(ife/7￡/rc^iwffl/7c^i7i?Lindl.)在治療白內(nèi)障、益胃生津、抗腫瘤、抗衰老、治療心血管疾病、提高機(jī)體免疫功能、抗疲勞等方面具有顯著功效，在國(guó)內(nèi)外具有廣闊的市場(chǎng)，同時(shí)已成為世界各國(guó)防病、治病和醫(yī)療保健的極品良藥。貴州赤水的金釵石斛多個(gè)地方品系中多糖、生物堿、菲類及聯(lián)芐類等藥用指標(biāo)性成分較其它地方高，藥用價(jià)值也更大，并在2006年3月被國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局批準(zhǔn)進(jìn)行地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)，從而成為貴州省第一個(gè)獲得原產(chǎn)地域產(chǎn)品保護(hù)的中藥材產(chǎn)品，也是先獲得《國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)》的石斛種。通過(guò)細(xì)胞工程方法對(duì)金釵石斛進(jìn)行遺傳改良具有重要的研究?jī)r(jià)值和市場(chǎng)潛力。
[0003]植物原生質(zhì)體是指除去了全部細(xì)胞壁后質(zhì)膜包裹的細(xì)胞，是開(kāi)展基礎(chǔ)研究的理想材料。分離純化的原生質(zhì)體，可以用于開(kāi)展植物細(xì)胞信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換、細(xì)胞壁合成機(jī)理、膜的結(jié)構(gòu)與功能、核質(zhì)關(guān)系、突變體誘導(dǎo)、雜交或自交不親和的機(jī)理、細(xì)胞間的相互作用、植物激素的作用機(jī)理、分離各種細(xì)胞器、引入細(xì)胞器、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入外源基因、生物反應(yīng)器構(gòu)建等方面的研究。
[0004]本發(fā)明首先搜集了多個(gè)金釵石斛的種質(zhì)資源，進(jìn)行評(píng)價(jià)后，用源自赤水的金釵石斛種源的種子為外植體，通過(guò)植物組培技術(shù)進(jìn)行種子萌發(fā)、原球莖誘導(dǎo)和組培再生苗培養(yǎng)，系統(tǒng)建立了赤水金釵石斛 的植物組培快繁技術(shù)體系，進(jìn)一步以組培再生苗的葉片為材料，用酶解法得到原生質(zhì)體，純化后獲得了純度高、活力強(qiáng)的原生質(zhì)體，為赤水金釵石斛的種質(zhì)資源拓展、商業(yè)化遺傳育種、基因改良等后續(xù)研究奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單易行獲取貴州赤水金釵石斛純度高、活力強(qiáng)、密度大的原生質(zhì)體的方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明包括赤水金釵石斛原生質(zhì)體的分離與純化兩個(gè)步驟，涵蓋原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體產(chǎn)量的測(cè)定、原生質(zhì)體活力的鑒定等四方面內(nèi)容。具體內(nèi)容如下:
1、原生質(zhì)體的分離:取金釵石斛無(wú)菌再生苗或野生植株，選取大而飽滿的葉片，在超凈工作臺(tái)中將其橫向切割為1_左右的片段，放入小培養(yǎng)皿中，將溶液A倒入培養(yǎng)皿里，用鑷子將所取材料在溶液A中反復(fù)浸蘸多次，目的使材料與溶液A充分接觸，使酶解效果更充分，據(jù)材料的多少來(lái)決定溶液A的使用量，以溶液A剛好淹沒(méi)葉片小段為宜，然后用封口膠封口，置于恒溫?fù)u床上震蕩，26-28°C、60rpm、黑暗處理4h。當(dāng)原生質(zhì)體從材料上充分分離下來(lái)后(4 h左右)，即終止酶解。用吸頭輕輕吹打葉片，以釋放出全部原生質(zhì)體。
[0007]所述培養(yǎng)皿為直徑60 mm、高15 mm玻璃培養(yǎng)皿。[0008]所述專用試劑溶液A成分如表1。
【權(quán)利要求】
1.一種赤水金釵石斛原生質(zhì)體分離與純化方法及專用試劑，其特征在于:赤水金釵石斛原生質(zhì)體的分離與純化兩個(gè)步驟，涵蓋原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體產(chǎn)量的測(cè)定、原生質(zhì)體活力的鑒定四方面內(nèi)容；方法如下: 1)、原生質(zhì)體的分離:取金釵石斛無(wú)菌再生苗或野生植株，選取大而飽滿的葉片，在超凈工作臺(tái)中將其橫向切割為1_左右的片段，放入小培養(yǎng)皿中，將溶液A倒入培養(yǎng)皿里，用鑷子將所取材料在溶液A中反復(fù)浸蘸多次，使材料與溶液A充分接觸，使酶解效果更充分，據(jù)材料的多少來(lái)決定溶液A的使用量，以溶液A剛好淹沒(méi)葉片小段為宜，然后用封口膠封口，置于恒溫?fù)u床上震蕩，26-28°C、60rpm、黑暗處理4h ;當(dāng)原生質(zhì)體從材料上充分分離下來(lái)后，即終止酶解，用吸頭輕輕吹打葉片，以釋放出全部原生質(zhì)體； 所述專用試劑溶液A成分為表1 ; 表1溶液A成分及含量以10 ml為例:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赤水金釵石斛原生質(zhì)體分離與純化方法及專用試劑，其特征在于:所述的專用試劑由試劑溶液A與試劑溶液B先后配合使用，所列成分及配比不只僅局限于赤水金釵石斛原生質(zhì)體分離與純化，也適用于其他種的石斛原生質(zhì)體分離與純化。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK103881960SQ201410153412
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】徐德林, 錢剛, 蔡振鋒, 楊璐萍, 張 林, 儲(chǔ)士潤(rùn) 申請(qǐng)人:遵義醫(yī)學(xué)院