與植物生物量相關(guān)的miRNA及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了與植物生物量相關(guān)的miRNA及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用。該與植物生物量相關(guān)的miRNA的核苷酸序列是SEQ?ID?No.1。該與植物生物量相關(guān)的miRNA及其相關(guān)生物材料可用于調(diào)控目的植物的生物量（如單株葉重和/或單株葉數(shù)和/或葉片面積）。
【專利說明】與植物生物量相關(guān)的mi RNA及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及與植物生物量相關(guān)的miRNA及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.),十字花科(Brassicaceae)鼠耳芥屬(Arabidopsis)擬南芥(A.thaliana)，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。擬南芥由于具有以下的特點而成為研究有花植物的遺傳、細(xì)胞、發(fā)育、分子生物學(xué)研究的模式植物:
[0003]一、擬南芥的優(yōu)點是植株小、每代時間短(兩個月一個世代)、結(jié)子多、生活力強。二、擬南芥的基因組是開花植物中相對較小的。每個單倍染色體組(n=5)的總長只有7000萬個堿基對，即只有小麥染色體組長的1/80，其整個基因組已于2000年由國際擬南芥菜基因組合作聯(lián)盟聯(lián)合完成，也是第一個被順序分析的植物基因組。
[0004]三、擬南芥是自花受粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。近十年來，植物科學(xué)家們利用擬南芥模式系統(tǒng)，對植物不同組織和器官的發(fā)育開展了類似的研究。通過大量擬南芥突變體的分析，科學(xué)家們對植物根、莖、葉、花、胚胎和種子的發(fā)育，對植物抗病性和抗逆性機理，以及對各種生命活動有關(guān)的激素、光和環(huán)境因子引起的信號傳導(dǎo)過程等進行了深入的研究，極大豐富了人類對于植物生命活動內(nèi)在機理的認(rèn)識。
[0005]微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在真核生物中廣泛存在的、長度為21~24nt、具有調(diào)控作用的一類小分子RNA。大多數(shù)植物的miRNA基因位于基因間區(qū)(intergenicregion)以單順反子形式轉(zhuǎn)錄(Brown, J ff.1ntronic noncoding RNAs and splicing.Trends Plant Sci, 2008.13(7):p.335-42.)。大部分miRNA基因產(chǎn)物的幾個共同特征表明植物miRNA基因在RNA 聚合酶II (RNA polymerase II)的指導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄出pri_miRNA,即初級前體。緊接著初級前體在核內(nèi)被RNase III Dicer-likel (DCLl)兩次連續(xù)加工，從而產(chǎn)生miRNA/miRNA*雙鏈。miRNA/miRNA*雙鏈在細(xì)胞核中被HEN蛋白甲基化后，被轉(zhuǎn)運出細(xì)胞核進入細(xì)胞質(zhì)中。成熟的miRNA從miRNA/miRNA*雙鏈中分離出來，選擇性地與核酸酶復(fù)合物結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC),從而發(fā)揮功能。目前已知的植物miRNA對其靶標(biāo)基因的調(diào)控方式有三種:剪切、翻譯抑制和轉(zhuǎn)錄沉默。在植物中miRNA介導(dǎo)的靶基因剪切是其主要的作用形式，一般來講miRNA對完全互補或接近完全互補的mRNA序列進行切割。目前已經(jīng)確認(rèn)的miRNA的靶標(biāo)基因大部分為各種調(diào)控植物生長發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子。miRNA除了位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，還可以將蛋白水解、代謝、離子運輸以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的多種mRNA作為祀標(biāo)(Benjamin H, Ribo-gnome: the big worldof small RNAs.Science, 2005.309(5740):p.1519-24.89.；Guo, H.S.MicroRNA directsmRNA cleavage of the transcription factor NAClto downregulate auxin signals forarabidopsis lateral root development.Plant Cell, 2005.17 (5):p.1376-86.),這顯不了此類小分子RNA具有重要的生物學(xué)意義。
[0006]在植物中，各種miRNA的表達水平是不同的。這不僅與miRNA基因上游的啟動子的啟動效率有關(guān)，也與miRNA基因表達的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被DCL蛋白剪切的效率有關(guān)。于是為了研究低水平表達的miRNA，利用高表達水平miRNA的前體骨架構(gòu)建高表達的人工miRNA成為一種有效的方法。在植物中利用經(jīng)過改造的miRNA前體骨架(Pre-miRNA backbone)表達人工miRNA已有成功報道，并被應(yīng)用與內(nèi)源基因的調(diào)控及植物抗病毒研究，如Schwab (2006)等以MIR319a和MIR172a為前體表達的amiRNA能有小下調(diào)擬南芥內(nèi)源基因的表達(RebeccaS.Highly specific gene silencing by artificial mircoRNAs in Arabidopsis.plant cell, 2006，18:pll21-33)，Duan (2008)等利用 MIR159a 的前體表達針對 CMV 基因組 RNA3’ UTR 的人工 miRNA,獲得了 對 CMV 較高的抗性(Cheng-Guo Duan.ArtificialMicroRNAs Highly Accessible to Targets Confer Efficient Virus Resistance inPlants.Journal of Virology, 2008，82:pi1084-95)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種與植物生物量相關(guān)的miRNA及其關(guān)生物材料與應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所提供的miRNA，名稱為miR847，其核苷酸序列是SEQ ID N0.1。其中，SEQID N0.1由21個核苷酸組成。[0009]miR847的編碼基因(miR847基因)也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0010]可產(chǎn)生miR847的短發(fā)夾RNA (shRNA, short hairpin RNA)也屬于本發(fā)明的保護范圍。該短發(fā)夾RNA是形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾RNA，其中所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的一條鏈序列是SEQ ID N0.1，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的另一條鏈序列與SEQ ID N0.1反向互補。
[0011]所述短發(fā)夾RNA的核苷酸序列具體可為Al)或A2):
[0012]Al)將SEQ ID N0.2的所有T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA序列；
[0013]A2)對SEQ ID N0.2進行如下改造得到的序列:將SEQ ID N0.2的第1_25位和第208-210位核苷酸均缺失，將SEQ ID N0.2的第26-207位的所有T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA序列。
[0014]其中，SEQ ID N0.2由210個核苷酸組成。
[0015]與miR847相關(guān)的生物材料也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0016]上述與miR847相關(guān)的生物材料，具體可為下述BI)至B4)中的任一種
[0017]BI)含有miR847編碼基因的表達盒；
[0018]B2)含有miR847編碼基因的重組載體、或含有BI)所述表達盒的重組載體；
[0019]B3)含有miR847編碼基因的重組微生物、或含有BI)所述表達盒的重組微生物、或含有B2)所述重組載體的重組微生物；
[0020]B4)含有miR847編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有BI)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
[0021]上述生物材料中，BI)所述的表達盒，是指能夠在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄加工后形成miR847的DNA，該DNA不但可包括啟動miR847基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止miR847基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。可用于本發(fā)明的啟動子包括但不限于:組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動子，和誘導(dǎo)型啟動子。啟動子的例子包括但不限于:花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S;來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子，亮氨酸氨基肽酶(〃LAP〃, Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992);來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，發(fā)病機理相關(guān)I(PRl)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子(PIN2)或LAP啟動子(均可用茉莉酮酸曱酯誘導(dǎo))；熱休克啟動子(美國專利5，187，267);四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子(美國專利5，057, 422);種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子pF128 (CN101063139B (中國專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆 beta conglycin 的啟動子(Beachy 等人(1985)EMBO J.4:3047-3053)) ? 它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于:農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如:Odell 等人(I985)Nature313:810 ；Rosenberg 等 A(1987)Gene, 56:125 ；Guerineau 等人(1991)Mol.Gen.Genet, 262:141;Proudfoot (1991)Cell, 64:671;Sanfacon 等人 GenesDev.，5:141;Mogen 等人(1990)Plant Cell, 2:1261 ;Munroe 等人(1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891 ；Joshi 等人(1987)Nucleic AcidRes., 15:9627)。
[0022]在本發(fā)明的實施例中，BI)所述的表達盒中啟動所述miR847基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為CaMV35S啟動子，終止所述miR847基因轉(zhuǎn)錄的終止子為胭脂堿合成酶基因終止子TNos。
[0023]可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有BI)所述的表達盒的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pCanG、pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂堿合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是 天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0024]上述B2)所述的重組載體具體可為將pCanG的SmaI和SacI位點間的片段替換為SEQ ID N0.2的DNA分子，保持pCanG的其它核苷酸不變得到的重組載體。
[0025]上述生物材料中，B3)所述的重組微生物具體可為酵母，細(xì)菌，藻和真菌。B4)所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系不包括植物的繁殖材料。
[0026]miR847、miR847的編碼基因、上述短發(fā)夾RNA、或上述與miR847的相關(guān)生物材料在調(diào)控植物生物量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0027]上述應(yīng)用中，所述生物量可為下述1-3)中的全部或部分:
[0028]I)葉重；
[0029]2)單株葉數(shù)；
[0030]3)葉片面積。
[0031]上述應(yīng)用中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為十字花科植物，如擬南芥。
[0032]本發(fā)明提供了具體的利用上述與miR847相關(guān)的生物材料提高植物生物量的方法。
[0033]本發(fā)明所提供的培育生物量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入miRNA的編碼基因得到生物量高于所述受體植物的轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述miRNA的核苷酸序列是SEQ ID N0.1。
[0034]上述方法中，所述miRNA的編碼基因可為下述I)或2) DNA分子:
[0035]I)核苷酸序列是SEQ ID N0.2的DNA分子；
[0036]2)編碼序列是SEQ ID N0.2的第187-207位的DNA分子。
[0037]上述方法中，所述受體植物可為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體可為十字花科植物，如擬南芥。
[0038]上述方法中，所述生物量可為下述1-3)中的全部或部分:
[0039]I)單株葉重；
[0040]2)單株葉數(shù)；
[0041]3)葉片面積。
[0042]上述方法中，所述miR847的編碼基因通過含有miR847的編碼基因表達盒導(dǎo)入所述受體植物中。所述表達盒具體可為上述BI)所述的表達盒。
[0043]上述方法中，所述miR847的編碼基因可通過含有miR847的編碼基因的重組載體導(dǎo)入所述受體植物中。該重組載體可為上述B2)所述的重組載體。
[0044]上述方法中，其中所述miR847基因可先進行如下修飾,再導(dǎo)入所述受體植物中，以達到更好的表達效果:
[0045] 3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達；所述啟動子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；
[0046]4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進行連接；
[0047]5)引入增強子序列，如內(nèi)含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來源于TMV, MCMV和AMV )。
[0048]所述重組載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach, 1998, Method for Plant MolecularBiology VIII, Academy Press, New York,pp.411-463;Geiserson and Corey, 1998, PlantMolecular Biology (2nd Edition)。
[0049]上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[0050]本發(fā)明采用生物信息學(xué)預(yù)測、分子克隆技術(shù)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、Northern雜交、5’ RACE等多種生物學(xué)手段，首次高表達了 miR847，證明了與受體植物相比，轉(zhuǎn)入miR847基因的轉(zhuǎn)基因植物的單株葉重、單株葉數(shù)和葉片面積高于受體植物，說明miR847是與植物生物量(如單株葉重和/或單株葉數(shù)和/或葉片面積)相關(guān)的RNA，可用于調(diào)控目的植物的生物量(如單株葉重和/或單株葉數(shù)和/或葉片面積)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1為25天擬南芥野生型以及Tl代擬南芥/pCanG-35S-miR847的葉片圖。野生型代表哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，miR847-3和MiR847_4為Tl代擬南芥/pCanG-35S_miR847株系。
[0052]圖2為Northern雜交檢測野生型以及T2代擬南芥/pCanG-35S_miR847的21天葉片中miR847基因的表達。野生型代表哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，miR847-l、miR847-2、miR847-3 和 MiR847_4 為 T2 代擬南芥 /pCanG-35S_miR847 株系。
[0053]圖3為野生型和T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847株系培養(yǎng)29天時單株葉片數(shù)。Col-O代表哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，miR847-2、miR847-3和MiR847_4為T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847 株系。
[0054]圖4為野生型和T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847株系培養(yǎng)29天時單株蓮座葉鮮重。Col-O代表哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，miR847-2、miR847-3和MiR847_4為T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847 株系。
[0055]圖5為野生型以及T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847株系培養(yǎng)33天時的葉片表型。野生型表示哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，35S-miR847為T2代擬南芥/pCanG-35S_miR847。
【具體實施方式】
[0056]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0057]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0058]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0059]下述實施例中的根癌農(nóng)桿菌EHA105 (Elizabeth E.Hood.NewAgrobacteriumhelper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Research, Julyl993, Volume2, Issue4, pp208_218)公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。[0060]下述實施例中的哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(J6rn Gorlach.A Model for HighThroughput Functional Genomics in Plants.The Plant Cell, July2001vol.13n0.71499-1510)公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0061]下述實施例中的pCanG (Qi Xie, Generation of glyco-engineered BY2celllines with decreased expression of plant-specific glycoepitopes.Protein&Cell.January2011, Volume2, Issuel, pp41_47)公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得,該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0062]實施例1、miR847表達載體的構(gòu)建
[0063]利用CTAB法提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥植株的基因組DNA，利用以下引物以該基因組DNA為模板，進行PCR擴增:上游引物(5’ 一 3’):
[0064]ACAGATCTTGATCTGACGATGGAAGCATCAAGAAGATAAGGGGTGACATGAGTTGAGCAGGGTA (下劃線為miR847序列)下游引物(5，— 3，):
[0065]CAGCATCAAGAAGAAGAGGAGTGAGAAGAGTAAAAGCCATTA (下劃線為 miR847 的反向互補序列)。將PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體(購自TIANGEN公司)上，得到重組載體。利用上述上游引物和PGEM-T載體通用反向引物M13R PCR擴增鑒定正向插入的重組載體并測序，將測序結(jié)果表明含有SEQ ID N0.2所示的DNA分子的重組載體命名為pGEMT-miR847。其中，SEQ ID N0.2由210個核苷酸組成，為miR847編碼基因的核苷酸序列。Bgl II單酶切pGEMT-miR847，失活酶，利用Klenown酶補平粘性末端并失活酶，然后利用SacI酶切，電泳后回收220bp左右的含有miR847基因的片段，與經(jīng)過Smal，SacI雙酶切后回收的pCanG的線性化質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR及酶切和測序鑒定重組載體，將pCanG的SmaI和SacI位點間的片段替換為SEQ ID N0.2的DNA分子，并保持pCanG的其它核苷酸不變得到的重組載體命名為 pCanG-35S-miR847。
[0066]實施例2、擬南芥/pCanG-35S_miR847的獲得
[0067]以哥倫比亞生態(tài)型擬南芥為受體植物，將pCanG-35S_miR847轉(zhuǎn)入哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中，得到miR847表達植株擬南芥/pCanG-35S-miR847。具體方法如下:
[0068](一)擬南芥的轉(zhuǎn)化
[0069]將哥倫比亞生態(tài)型擬南芥幼苗置于16hr光照/Shr黑暗環(huán)境下培養(yǎng)4周，待多數(shù)植株抽薹開花時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。將質(zhì)粒pCanG-35S-miR847轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌株EHA105，挑取單菌落在含卡那霉素的3ml LB培養(yǎng)基中28 V 250rpm震蕩培養(yǎng)過夜，然后將培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)至200mlLB中進行擴大培養(yǎng)。至農(nóng)桿菌液培養(yǎng)至OD6tltl達到2.0左右時，在菌液中加入乙酰丁香酮(AS)，使得終濃度為40 μ Μ，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)2-4h。將農(nóng)桿菌菌液于4000rpm離心30min，棄上清，將菌體懸浮于5%的蔗糖溶液中，調(diào)節(jié)OD6tltl為2.0，加入表面活性劑Silwett L-77，使終濃度為0.05%，混勻。將擬南芥花序浸入農(nóng)桿菌菌液中，輕輕搖動約10s，然后將植物保濕暗培養(yǎng)24hr。將轉(zhuǎn)化過的擬南芥轉(zhuǎn)到正常光照條件下進行培養(yǎng)，每隔一周重復(fù)浸花I次，重復(fù)
2-3次。培養(yǎng)一段時間后收種。
[0070](二)擬南芥/pCanG-35S_miR847的篩選及鑒定
[0071]轉(zhuǎn)化后得到的當(dāng)代轉(zhuǎn)基因種子即為Tl代轉(zhuǎn)基因種子。將種子鋪于含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上后，放置4°C 2到4天后，放于22 °C 16hr光照/8hr黑暗的環(huán)境下培養(yǎng)9天后，挑選出能夠正常萌發(fā)生長的植株即轉(zhuǎn)基因Tl代植株命名為擬南芥/pCanG-35S-miR847植株，轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土中培養(yǎng)25天并進行觀察。通過觀察發(fā)現(xiàn)，Tl代擬南芥/pCanG-35S-miR847植株中，85.7% (54株/63株)出現(xiàn)有葉重增加、單株葉數(shù)增多、葉片面積增大的表型(如圖1)。Tl代擬南芥/pCanG-35S-miR847植株收獲種子后，挑選4個葉重增加、單株葉數(shù)增多、葉片面積增大的T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847株系(名稱為miR847_4、miR847_3、miR847-2、miR847_l )，播種到含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進行篩選后，轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土中分別培養(yǎng)21天，29天、33天。培養(yǎng)21天時分別收集葉片，利用Trizol試劑提取葉片總RNA進行Northern blotting檢測RNA中的miR847的表達量；培養(yǎng)29天時統(tǒng)計各株系的葉片數(shù)和蓮座葉鮮重；培養(yǎng)33天時觀察葉片表型。以哥倫比亞生態(tài)型擬南芥作為對照，進行相同實驗。
[0072](三)Northernblotting 檢測 RNA 中的 miR847 的表達量
[0073]Trizol試劑法提取植物組織RNA，方法如下:
[0074](I)將待檢測植株葉片在研缽中用液氮研磨成粉末，每50~IOOmg組織加入1mlTrizol，于離心管中勻漿至完全裂解；室溫放置5min。[0075](2)在裝有裂解物的離心管中加入0.2倍體積的氯仿(1ml Trizol加入0.2ml氯仿)，用振蕩器充分振蕩混勻30秒，室溫放置2~3min。
[0076](3)4°C，14000rpm，離心10min，吸取上層水相至一新的離心管中，每毫升RNAVzoI可吸取約0.6~0.75ml ο
[0077](4)按(3)中水相的體積加入等體積的異丙醇，顛倒數(shù)次，混勻，室溫沉淀lOmin。
[0078](5)4°C，l，4000rpm，離心10min，在管底可見RNA沉淀。棄上清，每毫升最初的RNAVzoI加入lml75%乙醇，輕輕顛倒混勻，以清洗RNA沉淀。棄去液體，小心勿丟棄RNA沉淀。室溫倒置晾干(5~IOmin)。
[0079](6)加入適量的50%去離子甲酰胺溶解RNA沉淀，存放于_80°C備用。
[0080]提取RNA后，以小核仁RNA U6為內(nèi)參,利用Northern blotting來檢測RNA中的miR847的表達量。方法如下:
[0081](I)制備探針
[0082]檢測miR847 的探針序列:5’ -CATCAAGAAGAAGAGGAGTGA-3’，
[0083]檢測U6 的探針序列:5’ CTCGATTTATGCGTGTCATCCTTGC3’。
[0084]米用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)對上述序列末端磷酸基團進行同位素(Y-32P ATP)標(biāo)記,得到用于Northern雜交的探針。
[0085](2) miRNA Northern 雜交
[0086]a.取30ug溶于50%去離子甲酰胺上述提取的擬南芥RNA樣品，100°C變性5min，冰上放置5min。變性后的RNA樣品中加入IOX加樣緩沖液(50%甘油，IOmmoI/L EDTA, 0.25%溴酚藍(lán)，0.25% 二甲基苯腈藍(lán)乙酸)，快速混勻，上樣。
[0087]b.RNA樣品用17%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后用電轉(zhuǎn)移裝置(BIO-RAD)轉(zhuǎn)移到 HybondN+ 尼龍膜(Amersham Biosciences)上。
[0088]c.轉(zhuǎn)移有RNA樣品的尼龍膜紫外交聯(lián)5min，使RNA固定在尼龍膜上。
[0089]d.配制用于LNA修飾的寡核苷酸探針雜交液，將雜交緩沖液放入雜交管中，37°C預(yù)熱15min，將膜放進雜交管中，37°C預(yù)雜I~2小時。然后將標(biāo)記好的探針放入雜交管中，37 °C雜交過夜。
[0090]e.雜交結(jié)束后，小心倒出雜交液，用洗膜緩沖液2XSSC/0.2%SDS，37°C /15~20min條件下，洗膜2次，檢測信號強弱，若信號仍很強可再用0.2XSSC/0.2%SDS洗10~20mino
[0091 ] f.將洗好的膜從雜交管中拿出，轉(zhuǎn)移至兩層塑料膜中，檢測雜交信號強弱。將膜放入磷屏(GE Healthcare)中壓過夜后,用磷屏成像系統(tǒng)(GE Healthcare)檢測磷屏信號強度。
[0092]Northern blotting結(jié)果如圖2所示，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(受體植物)中無miR847 的雜交信號。而 miR847_4、miR847_3、miR847_2、miR847_l 這四個 T2 代擬南芥 /pCanG-35S-miR847株系都有較強的miR847信號。
[0093]T2 代擬南芥 /pCanG-35S-miR847 株系(miR847_2、miR847_3 和 MiR847_4)和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥培養(yǎng)29天的單株葉片數(shù)統(tǒng)計結(jié)果如圖3，單株蓮座葉鮮重統(tǒng)計結(jié)果如圖
4。結(jié)果表明，miR847-2、miR847_3和MiR847_4的單株平均葉片數(shù)是哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的1.5倍、1.46倍和1.57倍;miR847-2、miR847_3和MiR847_4的單株平均單株蓮座葉鮮重是哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的2.04倍、1.86倍和1.75倍。圖3中，miR847_2共13株、miR847-3共13株、MiR847_4共14株，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥共13株。圖4中，miR847_2共8株、miR847-3共8株、MiR847_4共9株，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥共7株。
[0094]T2代擬南芥/pCanG-35S_miR847株系和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥培養(yǎng)33天的葉片表型如圖5所示，T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847株系的第8、9、10片葉片面積明顯大于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。圖5中，從左至右依次為第2、3、4、5、6、7、8、9、10……片葉，這個等差數(shù)列的公差為I。
[0095] 可見轉(zhuǎn)入miR847基因的轉(zhuǎn)基因植物的單株葉重、單株葉數(shù)和葉片面積高于受體植物，說明miR847是與植物生物量(如單株葉重和/或單株葉數(shù)和/或葉片面積)相關(guān)的RNA，可用于調(diào)控目的植物的生物量(如單株葉重和/或單株葉數(shù)和/或葉片面積)。
【權(quán)利要求】
1.培育生物量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入miRNA的編碼基因得到生物量高于所述受體植物的轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述miRNA的核苷酸序列是SEQ IDN0.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述miRNA的編碼基因為下述I)或2)的DNA分子: 1)核苷酸序列是SEQID N0.2的DNA分子； 2)編碼序列是SEQID N0.2的第187-207位的DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述生物量為下述1-3)中的全部或部分: 1)單株葉重； 2)單株葉數(shù)； 3)葉片面積。
4.miRNA，其特征在于:所述miRNA的核苷酸序列是SEQ ID N0.1。
5.權(quán)利要求4所述的miRNA的編碼基因，為下述I)或2)的DNA分子: 1)核苷酸序列是SEQ ID N0.2的DNA分子； 2)編碼序列是SEQID N0.2的第187-207位的DNA分子。
6.形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾RNA，其特征在于:所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的一條鏈序列是SEQID N0.1，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的另一條鏈序列與SEQ ID N0.1反向互補。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的短發(fā)夾RNA，其特征在于:所述短發(fā)夾RNA的核苷酸序列是Al)或 A2): Al)將SEQ ID N0.2的所有T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA序列； A2)對SEQ ID N0.2進行如下改造得到的序列:將SEQ ID N0.2的第1_25位和第208-210位核苷酸均缺失，將SEQ ID N0.2的第26-207位的所有T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA序列。
8.與權(quán)利要求4所述的miRNA相關(guān)的生物材料，為下述BI)至B4)中的任一種: BI)含有權(quán)利要求5所述編碼基因的表達盒； B2)含有權(quán)利要求5所述編碼基因的重組載體、或含有BI)所述表達盒的重組載體；B3)含有權(quán)利要求5所述編碼基因的重組微生物、或含有BI)所述表達盒的重組微生物、或含有B2)所述重組載體的重組微生物； B4)含有權(quán)利要求5所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有BI)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
9.權(quán)利要求4所述的miRNA、權(quán)利要求5所述的編碼基因、權(quán)利要求6或7所述的短發(fā)夾RNA、或權(quán)利要求8所述的相關(guān)生物材料在調(diào)控植物生物量中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述生物量為下述1-3)中的全部或部分: 1)單株葉重； 2)單株葉數(shù)； 3)葉片面積。
【文檔編號】C12N15/113GK103937832SQ201410157643
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】郭惠珊, 汪晶晶 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所